מגנטי תא לפעיל על-מיון אסטרטגיות כדי לבודד ולטהר Synovial נגזר הנוזלים בתאי גזע Mesenchymal ממודל ארנב

Zhaofeng Jia; Yujie Liang; Xingfu Li; Xiao Xu; Jianyi Xiong; Daping Wang; Li Duan

doi:10.3791/57466

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

מאמר זה מציג פרוטוקול כלכלי ופשוט עבור בידוד ישיר וטיהור של גזע mesenchymal של ניו זילנד הארנב הלבן synovial נוזל.

Abstract

גזע mesenchymal (MSCs) הם המקור העיקרי תא לטיפול מבוססת-תא. MSCs מן נוזל במפרק synovial יכול לשמש באופן פוטנציאלי הנדסת רקמות הסחוס. MSCs מ synovial נוזל (SF-MSCs) היה נחשב מבטיח מועמדים התחדשות מפרקיות, התועלת הטיפולית הפוטנציאלית שלהם גרמה להם נושא מחקר חשוב של המנוח. SF-MSCs מ חלל הברך של הארנב ניו זילנד הלבן יכול להיות מועסק כמודל translational ממוטבת כדי להעריך רפואה רגנרטיבית אנושי. באמצעות מבוססי CD90 מגנטי הופעל תא מיון טכנולוגיות (מקינטוש), פרוטוקול זה בהצלחה משיג ארנב SF-MSCs (rbSF-MSCs) ממודל זה ארנב ועל בהמשך מדגים באופן מלא על פנוטיפ MSC של תאים אלה על ידי גרימת אותם כדי להבדיל את תאי העצם, adipocytes ו- chondrocytes. לכן, ניתן ליישם גישה זו מחקר ביולוגיה של התא, הנדסת רקמות בעזרת ציוד פשוט ונהלים.

Introduction

MSCs שהוצעו מקור רב ערך עבור רפואה רגנרטיבית, במיוחד עבור סחוס נגעים. MSCs, כולל chondrocytes, תאי העצם, adipocytes, השלד של תאי שריר, תאי סטרומה מהבטן, בהרחבה להרחיב את אזורי עבור השתלת תא גזע עקב שלהם הרחבה גבוהה קצב ואת שושלת היוחסין מרובה בידול פוטנציאליים¹. MSCs ניתן לבודד השלד שריר, synovium, מח עצם, רקמת שומן²^,³^,⁴. הממצאים יש גם conﬁrmed את הנוכחות של MSCs בנוזל synovial, מחקרים קודמים זיהתה MSCs נגזר נוזל synovial (SF-MSCs) מבטיח מועמדים התחדשות מפרקיות⁵^,⁶.

עם זאת, מחקר וניסוי פרה על דגימות האנושי כפופים סוגיות אתיות רבות. במקום זאת, ארנבים, ממשיכים להיות הכי נפוץ מיני בעלי חיים כדי להדגים כי השתלת של MSCs ניתן לתקן נזק לסחוס. בשנים האחרונות, מספר גדל והולך של חוקרים חקרו ארנב בתאי גזע mesenchymal (rbMSCs) בשני במבחנה , ויוו, כמו תאים אלה הם MSCs דומה האדם בפיזיולוגיה ביולוגיה ורקמות הסלולר שלהם. באופן דומה, rbMSCs מסוגלים הקפדה על משטחי פלסטיק, הצגת ציר-פיברובלסט מורפולוגיה כמו MSCs אנושי. יתרה מזו, דגימות mesenchymal הארנב הם פשוט וקל לקבל⁷. בנוסף, הנקודות המכריעים הם rbMSCs אקספרס סמני פני השטח, כגון CD44, CD90, CD105, ו הבידול השושלת מרובה פוטנציאליים נשמר, שהוא מסכים עם הקריטריונים לזיהוי של אוכלוסיות MSC כמו מוגדרת על ידי האגודה הבינלאומית הסלולר⁸^,⁹. בפרט, chondroprogenitors נוזלים synovial מסוגלים chondrogenesis שאינם היפרטרופית כאשר שנגזרות TGF-β1, ובכך הופך אותם מקורות תא מתאים עבור¹⁰^,התחדשות הסחוס במפרק phenotypically¹¹^, ¹².

