Magnetico-Activated Cell Sorting strategie per isolare e purificare Synovial cellule staminali mesenchimali liquido derivato da un modello di coniglio

Riepilogo

Questo articolo presenta un protocollo semplice ed economico per il semplice isolamento e purificazione delle cellule staminali mesenchimali da liquido sinoviale di coniglio bianco di Nuova Zelanda.

Abstract

Cellule staminali mesenchimali (MSCs) sono la fonte principale delle cellule per terapia cellulare. MSCs dal liquido sinoviale cavità articolare potrebbero essere utilizzati per l'ingegneria tissutale della cartilagine. MSCs dal liquido sinoviale (SF-MSCs) sono stati considerati promettenti candidati per rigenerazione articolare, e loro potenziale beneficio terapeutico li ha resi un tema di ricerca importante di ritardo. SF-MSCs dalla cavità del ginocchio del coniglio bianco di Nuova Zelanda può essere impiegato come un modello traslazionale ottimizzato per valutare umana medicina rigenerativa. Per mezzo di CD90-base magnetica attivato cella (MACS) tecnologie di differenziazione, questo protocollo ottiene correttamente coniglio SF-MSCs (rbSF-MSCs) da questo modello di coniglio e completamente dimostra ulteriormente il fenotipo MSC di queste cellule inducendo loro di differenziarsi per osteoblasti, adipociti e condrociti. Di conseguenza, questo approccio può essere applicato nella ricerca di biologia cellulare e tissutale utilizzando procedure e attrezzature semplici.

Introduzione

MSCs sono stati suggeriti come una preziosa fonte per la medicina rigenerativa, soprattutto per le lesioni della cartilagine. MSCs, tra cui condrociti, osteoblasti, adipociti, miociti scheletrici e viscerali cellule stromali, largamente espandere le aree per il trapianto di cellule staminali a causa della loro alta espansione tasso e multi-lignaggio differenziazione potenziali¹. MSCs può essere isolato dal scheletrico muscolare, synovium, midollo osseo e del tessuto adiposo^2,3,4. Risultati hanno inoltre confermato la presenza di cellule staminali mesenchimali nel liquido sinoviale, e precedente ricerca ha identificato MSCs derivato liquido sinoviale (SF-MSCs) come candidati promettenti per rigenerazione articolare^5,6.

Tuttavia, ricerca e sperimentazione preclinica su campioni umani sono soggetti a molte questioni etiche. Invece, i conigli sono stati e continuano ad essere il più comunemente usato specie animali per dimostrare che il trapianto di cellule staminali mesenchimali può riparare il danno della cartilagine. Negli ultimi anni, un numero crescente di ricercatori hanno studiato le cellule staminali mesenchimali coniglio (rbMSCs) entrambi in vitro e in vivo, come queste cellule sono simili all'essere umano MSCs nella loro fisiologia biologia e tessuto. Allo stesso modo, il rbMSCs sono in grado di aderire a superfici in plastica, visualizzazione morfologia dell'alberino-fibroblasto come MSCs umane. Inoltre, campioni mesenchymal coniglio sono semplici e facili da ottenere⁷. Inoltre, i punti più cruciali sono che rbMSCs esprimono marcatori di superficie, quali CD44, CD90 e CD105, e che sia preservata la differenziazione multi-lignaggio potenziale, che è d'accordo con i criteri per l'identificazione delle popolazioni di MSC come definito dalla società internazionale per la terapia cellulare^8,9. In particolare, sono in grado di non-ipertrofica Condrogenesi quando indotto dal TGF-β1, rendendoli così fonti di cellule adatto per cartilagine articolare fenotipico rigenerazione^{10,11, chondroprogenitors fluido sinoviale 12}.

Tuttavia, l'isolamento della SF-MSCs è notevolmente diverso da altri tessuti, compreso il cordone ombelicale, il tessuto adiposo, sangue periferico e midollo osseo. Attualmente, gli approcci più comuni per la purificazione e l'ordinamento di SF-MSCs sono citometria a flusso e immunomagnetica ordinamento basato su tallone, anche se il metodo di cytometry di flusso richiede un ambiente specifico e altamente costosi strumenti¹³.

Questo articolo presenta una procedura per la raccolta semplice e minimamente invasiva di campioni di liquido sinoviale dalla Nuova Zelanda conigli bianchi. Durante la procedura, il rbSF-MSCs sono stabilmente espanse in vitro e quindi isolato con CD90 positive procedure basate su tallone magnetiche. Infine, il protocollo viene illustrato come ottenere MSCs con elevata purezza e vitalità dalle fonti delle cellule raccolte.

