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Resumen

Este artículo presenta un protocolo sencillo y económico para el simple aislamiento y purificación de células madre mesenquimales del líquido sinovial del conejo blanco de Nueva Zelanda.

Resumen

Las células madre mesenquimales (MSCs) son la fuente principal de la célula para terapia basada en células. Pueden utilizar MSCs de líquido sinovial de la cavidad articular para la ingeniería del tejido fino del cartílago. MSCs de líquido sinovial (SF-MSCs) han sido considerados candidatos prometedores para la regeneración articular, y su potencial beneficio terapéutico les ha hecho un tema de investigación importante últimamente. SF-MSCs de la cavidad de la rodilla del conejo Nueva Zelanda blanco pueden ser empleados como modelo traduccional optimizado para evaluar humana medicina regenerativa. Por medio de CD90-basado celular activado magnética clasificación tecnologías (MACS), este protocolo con éxito obtiene conejo SF-MSCs (rbSF-MSCs) de este modelo de conejo y completamente demuestra el fenotipo MSC de estas células induciendo a distinguir a osteoblastos, adipocitos y condrocitos. Por lo tanto, este enfoque puede aplicarse en la investigación en biología celular e Ingeniería del tejido fino usando procedimientos y equipos sencillos.

Introducción

MSCs se han sugerido como una fuente valiosa para la medicina regenerativa, especialmente para las lesiones de cartílago. MSCs, incluyendo condrocitos, osteoblastos, adipocitos, miocitos esqueléticos y viscerales células stromal, ampliamente amplían las áreas para el trasplante de células madre debido a su alta expansión tasa y multilineal diferenciación potencial1. MSCs pueden ser aislados de los esquelético muscular, membrana sinovial, la médula ósea y tejido adiposo2,3,4. Resultados tienen también confirmó la presencia de MSCs en el líquido sinovial, y la investigación anterior ha identificado MSCs derivados del líquido sinoviales (SF-MSCs) como candidatos prometedores para la regeneración articular5,6.

Sin embargo, investigación y experimentación preclínica en muestras humanas están sujetas a muchas cuestiones éticas. En cambio, conejos han sido y siguen siendo los más utilizados las especies animales para demostrar que el trasplante de MSCs puede reparar el daño de cartílago. En los últimos años un número creciente de investigadores ha estudiado las células madre mesenquimales conejo (rbMSCs) ambos en vitro y en vivo, como estas células son MSCs similares al ser humano en su fisiología celular biología y tejido. Asimismo, los rbMSCs son capaces de adherirse a las superficies plásticas, mostrando morfología de fibroblastos fusiformes en MSCs humanos. Además, las muestras mesenquimales conejo son simples y fáciles de obtener7. Además, los puntos más importantes son que rbMSCs expresan marcadores de superficie, como el CD44, CD90, CD105, y que se conserva la diferenciación multilineal potencial, que está de acuerdo con los criterios para la identificación de las poblaciones de MSC como definido por la sociedad internacional de terapia celular8,9. En particular, son capaces de condrogénesis no hipertrófica cuando inducida por TGF-β1, así haciéndolos fuentes celular adecuado para el cartílago articular fenotípicamente regeneración10,11, chondroprogenitors líquidos sinoviales 12.

Sin embargo, el aislamiento de SF-MSCs es mucho diferente de otros tejidos, incluyendo el cordón umbilical, tejido adiposo, sangre periférica y médula ósea. Actualmente, los enfoques más comunes para la purificación y separación de SF-MSCs son citometría de flujo y basado en grano separación inmunomagnética, aunque el método de citometría de flujo requiere un entorno específico y altamente costosos instrumentos13.

Este artículo presenta un procedimiento para la recolección simple y mínimamente invasivo de muestras de líquido sinovial de Nueva Zelanda conejos blancos. Durante el procedimiento, los MSCs rbSF estable expandida en vitro y entonces aislaron con CD90 positivos procedimientos magnéticos basados en grano. Por último, el protocolo muestra cómo se obtiene MSCs con alta pureza y viabilidad de las fuentes de células cosechadas.