עם זאת, בידודו של SF-MSCs שונה במידה רבה רקמות אחרות, כולל את חבל הטבור, רקמת שומן, דם היקפיים ו מח עצם. כיום, הגישות הנפוצות הטיהור ומיון של SF-MSCs הם cytometry זרימה ומיון immunomagnetic מבוסס-חרוז, למרות השיטה cytometry זרימה דורש סביבה ספציפיים עם מכשירים יקרים מאוד¹³.

מאמר זה מציג שגרה עבור האוסף פשוטה ולא פולשנית של דוגמיות של נוזל synovial מניו זילנד וארנבים לבנים. במהלך ההליך, rbSF-MSCs stably המורחב במבחנה , ואז מבודדים CD90 נהלים חיובי מבוסס-חרוז מגנטי. לבסוף, הפרוטוקול מראה כיצד להשיג MSCs עם טוהר גבוהה, הכדאיות מן המקורות תא שנקטפו.

ב פרוטוקול זה, מבודד rbSF-MSCs מאופיינים בהתבסס על המורפולוגיה שלהם, ביטוי של סמנים ספציפי, pluripotency של תאי גזע. Immunophenotyping מבוססי cytometry זרימה מגלה ביטוי חיובי משמעותי של CD44 ו- CD105, ואילו הביטוי של CD45 ו- CD34 הוא שלילי. לבסוף, וזמינותו במבחנה עבור rbSF-MSCs מדגים את הבידול osteogenic, adipogenic ו- chondrogenic של תאים אלה.

Protocol

כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות ועדת האתיקה אזוריות ולאחר כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על-ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ו שימוש הוועדה של שנג'ן השני של אנשים החולים, אוניברסיטת שנג'ן.

1. לבודד, תרבות rbSF-MSCs

ההכנות לקראת ההליך בעלי חיים
1. להתכונן לבגרות skeletally הנשי ניו זילנד וארנבים לבנים האוסף של rbSF-MSCs. לבצע בדיקה קלינית של הארנבים יום אחד לפני ההליך arthrocentesis והרדמה.
  הערה: בדיקות גופניות צריך לכלול משקל (2.0-2.5 ק"ג), מגדר (נקבה), ואת טמפרטורת הגוף, קצב נשימה, קצב הלב. פרמטר מרווחי לארנבים קלינית בריא הם 30-50 דקות עבור קצב נשימה, 220-280 דקות עבור קצב הלב, 38-39 מעלות צלזיוס על טמפרטורת הגוף.
2. מהר החיות במשך 6 שעות לפני ההרדמה.
ההכנות וההליך לקבלת ההרדמה בעלי חיים
1. לרסן את הארנב. כלוב (ראה טבלה של חומרים), ואת להזריק 3% סודיום פנטוברביטל לווריד אוזן שולי במינון של 1 מ"ל/ק"ג על הרדמה כללית.
2. הצב את הארנב בתנוחה הגבי-שכיבה נוחה.
3. לנטר את קצב הנשימה, קצב הלב, טמפרטורת הגוף של הארנב במהלך הרדמה.
4. השתמש משחה ophthalmologic את עיניו כדי למנוע יובש במהלך הרדמה.
5. להעריך את עומק מההרדמה שאחרי הסיווג של Guedel¹⁴.
הכנה MSCs בידוד והטיפוח -תרגול