In questo protocollo, l'isolato rbSF-MSCs sono caratterizzati base alla loro morfologia, espressione di marcatori specifici e pluripotenza delle cellule staminali. Flusso cytometry-basata immunophenotyping rivela una significativa espressione positiva di CD44 e CD105, mentre l'espressione di CD45 e CD34 è negativo. Infine, un test in vitro per rbSF-MSCs illustra la differenziazione osteogenica, adipogenico e condrogenica di queste cellule.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità degli orientamenti regionali del comitato etico, e tutte le procedure di animali sono state approvate dal istituzionale Animal Care e di utilizzo Comitato di Shenzhen secondo persone Hospital, Università di Shenzhen.

1. isolare e cultura rbSF-MSCs

1. Preparativi per la procedura di animale
   1. Preparare scheletricamente maturo femmina Nuova Zelanda conigli bianchi per la raccolta di rbSF-MSCs. eseguire un esame clinico dei conigli un giorno prima della procedura di anestesia e artrocentesi.
      Nota: gli esami fisici dovrebbe includere peso (2.0-2.5 kg), sesso (donna) e la temperatura corporea, frequenza respiratoria e frequenza cardiaca. Intervalli di parametro per conigli clinicamente sani sono 30-50 min per tasso di respirazione, 220-280 min per la frequenza cardiaca e 38-39 ° C per la temperatura corporea.
   2. Veloce gli animali per 6 ore prima dell'anestesia.
2. Preparazioni e procedura per l'anestesia degli animali
   1. Trattenere il coniglio con una gabbia (Vedi Tabella materiali) e poi iniettare 3% di sodio pentobarbital nella vena marginale dell'orecchio ad una dose di 1 mL/kg per l'anestesia generale.
   2. Posto il coniglio in una confortevole posizione dorsale-recumbent.
   3. Monitorare la frequenza respiratoria, frequenza cardiaca e temperatura corporea del coniglio durante l'anestesia.
   4. Usare pomata oftalmologico sui suoi occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
   5. Valutare la profondità dell'anestesia seguito classificazione^{14 di Guedel}.
3. Preparazione per MSCs isolamento e coltivazione
   1. Per coltivare rbSF-MSCs, preparare 500 mL di terreno di coltura commerciale (Vedi Tabella materiali) completati con supplemento di 10% delle imprese (Vedi Tabella materiali), 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% penicillina-streptomicina.
   2. Incubare il terreno di coltura a 37 ° C in un bagno d'acqua.
   3. Preparare 500 mL di soluzione salina tampone fosfato (PBS) per isolamento delle cellule e cellula lavaggio.
   4. Preparare 100 mL di soluzione salina isotonica per la procedura di artrocentesi cavità del ginocchio.
4. Raccolta di liquido sinoviale articolare dal ginocchio del coniglio
   1. Selezionare un'area di circa 5 x 5 cm di dimensioni intorno al ginocchio e radere i peli di coniglio da questa zona utilizzando un rasoio elettrico di sicurezza.
   2. In alternativa, disinfettare il sito di procedura 3 x con povidone iodio soluzione e 75% di etanolo. Quindi, applicare teli sterili dopo l'area è completamente asciugato.
   3. Iniettare 1-2 mL di soluzione salina isotonica, utilizzando una siringa ipodermica sterile (2 mL), in cavità articolare del ginocchio dallo spazio articolare laterale, spostare il ginocchio x 3-4 e poi succhiare tutto il fluido sinoviale a temperatura ambiente.
   4. Filtrare il fluido sinoviale attraverso un colino di cella di nylon µm 40 per rimuovere eventuali detriti all'interno di 4 h.
5. Cultura di rbSF-MSCs
   1. Raccogliere il filtrato del fluido in provette centrifuga da 50 mL e centrifugare a 1.500 giri/min per 10 min a temperatura ambiente.
   2. Eliminare il supernatante dopo la centrifugazione, lavare la pallina con PBS, risospendere il pellet con il terreno di coltura completo e poi piastra il mezzo in piastre da 100 mm.
   3. Incubare le piastre a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente 5% CO₂.
   4. Dopo 48 h, ricostituire i piatti con medium fresco per rimuovere eventuali cellule non aderenti. Sostituire il mezzo due volte a settimana per 2 settimane come passaggio 0 (P0).
      Nota: Ci dovrebbe essere circa 1 x 10⁴ cellule aderenti. Cellule/ml praticabile in SF sono circa 2 x 102/ml.
   5. Dopo 14 giorni che seguono la placcatura iniziale, molte colonie dovrebbero avere formato in piastre di coltura. Selezionare le colonie più grandi di 2 mm di diametro. Mark, dove si trovano le colonie selezionate tracciando loro circonferenza sul fondo piatto.
   6. Scartare le colonie < 2 mm di larghezza, utilizzando raschietti di cella. Digerire le colonie selezionate con circa 5 µ l di 0,25% tripsina, utilizzando una bomboletta di clonazione e trasferire le colonie un nuovo piatto come passaggio 1 (P1).
6. Post-operatorio cura degli animali
   1. Seguire le procedure operative istituzionali standard per il monitoraggio post-operatorio e recupero dall'anestesia.
   2. Monitorare i segni vitali del coniglio ogni 10 min fino a quando ha riacquistato coscienza. Infine, è possibile trasferire l'animale cosciente alla gabbia. Non restituiscono un coniglio che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali, finché non ha completamente recuperato.
   3. Post-operazione, disinfettare il sito con 0,1% povidone iodio, 2 volte al giorno per 3 giorni.