En el presente Protocolo, el aislado rbSF-MSCs se caracterizan basado en su morfología, expresión de marcadores específicos y pluripotencia de células madre. Immunophenotyping de basados en citometría de flujo revela una expresión positiva significativa de CD44 y CD105, mientras que la expresión de CD45 y CD34 es negativa. Por último, un ensayo en vitro para MSCs rbSF demuestra la diferenciación osteogénica adipogenic y condrogénica de estas células.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron conforme a las directrices regionales del Comité de ética, y todos los procedimientos animales fueron aprobados por las institucional Animal Care y uso Comité de Shenzhen segundo pueblo de Hospital, Universidad de Shenzhen.

1. aislar y cultura rbSF-MSCs

  1. Preparaciones para el procedimiento de animales
    1. Preparar esqueléticamente maduros mujer Nueva Zelanda conejos blancos para la colección de rbSF-MSCs. realizar un examen clínico de los conejos, un día antes del procedimiento anestesia y artrocentesis.
      Nota: debe incluir exámenes físicos peso (2.0-2.5 kg), género (mujer) y temperatura corporal, frecuencia respiratoria y frecuencia cardíaca. Parámetro intervalos para conejos clínicamente sanos son 30-50 min para tarifa de respiración, 220-280 min de ritmo cardíaco y 38-39 º C de temperatura corporal.
    2. Rápidamente los animales de 6 h antes de la anestesia.
  2. Preparación y procedimiento de la anestesia animal
    1. Refrenar el conejo con una jaula (véase Tabla de materiales) y luego inyectar 3% pentobarbital sódico en la vena marginal de la oreja en una dosis de 1 mL/kg para anestesia general.
    2. Coloque el conejo en una posición dorsal reclinada cómoda.
    3. Vigilar la frecuencia respiratoria, frecuencia cardíaca y temperatura corporal del conejo durante la anestesia.
    4. Utilice pomada oftalmológica en sus ojos para evitar la sequedad durante la anestesia.
    5. Evaluar la profundidad de la anestesia después clasificación14 de Guedel.
  3. Preparación para el cultivo y aislamiento de MSCs
    1. Para cultivar rbSF MSCs, preparar 500 mL de medio de cultivo comercial (véase Tabla de materiales) suplementado con 10% comercial suplemento (véase Tabla de materiales), 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% penicilina-estreptomicina.
    2. Incubar el medio de cultivo a 37 ° C en un baño de agua.
    3. Preparar 500 mL de solución salina buffer fosfato (PBS) para aislamiento de células y lavado de células.
    4. Preparar 100 mL de solución salina isotónica para el procedimiento de artrocentesis de rodilla cavidad.
  4. Colección de uid to sinovial intra-articular de la rodilla del conejo
    1. Seleccione un área de 5 x 5 cm de tamaño alrededor de la rodilla y afeitar el pelo del conejo de esta zona usando una máquina de afeitar eléctrica de seguridad.
    2. Alternativamente, desinfectar el sitio del procedimiento 3 x con povidona yodo solución y 75% etanol. Luego, aplicar cortinas estériles cuando la zona se haya secado completamente.
    3. Inyectar 1-2 mL de solución salina isotónica, con una jeringa hipodérmica estéril (2 mL), en la cavidad articular de la rodilla desde el espacio articular lateral, movimiento de la rodilla 3-4 x y luego aspirar hacia fuera todo el líquido sinovial a temperatura ambiente.
    4. Filtro de la fluid sinovial a través de un colador de celular de nylon 40 μm para remover cualquier suciedad dentro de 4 h.
  5. Cultura de las MSCs rbSF
    1. Recoger el filtrado fluid en tubos de centrífuga de 50 mL y centrifugar a 1.500 rpm por 10 min a temperatura ambiente.
    2. Desechar el sobrenadante después de la centrifugación, lavar el sedimento con PBS, Resuspender el precipitado con el medio de cultivo completo y entonces el medio en platos de 100 mm de la placa.
    3. Incubar las placas a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% CO2.
    4. Después de 48 h, reponer los platos con medio fresco para eliminar cualquier célula no adherente. Reemplazar el medio dos veces a la semana durante 2 semanas como paso 0 (P0).
      Nota: Debe haber cerca de 1 x 104 células adherentes. Células viable/ml en SF son aproximadamente 2 x 102/ml.
    5. Después de 14 días después de la chapa inicial, muchas colonias deben han formado en los platos de la cultura. Seleccione las colonias mayores de 2 mm de diámetro. Marque donde se encuentran las colonias seleccionadas por trazar su circunferencia en la parte inferior del plato.
    6. Deseche las colonias < 2 mm de ancho, utilizando raspadores de células. Digerir las colonias seleccionadas con 5 μl de tripsina 0.25%, utilizando un cilindro de clonación y transferir las colonias a una nueva placa como paso 1 (P1).
  6. Cuidado postoperatorio de los animales
    1. Siga los procedimientos estándar de operación institucionales para el seguimiento postoperatorio y recuperación de la anestesia.
    2. Monitorear los signos vitales del conejo cada 10 minutos hasta que ha recuperado la conciencia. Finalmente, transferir el animal consciente a la jaula. No devuelva un conejo que ha experimentado la cirugía para la compañía de otros animales hasta que haya recuperado completamente.
    3. Después de la operación, desinfectar la zona con povidona yodo al 0.1%, 2 x al día durante 3 días.