1. לטפח rbSF-MSCs, הכנת 500 מ"ל של מדיום תרבות מסחרית (ראו טבלה של חומרים) בתוספת 10% מסחרי תוספת (ראה טבלה של חומרים), 10% עוברית שור סרום (FBS), ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין.
2. דגירה המדיום תרבות ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
3. היכונו 500 מ"ל תמיסת מאגר פוספט (PBS) בידוד תא, התא כביסה.
4. היכונו 100 מ ל תמיסת מלח מול ההליך arthrocentesis חלל הברך.
אוסף של מפרקיות ﬂ synovial uid מתוך הברך של הארנב
1. בחר אזור כ 5 x 5 ס מ בגודל סביב הברך, לגלח את השיער ארנב מהאזור הזה באמצעות גילוח של בטיחות.
2. לסירוגין, לחטא האתר הליך 3 x עם povidone יוד פתרון ו- 75% אתנול. לאחר מכן, להחיל תחבושות חיטוי לאחר האזור ביסודיות יבש.
3. להזריק 1-2 מ ל תמיסת מול, באמצעות מחט תת-עורית סטרילי (2 מ"ל), לתוך חלל משותף הברך מן המרחב מפרקיות לרוחב, להזיז את הברך 3-4 x ולאחר מכן למצוץ כל הנוזל synovial בטמפרטורת החדר.
4. לסנן את ﬂuid synovial דרך מסננת תא ניילון מיקרומטר 40 כדי להסיר את כל הלכלוך בתוך 4 שעות.
תרבות של rbSF-MSCs
1. לאסוף את ﬂuid המסוננות ב 50 מ ל צנטריפוגה צינורות, צנטריפוגה-1,500 סל ד 10 דקות בטמפרטורת החדר.
2. למחוק את תגובת שיקוע לאחר צנטריפוגה, לשטוף את גלולה עם PBS, resuspend בגדר עם המדיום תרבות שלמה ולאחר מכן צלחת המדיום במנות 100 מ מ.
3. דגירה כל המנות של 37 ° C באווירה humidified, המכילה 5% CO₂.
4. לאחר 48 שעות, לחדש את הכלים בינונית טרייה כדי להסיר תאים שאינם מחסידי. החלף את המדיום פעמיים בשבוע במשך שבועיים כמו המעבר 0 (P0).
  הערה: צריך להיות בערך 1 x 10⁴ תאים חסיד. תאים למ"ל קיימא ב- SF הן בערך 2 x 10²/mL.
5. אחרי 14 יום לאחר ציפוי הראשונית של מושבות רבות צריך יצרו במנות תרבות. בחר את המושבות הגדולים מ- 2 מ מ קוטר. לסמן היכן ממוקמים המושבות שנבחר ע י איתור שלהם היקף בתחתית צלחת.
6. למחוק את המושבות < 2 מ מ רחב, באמצעות תא מגרדים. לעכל את המושבות שנבחרו עם µL כ-5 של 0.25% טריפסין, באמצעות צילינדר שיבוט, ולהעביר את המושבות תבשיל חדש כמו מעבר 1 (P1).
לאחר הניתוח טיפול בבעלי חיים
1. בצע את ההליכים הפעלה מוסדי רגיל עבור ניטור שלאחר הניתוח של ההתאוששות מן ההרדמה.
2. לעקוב אחר הסימנים החיוניים של הארנב כל 10 דקות עד שזה שהכרתו. לבסוף, העברת החיה בהכרה לכלוב. אל תשיבו ארנב עבר ניתוח החברה של בעלי חיים אחרים עד זה הוא החלים לחלוטין.
3. פעולה-מאוחרת, לחטא את האתר עם 0.1% povidone יוד, 2 x ביום למשך 3 ימים.