2. CD90-positivo magnetico attivato cella ordinamento (MACS) del rbSF-MSCs e coltura primaria

1. Preparazione del campione
   1. Quando le cellule raggiungono intorno 80% confluency, aspirare il mezzo e quindi aggiungere 1-2 mL di 0,25% tripsina-EDTA ad ogni piatto.
   2. Incubare i piatti per 2-3 minuti consentire il distacco delle cellule.
   3. Una volta che le cellule sono staccate, aggiungere una pari quantità di terreno di coltura per inattivare la tripsina.
   4. Passare la sospensione cellulare attraverso un colino di cella di 40 µm, raccogliere il filtrato in una provetta da 15 mL e poi girare giù le cellule a 600 × g per 10 min a temperatura ambiente.
   5. Risospendere il pellet cellulare in Mac con il buffer (PBS, pH 7,2, 0,5% di albumina di siero bovino e 2 mM EDTA) e poi contare il numero di cellulare.
2. Etichette magnetiche
   Nota: Ordinare il rbSF-MSCs con una cella magnetico attivato l'ordinamento kit contenente colonne, uno stand e separatori (Vedi Tabella materiali).
   1. Determinare il numero di cellulare utilizzando un emocitometro.
   2. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 × g per 10 min a 4 ° C. Completamente aspirare il supernatante.
   3. Aggiungere 80 µ l di tampone di risospensione per 10⁷ cellule totali.
   4. Per 10⁷ cellule totali, aggiungere 20 µ l di microsfere coniugate con un anticorpo monoclonale di CD90 anti-coniglio.
   5. Mescolare le biglie magnetiche e le cellule in modo uniforme nei tubi, poi li Incubare a 4 ° C per 15 min al buio.
   6. Aggiungere 1 mL di tampone per 10⁷ cellule al tubo e poi lo Centrifugare a 300 × g per 10 min a 4 ° C per lavare le cellule. Eliminare il supernatante dopo la centrifugazione.
   7. Risospendere il pellet in 500 µ l di tampone per 10⁷ cellule.
3. Separazione magnetica
   1. Sistemare la colonna con le ali di colonna alla parte anteriore nel campo magnetico del separatore magnetico.
   2. Lavare la colonna Separatore magnetico (MS) con 500 µ l di buffer per 10⁷ cellule.
   3. Trasferire la sospensione singola cella nella colonna. Lasciare che le celle negative passano attraverso il campo magnetico per eliminare queste cellule senza etichetta.
   4. Lavare la colonna 1-2x con 500 µ l di buffer per 10⁷ cellule e scartare il flusso continuo.
   5. Trasferire la colonna in una provetta da centrifuga (15 mL).
   6. Aggiungere 1 mL di tampone per 10⁷ cellule alla colonna e poi immediatamente spingere lo stantuffo nella colonna per scovare le cellule magneticamente con etichetta.
   7. Ripetere la procedura di cui sopra con un secondo MS Column per aumentare la purezza del CD90⁺ cellule, che possono arricchire la frazione eluita.
   8. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 × g per 10 min, aspirare il supernatante e risospendere le con terreno di coltura.
4. Cultura del CD90⁺ rbSF-MSCs
   1. Inoculare le cellule in piastre da 100 mm dopo l'ordinamento magnetico delle cellule attivate.
   2. Incubare le piastre a 37 ° C in un'incubatrice umidificata cellulare con 5% CO₂.
   3. Quando viene raggiunta la confluenza di 80-90% di colture primarie, a circa 7-10 giorni, digerire le celle aderenti con 0,25% tripsina-EDTA e passaggio a una diluizione di 1:2 a fare passaggio 2 (P2).
   4. Utilizzare lo stesso metodo per passare alle cellule di passaggio 3 (P3), che possono essere utilizzate per le analisi in vitro .
      Nota: Dopo la sub-cultura e la purificazione, si ottengono circa 1 x 10⁷ rbSF-MSCs.