2. CD90-positivo magnético activado celular clasificación (MACS) de la cultura primaria y MSCs rbSF

  1. Preparación de la muestra
    1. Cuando las células alcanzan alrededor de 80% de confluencia, aspirar el medio y luego añadir 1-2 mL de 0.25% tripsina-EDTA a cada plato.
    2. Incubar los platos para 2-3 min permitir la separación de la célula.
    3. Una vez que las células son separadas, añadir una cantidad igual de medio de cultivo para hacer inactivo de la tripsina.
    4. Pasar la suspensión celular a través de un tamiz de 40 μm celular, recoger el filtrado en un tubo de 15 mL y luego girar por las células a 600 × g por 10 min a temperatura ambiente.
    5. Resuspender el precipitado de células en MACS corriendo buffer (PBS, pH 7.2, 0.5% albúmina de suero bovino y 2 mM EDTA) y luego contar el número de celular.
  2. Etiquetado magnético
    Nota: Ordenar los MSCs rbSF con una célula activada por el magnético clasificación kit de columnas, un soporte y separadores (véase Tabla de materiales).
    1. Determinar el número de celular utilizando un hemocitómetro.
    2. Centrifugar la suspensión celular en 300 × g por 10 min a 4 ° C. Aspire completamente el sobrenadante.
    3. Añadir 80 μl de buffer de resuspensión por 107 de células totales.
    4. Para 107 de células totales, añadir 20 μl de conjugado con un anticuerpo monoclonal de CD90 anti-conejo microbeads.
    5. Mezclar los granos magnéticos y células uniformemente en los tubos, luego incubar a 4 ° C durante 15 min en la oscuridad.
    6. Añadir 1 mL de buffer por 107 células en el tubo y luego la centrifugar a 300 × g por 10 min a 4 ° C para lavar las células. Desechar el sobrenadante después de la centrifugación.
    7. Resuspender el precipitado en 500 μl de buffer por 107 células.
  3. Separación magnética
    1. Coloque la columna con las alas de la columna al frente en el campo magnético del separador magnético.
    2. Enjuagar la columna separador magnético (MS) con 500 μl del buffer por 107 células.
    3. Transferir la suspensión sola celda en la columna. Que las células negativas pasan por el campo magnético para desechar estas células sin etiqueta.
    4. Lavar la columna 1-2 x con 500 μl del buffer por 107 células y descartar el flujo a través.
    5. Transferencia de la columna en un tubo de centrífuga (15 mL).
    6. Añada 1 mL de buffer por 107 células en la columna y entonces inmediatamente empuje el émbolo en la columna para eliminar las células magnéticamente etiquetadas.
    7. Repita el procedimiento anterior con una segunda columna MS para aumentar la pureza de CD90+ las células, que pueden enriquecer la fracción eluída.
    8. Centrifugar la suspensión celular en 300 × g durante 10 minutos, aspirar el sobrenadante y resuspender con el medio de cultivo.
  4. Cultura de la CD90+ rbSF MSCs
    1. Inocular las células en los platos de 100 mm después de la clasificación magnética celular activado.
    2. Incubar las placas a 37 ° C en un incubador celular humidificada con 5% CO2.
    3. Cuando se consigue el 80-90% de confluencia de la cultura primaria, en unos 7-10 días, digerir las células adherentes con 0.25% tripsina-EDTA y paso a una dilución de 1:2 para hacer el paso 2 (P2).
    4. Utilice el mismo método para pasar las células a paso 3 (P3), que pueden ser utilizadas para las pruebas en vitro .
      Nota: Después de la subcultura y la purificación, se obtienen aproximadamente 1 x 107 rbSF-MSCs.