2. CD90-חיוביות מגנטי הופעל התא מיון (מקינטוש) של rbSF-MSCs והתרבות העיקריים

הכנת הדוגמא
1. כאשר התאים מגיעים בסביבות 80% confluency, תשאף המדיום, ולאחר מכן להוסיף 1-2 מ של 0.25% טריפסין-EDTA על כל מנה.
2. דגירה המנות למשך 2-3 דקות לאפשר ניתוק התא.
3. ברגע התאים מנותקים, להוסיף כמות שווה של המדיום תרבות כדי להשבית את טריפסין.
4. עוברים התליה תא דרך מסננת תא 40 µm, לאסוף את פילטרט של צינור 15 מ"ל, ואז לסובב את התאים ב g 600 × 10 דקות בטמפרטורת החדר.
5. Resuspend בגדר תא במקינטוש הפעלת מאגר (PBS, pH 7.2, אלבומין שור 0.5%, ו- 2 מ מ EDTA), ואז לספור את התא.
תיוג מגנטי
הערה: למיין את rbSF-MSCs עם תא מגנטי מופעל מיון קיט המכיל עמודות, דוכן, מפרידים (ראה טבלה של חומרים).
1. לקבוע את מספר התא באמצעות של hemocytometer.
2. Centrifuge התליה תא ב 300 גרם × 10 דקות ב 4 º C. לגמרי מחוק לגמרי את תגובת שיקוע.
3. הוסף µL 80 resuspension מאגר לכל 10 תאים סה כ⁷ .
4. עבור 10⁷ הכולל תאים, להוסיף 20 µL של גרגרי מצומדת עם נוגדן CD90 monoclonal אנטי-ארנב.
5. לערבב את beads מגנטי תאים בשכבה אחידה הצינורות ולאחר מכן דגירה אותם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בחושך.
6. להוסיף 1 מ"ל של מאגר לכל 10⁷ תאים הצינור ולאחר מכן centrifuge זה ב 300 גרם × 10 דקות ב 4 ° C כדי לשטוף את התאים. למחוק את תגובת שיקוע לאחר צנטריפוגה.
7. Resuspend בגדר ב 500 µL מאגר לכל 10⁷ תאים.
הפרדה מגנטית
1. מקם את העמודה המכילה הכנפיים עמודה לחזית לתוך השדה המגנטי למפריד מגנטי.
2. יש לשטוף את העמודה מפריד מגנטי (MS) עם 500 µL מאגר לכל 10⁷ תאים.
3. העברת התליה תא בודד לתוך העמודה. תן התאים שלילי לעבור דרך השדה המגנטי כדי למחוק את התאים האלה ללא תווית.
4. לשטוף את עמודת x 1-2 עם µL 500 מאגר לכל 10⁷ תאים וזורקים את הזרימה דרך.
5. להעביר את העמודה לתוך שפופרת צנטרפוגה (15 מ"ל).
6. להוסיף 1 מ"ל של המאגר לכל 10⁷ תאים בעמודה, ולאחר מכן לדחוף מיד על הבוכנה לתוך העמודה כדי. להוריד את התאים שכותרתו מגנטית.
7. חזור על הפעולות הנ עם עמודה MS השני כדי להגדיל את הטוהר של CD90⁺ תאים, אשר יכולים להעשיר את השבר eluted.
8. Centrifuge התליה תא ב 300 גרם × 10 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend זה עם המדיום תרבות.
תרבות של CD90⁺ rbSF-MSCs
1. לחסן את התאים במנות 100 מ מ לאחר המיון תא מגנטי הופעל.
2. דגירה כל המנות של 37 מעלות צלזיוס חממה תא humidified עם 5% CO₂.
3. כאשר הנהרות 80-90% של התרבות העיקרי מושגת, על 7-10 ימים, לעכל את תאים חסיד עם 0.25% טריפסין-EDTA ומעבר אותם לדילול 1:2 לבצע מעבר 2 (P2).
4. להשתמש באותה השיטה כדי להעביר את התאים כדי מעבר 3 (P3), אשר יכול לשמש את מבחני במבחנה .
  הערה: לאחר תת התרבות ועל טיהור, בערך 1 x 10⁷ rbSF-MSCs מתקבלים.