3. identificazione del rbSF-MSCs

1. Conferma di superficie dell'indicatore di rbSF-cellule staminali mesenchimali da citometria a flusso
   1. Quando i MSCs sono 80-90% confluenti a P3, lavare le cellule con PBS e trattarli con 1 mL di 0,25% tripsina-EDTA. Quindi, incubare le MSCs a 37 ° C per 2-3 minuti fino a quando le cellule sono staccate.
   2. Raccogliere le celle utilizzando 10 mL di PBS, trasferirli in un tubo conico (15 mL) e li Centrifugare a 300 × g per 5 min a temperatura ambiente.
   3. Eliminare i sovranatante. Risospendere il pellet cellulare in 500 µ l di PBS e trasferirlo in una provetta da 1,5 mL.
   4. Incubare una diluizione di 1: 100 di anticorpi coniugati FITC e PE-coniugati (isotipo, FITC-CD34/PE-CD45, FITC-CD105/PE-CD44) per 1 h al buio a 4 ° C.
   5. Questa miscela a 300 × g per 5 min a temperatura ambiente di centrifugare e lavare le cellule due volte con PBS mediante centrifugazione a 300 × g per 5 minuti ogni volta. Eliminare i sovranatante.
   6. Risospendere le cellule in 500 µ l di PBS, trasferire la sospensione cellulare in una provetta di turno-fondo (5 mL) e analizzarlo utilizzando un citometro a flusso.
      Nota: Acquisizione di dati su un citometro dotato di due canali di fluorescenza: 533/30 e 585/40. Per ogni isotipo di fluorescenza, utilizzare il controllo di isotipo per regolare la tensione del laser appropriato e impostare l'intensità minima necessaria per ottenere un istogramma di fluorescenza che Visualizza i bordi destro e sinistro del picco. Raccogliere un minimo di 10.000 eventi per le analisi statistiche.
2. Al multidifferenziamento delle rbSF-MSC
   Nota: Uso P3 rbSF-MSCs per le analisi di multidifferenziativo in vitro .
   1. Differenziazione osteogenica
      1. Preparare il supporto di induzione osteogenica: DMEM basic (1x) contenente 50 mM di L-ascorbico acido-2-fosfato, α-glicerofosfato di 10 mM e 100 nM di desametasone.
      2. Le cellule a 10³ cellule/cm² in una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti di semi e loro cultura nel mezzo di induzione osteogenica.
      3. Cambiare il mezzo di induzione ogni 3 giorni per 3 settimane.
      4. Fissare le cellule con formaldeide al 4% per 30 min a temperatura ambiente, una volta completata la differenziazione, macchia le celle con il colore rosso di alizarina 1% per 5 minuti e poi lavare loro 3 x con PBS¹⁵.
   2. Adipogenico differenziazione
      1. Preparare il supporto di induzione adipogenico: DMEM basic (1x) composto da 100 mM di indometacina, 10 mg/mL di insulina umana ricombinante, 1 mM di desametasone e 0,5 mM di 3-isobutyl-1-methylxanthine.
      2. Trattare il P3 rbSF-MSCs per 3 settimane nel medium adipogenico induzione.
      3. Dopo 3 settimane, macchia i vacuoli di lipidi neutri utilizzando Oil Red O per confermare la differenziazione adipogenico. Fissare le cellule in una soluzione di formaldeide 4% a temperatura ambiente per 30 minuti e poi lavare 3 volte con PBS¹⁶.
   3. Differenziazione chondrogenic
      1. Preparare il supporto di induzione condrogenica: DMEM basic (1x) che consiste di 10 ng/mL di TGFβ1, 1% suo supplemento, 0,35 mM di L-prolina, 100 nM di desametasone, 50 mM di L-ascorbico acido-2-fosfato e 1 mM di piruvato di sodio.
      2. Utilizzare pellet coltura per l'induzione di chondrogenic. Centrifugare 5 × 10⁵ P3 rbSF-MSCs a 1500 rpm per 10 min in un tubo in polipropilene (15 mL) per formare una pallina.