3. identificación de MSCs rbSF

  1. Confirmación de marcador superficial de las rbSF MSCs mediante citometría de flujo
    1. Cuando las MSCs son 80-90% confluente en P3, lavan las células con PBS y tratar con 1 mL de 0.25% tripsina-EDTA. Luego, incubar las MSCs a 37 ° C durante 2-3 min hasta que las células son separadas.
    2. Cosecha de las células, usando 10 mL de PBS, transferir a un tubo cónico (15 mL) y centrifugar a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    3. Deseche el sobrenadante. Resuspender el precipitado de células en 500 μl de PBS y transferir a un tubo de 1,5 mL.
    4. Incubar una dilución 1: 100 del conjugado con FITC y PE-conjugado anticuerpos (isotipo, FITC-CD34/PE-CD45, FITC-CD105/PE-CD44) por 1 h en la oscuridad a 4 ° C.
    5. Centrifugar la mezcla a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente y lavan las células dos veces con PBS por centrifugación a 300 x g durante 5 minutos cada vez. Deseche el sobrenadante.
    6. Resuspender las células en 500 μl de PBS, transfiera la suspensión de células en un tubo de fondo redondo (5 mL) y analizarlos utilizando un citómetro de flujo.
      Nota: Adquirir datos en un citómetro equipado con dos canales de fluorescencia: 533/30 y 585/40. Para cada isotipo de la fluorescencia, utilice el control de isotipo para regular el voltaje del láser adecuado y ajustar la intensidad mínima necesaria para obtener un histograma de fluorescencia que muestra los bordes izquierdo y derecho del pico. Recoger un mínimo de 10.000 eventos para los análisis estadísticos.
  2. Multidifferentiation de las MSCs rbSF
    Nota: Uso P3 rbSF-MSCs para los ensayos de multidifferentiation en vitro .
    1. Diferenciación osteogénica
      1. Preparar el medio de inducción osteogénica: DMEM basic (1 x) que contiene 50 mM de L-ascórbico ácido-2-fosfato 10 mM de α-glicerofosfato y 100 nM de la dexametasona.
      2. Las células en 103 células/cm2 en una placa de cultivo de tejidos 6 bien la semilla y de la cultura en el medio de inducción osteogénica.
      3. Cambiar el medio de inducción cada 3 días durante 3 semanas.
      4. Fijar las células con formaldehído al 4% durante 30 min a temperatura ambiente una vez finalizada la diferenciación, las células de tinción con rojo de alizarina 1% por 5 min y lavar luego ellos 3 x con PBS15.
    2. Diferenciación de Adipogenic
      1. Preparar el medio de inducción de adipogenic: DMEM basic (1 x) que consta de 100 mM de indometacina 10 mg/mL de insulina humana recombinante, 1 mM de dexametasona y 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina.
      2. Tratar el P3 rbSF-MSCs para 3 semanas en el medio de inducción de adipogenic.
      3. Después de 3 semanas, mancha las vacuolas del lípido neutral usando aceite rojo O para confirmar la diferenciación adipogenic. Fijar las células en una solución de formaldehído 4% durante 30 min a temperatura ambiente y luego lavar 3 veces con PBS16.
    3. Diferenciación condrogénica
      1. Preparar el medio de inducción condrogénica: DMEM basic (1 x) que consta de 10 ng/mL de TGFβ1, 1% de su suplemento, 0.35 m m de la L-Prolina, 100 nM de dexametasona, 50 mM de L-ascórbico ácido-2-fosfato y 1 mM de piruvato de sodio.