3. זיהוי של rbSF-MSCs

סמן משטח אישור rbSF-MSCs מאת cytometry זרימה
1. כאשר MSCs 80-90% confluent-P3, לשטוף את התאים עם PBS ולטפל בהם עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA. לאחר מכן, דגירה של MSCs ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2-3 דקות עד התאים הם צמודי קרקע.
2. לקצור את התאים באמצעות 10 מ"ל ל- PBS, להעביר אותם לתוך צינור חרוטי (15 מ ל), centrifuge אותם ב g × 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
3. למחוק את supernatants. Resuspend בגדר תא ב- 500 µL ל- PBS והעבר אותו לתוך צינור 1.5 מ.
4. דגירה לדילול מטריים FITC מצומדת ו PE מצומדת נוגדנים (isotype, FITC-CD34/PE-CD45, FITC-CD105/PE-CD44) עבור h 1 בחושך ב 4 º C.
5. Centrifuge תערובת זו ב g × 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS על ידי צנטריפוגה ב g × 300 במשך 5 דקות בכל פעם. למחוק את supernatants.
6. Resuspend תאי µL 500 ל- PBS, העברת התליה תא לתוך צינור עגול-התחתון (5 מ"ל) ולנתח אותו באמצעות cytometer של זרימה.
  הערה: לרכוש נתונים cytometer מצויד בשני ערוצים זריחה: 533/30 ו- 585/40. עבור כל זריחה isotype, להשתמש בפקד isotype כדי להתאים את המתח לייזר המתאימים, להגדיר את עוצמת המינימלי הדרוש כדי לקבל היסטוגרמה פלורסצנטיות המציג הן השמאליים והימניים של הפסגה. לאסוף למינימום של 10,000 לאירועים ניתוחים סטטיסטיים.
Multidifferentiation של rbSF-MSCs
הערה: שימוש P3 rbSF-MSCs עבור במבחנה מבחני multidifferentiation.
1. בידול osteogenic
  1. להכין המדיום אינדוקציה osteogenic: DMEM basic (1 x) המכיל 50 מ מ של אסקורבית L חומצה-2-פוספט, 10 מ מ של α-glycerophosphate ו- 100 ננומטר של דקסאמתאזון.
  2. זרע תאי-10 תאים/ס מ³ ² בצלחת תרביות רקמה 6-ובכן, תרבות אותם במדיום אינדוקציה osteogenic.
  3. לשנות את המדיום אינדוקציה כל 3 ימים למשך 3 שבועות.
  4. לתקן את התאים עם 4% פורמלדהיד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לאחר השלמת את הבידול, מכתים את התאים עם 1% רד Alizarin במשך 5 דקות ולאחר מכן לשטוף אותם 3 x עם PBS¹⁵.
2. בידול Adipogenic
  1. להכין המדיום אינדוקציה adipogenic: DMEM basic (1 x) בהיקף של 100 מ מ של indomethacin 10 מ"ג/מ"ל של אינסולין רקומביננטי אנושי, 1 מ מ דקסאמתאזון, 0.5 מ מ 3-איזובוטיל-1-methylxanthine.
  2. פנקו את rbSF P3-MSCs למשך 3 שבועות במדיום אינדוקציה adipogenic.
  3. לאחר 3 שבועות, כתם של וקואלות השומנים נייטרלי באמצעות שמן אדום O כדי לאשר את הבידול adipogenic. לתקן את התאים בפתרון פורמלדהיד 4% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף אותם 3 x עם PBS¹⁶.
3. בידול Chondrogenic
  1. להכין המדיום אינדוקציה chondrogenic: DMEM basic (1 x) בהיקף של 10 ננוגרם למ"ל של TGFβ1, 1% תוספת שלה, 0.35 מ מ L-פרולין, 100 ננומטר של דקסאמתאזון, 50 מ מ של אסקורבית L חומצה-2-פוספט, ו- 1 מ מ של נתרן פירובט.