      3. Per 3 settimane con il mezzo di induzione condrogenica della coltura del pellet.
      4. Modificare il mezzo ogni 3 giorni per 3 settimane.
      5. Dopo induzione di 3 settimane, incorporare il pellet cellulare con paraffina, sezione a fette di 4 mm e macchia utilizzando 0.1% blu di toluidina per 30 min a temperatura ambiente¹⁷.
3. Estrazione di RNA totale e l'analisi di reazione a catena della polimerasi in tempo reale quantitativa (qRT-PCR)
   1. Isolare il RNA totale delle cellule dopo induzione di differenziazione di 3 settimane attraverso l'estrazione di RNA commerciale kit (Vedi Tabella materiali).
      1. Rimuovere il terreno di coltura nella piastra di coltura e quindi aggiungere 1 mL di reagente di isolamento.
      2. Lisare le cellule pipettando ripetuto finché la soluzione non è omogenea. Incubare a temperatura ambiente per 3 min.
      3. Trasferire il lysate delle cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
      4. Aggiungere 100 µ l di cloroformio, scuoterlo da mano 15x e incubare la miscela a temperatura ambiente per 3 min.
      5. Centrifugare la provetta a 12.000 × g per 15 min a 4 ° C. Trasferire i surnatanti in un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL.
      6. Aggiungere 500 µ l di isopropanolo e precipitare il RNA per 10 min a temperatura ambiente.
      7. Centrifugare a 12.000 × g per 10 minat 4 ° C. La pallina del RNA dovrebbe essere visibile nella parte inferiore del tubo.
      8. Rimuovere il supernatante e quindi aggiungere 500 µ l di etanolo al 75%. Girare brevemente il tubo per alcuni secondi per lavare la pallina del RNA. E centrifugare a 7.500 × g per 5 min a 4 ° C.
      9. Rimuovere il residuo dell'etanolo.
      10. Dissolva la pallina del RNA in 10 µ l di acqua DEPC e posizionare i tubi sul ghiaccio.
   2. Retromarcia trascrivere RNA totale in cDNA con una sintesi di DNA kit (Vedi Tabella materiali).
      Nota: Eseguire tutte le procedure seguenti sul ghiaccio.
      1. Preparare il mix master di trascrizione inversa.
      2. Aggiungere 25 µ l di RNA dnasi-trattati in ogni provetta con 1 µ g di RNA.
      3. Incubare la miscela alle seguenti temperature utilizzando un termociclatore PCR: 26 ° C per 10 min (per consentire il random esameri tempri), 42 ° C per 45 min (trascrizione inversa) e 75 ° C per 10 min (inattivare la trascrittasi inversa).
      4. Immediatamente analizzare il cDNA risultante dalla PCR quantitativa in tempo reale, o conservare a-20 ° C.
   3. Eseguire l'analisi di espressione genica con un sistema PCR quantitativo in tempo reale.
      1. Utilizzare qRT-PCR Master Mix (Vedi Tabella materiali) per eseguire la PCR. Gli iniettori PCR per GAPDH, Runx2, Agg e PPARγ sono elencati nella tabella 1.
      2. Calcolare l'espressione genica utilizzando il metodo^ΔΔCT 2⁻.
      3. Condurre un'analisi statistica utilizzando software statistici standard. Utilizzare un test t per campioni indipendenti per confrontare i mezzi del gruppo.

Risultati

Isolamento, purificazione e la cultura delle rbSF-msc:
Questo protocollo utilizza Mac per isolare rbSF-MSCs, basato sull'espressione del marcatore di superficie MSC CD90. Un diagramma di flusso del processo di isolamento, purificazione, dei rbSF-MSCs e la caratterizzazione e il protocollo di coltura in vitro è illustrato nella Figura 1.

Morfologia delle cellule ...