      2. Utilizar pellets de cultivo para la inducción condrogénica. Centrifugar 5 × 105 P3 rbSF-MSCs a 1500 rpm durante 10 min en un tubo de polipropileno (15 mL) para formar un pellet.
      3. La cultura las pastillas durante 3 semanas con el medio de inducción condrogénica.
      4. Cambiar el medio cada 3 días durante 3 semanas.
      5. Después de la inducción de 3 semanas, incrustar el sedimento celular con parafina, sección en rodajas de 4 mm y con 0.1% de la mancha azul de toluidina durante 30 min a temperatura ambiente de17.
  3. Extracción de RNA total y análisis por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR)
    1. Aislar el ARN total de las células después de la inducción de la diferenciación de 3 semanas usando la extracción de RNA comercial kit (véase Tabla de materiales).
      1. Retire el medio de cultivo en la placa de cultivo y añadir 1 mL de reactivo de aislamiento.
      2. Lyse las células mediante pipeteo repetido hasta que la solución es homogénea. Incubar a temperatura ambiente durante 3 minutos.
      3. Transferir el lisado de células en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
      4. Añada 100 μl de cloroformo, agitar por 15 x mano e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 3 minutos.
      5. Centrifugar el tubo a 12.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL.
      6. Añadir 500 μl de isopropanol y precipitar el ARN durante 10 min a temperatura ambiente.
      7. Centrifugar a 12.000 g del × de minat 10 4 ° C. El pellet de RNA debe ser visible en la parte inferior del tubo.
      8. Quite el sobrenadante y añadir 500 μl de etanol 75%. Brevemente, haga girar el tubo durante varios segundos para lavar el pellet de RNA. Centrifugue a 7.500 × g por 5 min a 4 ° C.
      9. Eliminar el etanol residual.
      10. Disolver el pellet de RNA en 10 μl de agua DEPC y coloque los tubos en hielo.
    2. Inversa transcribir ARN en ADNc con una síntesis de la DNA kit (véase Tabla de materiales).
      Nota: Realice los siguientes procedimientos en el hielo.
      1. Preparar la mezcla principal de reversa de la transcripción.
      2. Añada 25 μl de RNA tratado con DNasa a cada tubo con 1 μg de ARN.
      3. Incubar la mezcla a las temperaturas siguientes utilizando un termociclador PCR: 26 ° C durante 10 minutos (para permitir el random hexamers a Recueza), 42 ° C por 45 min (transcripción reversa) y 75 ° C durante 10 minutos (inactivar la transcriptasa inversa).
      4. Inmediatamente analizar la resultante cDNA por PCR cuantitativa en tiempo real y almacenar a-20 ° C.
    3. Realizar el análisis de expresión génica con un sistema PCR en tiempo real cuantitativo.
      1. Uso de qRT-PCR Master Mix (véase Tabla de materiales) para llevar a cabo la polimerización en cadena. Los cebadores PCR de GAPDH, Runx2, Agg y PPARy se enumeran en la tabla 1.
      2. Calcular la expresión del gen mediante el métodoΔΔCT 2−.
      3. Realizar un análisis estadístico utilizando el software estadístico estándar. Use una prueba t de muestras independientes para comparar las medias de grupo.