  2. השתמש צניפה culturing עבור אינדוקציה chondrogenic. צנטריפוגה 5 × 10⁵ P3 rbSF-MSCs ב 1500 סל ד 10 דקות צינור פוליפרופילן (15 מ ל) כדי ליצור גלולה.
  3. תרבות כדורי למשך 3 שבועות עם המדיום אינדוקציה chondrogenic.
  4. לשנות את המדיום כל 3 ימים למשך 3 שבועות.
  5. לאחר 3 שבועות אינדוקציה, להטביע בגדר תא עם פרפין, סעיף זה פרוסות 4 מ מ, כתם אותם באמצעות 0.1% טולדין כחול למשך 30 דקות-בטמפרטורת החדר¹⁷.
סה כ החילוץ-RNA וניתוח מאת כמותיים בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראזית (PCR לרביעיית)
1. לנתק הרנ א הכולל של התאים לאחר אינדוקציה 3 שבועות בידול באמצעות החילוץ RNA מסחרי קיט (ראה טבלה של חומרים).
  1. להסיר את המדיום תרבות בצלחת תרבות ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של ריאגנט בידוד.
  2. Lyse בתאים על-ידי pipetting חוזרות ונשנות עד שהתמיסה אחידה. דגירה זה בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.
  3. להעביר את התא lysate לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL.
  4. להוסיף 100 µL של כלורופורם, לנער את זה על ידי יד 15 x, דגירה התערובת בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.
  5. Centrifuge את הצינור ב g × 12,000 למשך 15 דקות ב 4 º C. להעביר את supernatants לתוך צינור 1.5 מ ל microcentrifuge.
  6. להוסיף 500 µL של אלכוהול איזופרופיל, לזרז את הרנ א 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. צנטריפוגה ב 12,000 × g עבור 10 minat 4 ° C. בגדר RNA צריך להיות גלוי בחלק התחתון של הצינור.
  8. הסר את תגובת שיקוע ולאחר מכן להוסיף 500 µL של 75% אתנול. בקצרה לסובב את הצינור למשך מספר שניות לשטוף את בגדר RNA. Centrifuge זה ב 7,500 g × במשך 5 דקות ב 4 º C.
  9. הסר האתנול שיורית.
  10. להמיס בגדר RNA ב 10 µL DEPC מים ומניחים הצינורות על קרח.
2. הפוך לתמלל RNA הכולל לתוך cDNA לסינתזת DNA קיט (ראה טבלה של חומרים).
  הערה: ביצוע כל ההליכים הבאים על קרח.
  1. מכינים את תערובת הבסיס של שעתוק במהופך.
  2. להוסיף 25 µL של RNA שטופלו DNase כל שפופרת עם µg 1 של RNA.
  3. דגירה התערובת בטמפרטורות הבאות באמצעות הצנטרפוגה תרמי של ה-PCR: 26 ° C 10 דקות (כדי לאפשר את hexamers אקראי anneal), 42 º C למשך 45 דקות (שעתוק במהופך) ו- 75 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (להשבית את רוורס טרנסקריפטאז).
  4. מיד לנתח את cDNA שנוצר על ידי ה-PCR כמותי בזמן אמת, או לאחסן אותו ב-20 ° C.
3. לבצע את ניתוח ביטוי גנטי עם מערכת ה-PCR כמותי בזמן אמת.
  1. השתמש מיקס מאסטר לרביעיית-PCR (ראה טבלה של חומרים) כדי לבצע PCR. צבעי יסוד PCR GAPDH, Runx2, קנאה, PPARγ מפורטות בטבלה 1.
  2. לחשב ביטוי גנים בשיטת^ΔΔCT 2⁻.
  3. לבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנה סטטיסטית סטנדרטי. להשתמש במבחן t מדגם עצמאית כדי להשוות את האמצעים קבוצה.