Discussione

L'esistenza di cellule staminali mesenchimali nel liquido sinoviale fornisce un'alternativa per la terapia cellulare. Gli studi precedenti hanno dimostrato che lesioni siti contengono una maggiore quantità di cellule staminali mesenchimali in loro liquido sinoviale, che può essere correlata positivamente con il periodo di alberino-ferita di⁵. MSCs nel liquido sinoviale può essere favorevole al tessuto per migliorare la guarigione spontanea dopo un infortunio^18,

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
MesenGro	StemRD	MGro-500 1703	Warm in 37 °C water bath before use
MesenGro Supplement	StemRD	MGro-500 M1512	Component of MSCs culture medium
DMEM basic	Gibco Inc.	C11995500BT	MSCs differentiation medium
Isotonic saline solution	Litai, China	5217080305	Cavity arthrocentesis procedure reagent
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	HyClone Inc.	SH30256.01B	PBS, free of Ca2+/Mg2+
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Inc.	10099-141	Component of MSCs culture medium
Povidone iodine solution	Guangdong, China	150605	Sterilization agent
75% ethanol	Lircon, china	170917	Sterilization agent
0.25% Trypsin/EDTA	Gibco Inc.	25200-056	Cell dissociation reagent
1% Penicillin-Streptomycin	Gibco Inc.	15140-122	Component of MSCs medium
MACS Running Buffer	MiltenyiBiotec	5160112089	Containing phosphate-buffered saline (PBS), 0.5% bovine serum albumin(BSA), and 2 mMEDTA
CD90 antibody conjugated MicroBeads	MiltenyiBiotec	5160801456	For magnetic activated cell sorting
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256	Component of MSCs chondrogenic differentiation
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756	Component of MSCs osteogenic differentiation
ITS	BD	354352	1%, Component of MSCs chondrogenic differentiation
L-proline	Sigma-Aldrich	P5607	0.35 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation
L-ascorbic acid-2-phosphate	Sigma-Aldrich	A8960	50 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation
3-isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I5879	0.5 mM, Component of adipogenic differentiation
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378	100 mM, Component of adipogenic differentiation
TGFβ1	Peprotech	100-21	10 ng/mL, Component of MSCs chondrogenic differentiation
α-glycerophsphate	Sigma-Aldrich	G6751	Component of MSCs osteogenic differentiation
CD34 Polyclonal Antibody, FITC Conjugated	Bioss	bs-0646R-FITC	Hematopoietic stem cells marker
Mouse antirabbit CD44	Bio-Rad	MCA806GA	Thy-1 membrane glycoprotein (MSCs marker)
CD45 (Monoclonal Antibody)	Bio-Rad	MCA808GA	Hematopoietic stem cells marker
CD105 antibody	Genetex	GTX11415	MSCs marker
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	I9030	Precipitates RNA extraction organic phases
Trichloromethane	Wenge, China	61553	Extract total RNA
Trizol	Invitrogen	15596-018	Isolate total RNA
SYBR green master mix	Takara Bio, Japan	RR420A	PCR test
cDNA synthesis kit	Takara Bio, Japan	RR047A	Reverse-transcribed to complementary DNA
Alizarin Red	Sigma-Aldrich	A5533	Staining of calcium compounds
Toluidine Blue	Sigma-Aldrich	89640	Staining of cartilaginous tissue
Oil Red O solution	Sigma-Aldrich	O1391L	Lipid vacuole staining
Equipment
MiniMACS Separator	MiltenyiBiotec	130-042-102	For magnetic activated cell sorting
MultiStand	MiltenyiBiotec	130-042-303	For magnetic activated cell sorting
MS Columns	MiltenyiBiotec	130-042-201	For magnetic activated cell sorting
Cell Strainer	FALCON Inc.	352340	40 μm nylon
Hemocytometer	ISOLAB Inc.	075.03.001	Cell counting
Falcon 100 mm dish	Corning	353003	Cell culture dish
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C	RNA Extraction and PCR
Centrifuge Tubes	Sigma-Aldrich	91050	Gamma-sterilized
High-speed centrifuge	Eppendorf	5804R	Centrifuge cells
Carbon dioxide cell incubator	Thermo scientific	3111	Cell culture
Real-Time PCR Instrument	Life Tech	QuantStudio	Real-Time quantitative polymerase chain reaction
Flow cytometer	BD Biosciences	342975	Cell analyzer
Pipettor	Eppendorf	O25456F	Transfer the liquid
Cloning cylinder	Sigma-Aldrich	C3983-50EA	Isolate and pick individual cell colonies
Sterile hypodermic syringe	Double-Dove, China	131010	Arthrocentesis procedure
Rabbit cage	Zhike, China	ZC-TGD	Restrain the rabbit