Resultados

Aislamiento, purificación y la cultura de las rbSF MSCs:
Este protocolo utiliza MACS para aislar rbSF-MSCs, basados en la expresión del marcador de superficie MSC CD90. Figura 1muestra un diagrama de flujo proceso de rbSF-MSCs aislamiento, purificación, caracterización y el protocolo de cultivo en vitro .

Morfología de la célula después de la célula activ...

Discusión

La existencia de las MSCs en el líquido sinovial proporciona una alternativa para la terapia celular. Estudios anteriores han demostrado que lesiones sitios contienen cantidades más altas de células madre mesenquimales en su líquido sinovial, que puede ser correlacionado positivamente con el período posterior a la lesión5. El MSCs en el líquido sinovial pueden ser beneficiosos al tejido para mejorar la curación espontánea después de una lesión18,

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado financieramente por las siguientes becas: la Fundación de Ciencias naturales de China (no. 81572198; Nº 81772394); el fondo para la construcción de alto nivel disciplina médica de la Universidad de Shenzhen (Nº 2016031638); la Fundación de investigación médica de la provincia de Guangdong, China (no. A2016314); Shenzhen Ciencia y tecnología proyectos (no. JCYJ20170306092215436; No. JCYJ20170412150609690; No. JCYJ20170413161800287; No. SGLH20161209105517753; No. JCYJ20160301111338144).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
MesenGroStemRDMGro-500 1703Warm in 37 °C water bath before use
MesenGro SupplementStemRDMGro-500 M1512Component of MSCs culture medium
DMEM basicGibco Inc.C11995500BTMSCs differentiation medium
Isotonic saline solutionLitai, China5217080305Cavity arthrocentesis procedure reagent
Phosphate-Buffered Saline (PBS)HyClone Inc.SH30256.01BPBS, free of Ca2+/Mg2+
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco Inc.10099-141Component of MSCs culture medium
Povidone iodine solutionGuangdong, China150605Sterilization agent
75% ethanolLircon, china170917Sterilization agent
0.25% Trypsin/EDTAGibco Inc.25200-056Cell dissociation reagent
1% Penicillin-StreptomycinGibco Inc.15140-122Component of MSCs medium
MACS Running BufferMiltenyiBiotec5160112089Containing phosphate-buffered saline (PBS), 0.5% bovine serum albumin(BSA), and 2 mMEDTA
CD90 antibody conjugated MicroBeadsMiltenyiBiotec5160801456For magnetic activated cell sorting
Sodium pyruvateSigma-AldrichP2256Component of MSCs chondrogenic differentiation
DexamethasoneSigma-AldrichD1756Component of MSCs osteogenic differentiation
ITSBD3543521%, Component of MSCs chondrogenic differentiation
L-prolineSigma-AldrichP56070.35 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation
L-ascorbic acid-2-phosphateSigma-AldrichA896050 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation
3-isobutyl-1-methylxanthineSigma-AldrichI58790.5 mM, Component of adipogenic differentiation
IndomethacinSigma-AldrichI7378100 mM, Component of adipogenic differentiation
TGFβ1Peprotech100-2110 ng/mL, Component of MSCs chondrogenic differentiation
α-glycerophsphateSigma-AldrichG6751Component of MSCs osteogenic differentiation
CD34 Polyclonal Antibody, FITC ConjugatedBiossbs-0646R-FITCHematopoietic stem cells marker
Mouse antirabbit CD44Bio-RadMCA806GAThy-1 membrane glycoprotein (MSCs marker)
CD45 (Monoclonal Antibody)Bio-RadMCA808GAHematopoietic stem cells marker
CD105 antibodyGenetexGTX11415MSCs marker
Isopropyl alcoholSigma-AldrichI9030Precipitates RNA extraction organic phases
TrichloromethaneWenge, China61553Extract total RNA
TrizolInvitrogen15596-018Isolate total RNA
SYBR green master mixTakara Bio, JapanRR420APCR test
cDNA synthesis kitTakara Bio, JapanRR047AReverse-transcribed to complementary DNA
Alizarin RedSigma-AldrichA5533Staining of calcium compounds
Toluidine BlueSigma-Aldrich89640Staining of cartilaginous tissue
Oil Red O solutionSigma-AldrichO1391LLipid vacuole staining
Equipment
MiniMACS SeparatorMiltenyiBiotec130-042-102For magnetic activated cell sorting
MultiStandMiltenyiBiotec130-042-303For magnetic activated cell sorting
MS ColumnsMiltenyiBiotec130-042-201For magnetic activated cell sorting
Cell StrainerFALCON Inc.35234040 μm nylon
HemocytometerISOLAB Inc.075.03.001Cell counting
Falcon 100 mm dishCorning353003Cell culture dish
Microcentrifuge tubeAxygenMCT-150-CRNA Extraction and PCR
Centrifuge TubesSigma-Aldrich91050Gamma-sterilized
High-speed centrifugeEppendorf5804RCentrifuge cells
Carbon dioxide cell incubatorThermo scientific3111Cell culture
Real-Time PCR InstrumentLife TechQuantStudioReal-Time quantitative polymerase chain reaction
Flow cytometerBD Biosciences342975Cell analyzer
PipettorEppendorfO25456FTransfer the liquid
Cloning cylinderSigma-AldrichC3983-50EAIsolate and pick individual cell colonies
Sterile hypodermic syringeDouble-Dove, China131010Arthrocentesis procedure
Rabbit cageZhike, ChinaZC-TGDRestrain the rabbit

Referencias

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