תוצאות

בידוד, טיהור והתרבות של rbSF-MSCs:
פרוטוקול זה משתמש מקינטוש לבודד rbSF-MSCs, מבוסס על הביטוי של סמן משטח MSC CD90. תזרים תהליך של rbSF-MSCs בידוד, טיהור, אפיון ואת פרוטוקול תרבות במבחנה מוצג באיור1.

מורפולוגיה תאים לאחר ...

Discussion

קיומו של MSCs בנוזל synovial מספק אלטרנטיבה לטיפול מבוססת-תא. מחקרים קודמים הראו כי פגיעה האתרים מכילים כמויות גבוהות של גזע mesenchymal בנוזל synovial שלהם, אשר עשוי להיות בקורלציה עם התקופה לאחר פציעה⁵. MSCs בנוזל synovial עשוי להיות מועיל לרקמות לשיפור ריפוי ספונטני לאחר¹⁸^,פגי...

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgements

מחקר זה מבחינה כלכלית נתמך על ידי המענקים הבאים: יסודות מדעי הטבע של סין (מס 81572198; מס ' 81772394); הקרן לבנייה מלימודי הרפואה ברמה גבוהה של שנז'ן יוניברסיטי (מספר 2016031638); קרן המחקר הרפואי של בפרובינצית גואנג-דונג, סין (מס ' A2016314); שנג'ן המדע ואת הטכנולוגיה פרויקטים (מס ' JCYJ20170306092215436; לא. JCYJ20170412150609690; לא. JCYJ20170413161800287; לא. SGLH20161209105517753; לא. JCYJ20160301111338144).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
MesenGro	StemRD	MGro-500 1703	Warm in 37 °C water bath before use
MesenGro Supplement	StemRD	MGro-500 M1512	Component of MSCs culture medium
DMEM basic	Gibco Inc.	C11995500BT	MSCs differentiation medium
Isotonic saline solution	Litai, China	5217080305	Cavity arthrocentesis procedure reagent
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	HyClone Inc.	SH30256.01B	PBS, free of Ca²⁺/Mg²⁺
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Inc.	10099-141	Component of MSCs culture medium
Povidone iodine solution	Guangdong, China	150605	Sterilization agent
75% ethanol	Lircon, china	170917	Sterilization agent
0.25% Trypsin/EDTA	Gibco Inc.	25200-056	Cell dissociation reagent
1% Penicillin-Streptomycin	Gibco Inc.	15140-122	Component of MSCs medium
MACS Running Buffer	MiltenyiBiotec	5160112089	Containing phosphate-buffered saline (PBS), 0.5% bovine serum albumin(BSA), and 2 mMEDTA
CD90 antibody conjugated MicroBeads	MiltenyiBiotec	5160801456	For magnetic activated cell sorting
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256	Component of MSCs chondrogenic differentiation
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756	Component of MSCs osteogenic differentiation
ITS	BD	354352	1%, Component of MSCs chondrogenic differentiation
L-proline	Sigma-Aldrich	P5607	0.35 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation
L-ascorbic acid-2-phosphate	Sigma-Aldrich	A8960	50 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation
3-isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I5879	0.5 mM, Component of adipogenic differentiation
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378	100 mM, Component of adipogenic differentiation
TGFβ1	Peprotech	100-21	10 ng/mL, Component of MSCs chondrogenic differentiation
α-glycerophsphate	Sigma-Aldrich	G6751	Component of MSCs osteogenic differentiation
CD34 Polyclonal Antibody, FITC Conjugated	Bioss	bs-0646R-FITC	Hematopoietic stem cells marker
Mouse antirabbit CD44	Bio-Rad	MCA806GA	Thy-1 membrane glycoprotein (MSCs marker)
CD45 (Monoclonal Antibody)	Bio-Rad	MCA808GA	Hematopoietic stem cells marker
CD105 antibody	Genetex	GTX11415	MSCs marker
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	I9030	Precipitates RNA extraction organic phases
Trichloromethane	Wenge, China	61553	Extract total RNA
Trizol	Invitrogen	15596-018	Isolate total RNA
SYBR green master mix	Takara Bio, Japan	RR420A	PCR test
cDNA synthesis kit	Takara Bio, Japan	RR047A	Reverse-transcribed to complementary DNA
Alizarin Red	Sigma-Aldrich	A5533	Staining of calcium compounds
Toluidine Blue	Sigma-Aldrich	89640	Staining of cartilaginous tissue
Oil Red O solution	Sigma-Aldrich	O1391L	Lipid vacuole staining
Equipment
MiniMACS Separator	MiltenyiBiotec	130-042-102	For magnetic activated cell sorting
MultiStand	MiltenyiBiotec	130-042-303	For magnetic activated cell sorting
MS Columns	MiltenyiBiotec	130-042-201	For magnetic activated cell sorting
Cell Strainer	FALCON Inc.	352340	40 μm nylon
Hemocytometer	ISOLAB Inc.	075.03.001	Cell counting
Falcon 100 mm dish	Corning	353003	Cell culture dish
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C	RNA Extraction and PCR
Centrifuge Tubes	Sigma-Aldrich	91050	Gamma-sterilized
High-speed centrifuge	Eppendorf	5804R	Centrifuge cells
Carbon dioxide cell incubator	Thermo scientific	3111	Cell culture
Real-Time PCR Instrument	Life Tech	QuantStudio	Real-Time quantitative polymerase chain reaction
Flow cytometer	BD Biosciences	342975	Cell analyzer
Pipettor	Eppendorf	O25456F	Transfer the liquid
Cloning cylinder	Sigma-Aldrich	C3983-50EA	Isolate and pick individual cell colonies
Sterile hypodermic syringe	Double-Dove, China	131010	Arthrocentesis procedure
Rabbit cage	Zhike, China	ZC-TGD	Restrain the rabbit

References

Oreffo, R. O., Cooper, C., Mason, C., Clements, M. Mesenchymal stem cells: lineage, plasticity, and skeletal therapeutic potential. Stem Cell Reviews. 1 (2), 169-178 (2005).
Asakura, A., Rudnicki, M. A., Komaki, M. Muscle satellite cells are multipotential stem cells that exhibit myogenic, osteogenic, and adipogenic differentiation. Differentiation. 68 (4-5), 245-253 (2001).
De, B. C., Dell'Accio, F., Tylzanowski, P., Luyten, F. P. Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane. Arthritis Rheumatology. 44 (8), 1928-1942 (2001).
Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
McGonagle, D., Jones, E., English, A., Emery, P. Enumeration and phenotypic characterization of synovial fluid multipotential mesenchymal progenitor cells in inflammatory and degenerative arthritis. Arthritis & Rheumatism. 50 (3), 817-827 (2004).
Jia, Z., et al. Isolation and characterisation of human mesenchymal stem cells derived from synovial fluid by magnetic activated cell sorting (MACS). Cell Biology International. , (2017).
Bashir, M., et al. Isolation, culture and characterization of New Zealand white rabbit mesenchymal stem cells derived from bone marrow. Asian Journal of Animal & Veterinary Advances. 10 (8), 13-30 (2015).
Song, X., et al. Differentiation potential of rabbit CD90-positive cells sorted from adipose-derived stem cells in vitro. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 53 (1), 1-6 (2016).
Lee, T. C., et al. Comparison of surface markers between human and rabbit mesenchymal stem cells. PLOS One. 9 (11), e111390 (2014).
Stewart, M. C., Chen, Y., Bianchessi, M., Pondenis, H. Phenotypic characterization of equine synovial fluid-derived chondroprogenitor cells. Stem Cell Biology and Research. 3 (1), (2016).
Prado, A. A. F., et al. Characterization of mesenchymal stem cells derived from the equine synovial fluid and membrane. BioMed Central Veterinary Research. 11 (1), 281 (2015).
Yoshimura, H., et al. Comparison of rat mesenchymal stem cells derived from bone marrow, synovium, periosteum, adipose tissue, and muscle. Cell and Tissue Research. 327 (3), 449-462 (2007).
Wu, C. C., et al. Intra-articular injection of platelet-rich fibrin releasates in combination with bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the treatment of articular cartilage defects: an in vivo study in rabbits. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 105 (6), 1536-1543 (2017).
John, T., Lerche, P. . Anesthesia and Analgesia for Veterinary Technicians. , (2011).
Koyama, N., et al. Pluripotency of mesenchymal cells derived from synovial fluid in patients with temporomandibular joint disorder. Life Sciences. 89 (19-20), 741-747 (2011).
Kim, Y. S., et al. Isolation and characterization of human mesenchymal stem cells derived from synovial fluid in patients with osteochondral lesion of the talus. American Journal of Sports Medicine. 43 (2), 399-406 (2015).
Vereb, Z., et al. Immunological properties of synovial fluid-derived mesenchymal stem cell-like cells in rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 74 (Suppl 1), A64-A65 (2015).
Matsukura, Y., Muneta, T., Tsuji, K., Koga, H., Sekija, I. Mesenchymal stem cells in synovial fluid increase after meniscus injury. Clinical Orthopaedics & Related Research. 472 (5), 1357-1364 (2014).
Morito, T., et al. Synovial fluid-derived mesenchymal stem cells increase after intra-articular ligament injury in humans. Rheumatology. 47 (8), 1137-1143 (2008).
Hegewald, A. A., et al. Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study. Tissue & Cell. 36 (6), 431-438 (2004).
Jones, E. A., et al. Synovial fluid mesenchymal stem cells in health and early osteoarthritis: detection and functional evaluation at the single cell level. Arthritis & Rheumatism. 58 (6), 1731-1740 (2008).
Makker, K., Agarwal, A., Sharma, R. K. Magnetic activated cell sorting (MACS): utility in assisted reproduction. Indian Journal of Experimental Biology. 46 (7), 491-497 (2008).
Schmitz, B., et al. Magnetic activated cell sorting (MACS) — a new immunomagnetic method for megakaryocytic cell isolation: comparison of different separation techniques. European Journal of Haematology. 52 (5), 267-275 (1994).
Reinhardt, M., Bader, A., Giri, S. Devices for stem cell isolation and delivery: current need for drug discovery and cell therapy. Expert Review of Medical Devices. 12 (3), 353-364 (2015).
Gronthos, S., Zannettino, A. C. W., Prockop, D. J., Bunnell, B. A., Phinney, D. G. A method to isolate and purify human bone marrow stromal stem cells. Mesenchymal Stem Cells. , 45-57 (2008).
Krawetz, R. J., et al. Synovial fluid progenitors expressing CD90+ from normal but not osteoarthritic joints undergo chondrogenic differentiation without micro-mass culture. PLOS One. 7 (8), e43616 (2012).
Ogata, Y., et al. Purified human synovium mesenchymal stem cells as a good resource for cartilage regeneration. PLOS One. 10 (6), e0129096 (2015).
Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells: the International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
Gauci, S. J., et al. Modulating chondrocyte hypertrophy in growth plate and osteoarthritic cartilage. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interact. 8 (4), 308 (2008).
Cooke, M. E., et al. Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with chondrocytes promotes chondrogenic differentiation without hypertrophy. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (10), 1210-1218 (2011).
Fischer, J., Dickhut, A., Rickert, M., Richter, W. Human articular chondrocytes secrete parathyroid hormone-related protein and inhibit hypertrophy of mesenchymal stem cells in coculture during chondrogenesis. Arthritis and Rheumatism. 62 (9), 2696-2706 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

138 uid synovial mesenchymal in vitro CD90

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: