Cellule magnétique activé tri des stratégies visant à isoler et purifier Synovial fluide mésenchymateuses cellules souches dérivées d’un modèle de lapin

Résumé

Cet article présente un protocole simple et économique pour la simple isolation et la purification de cellules souches mésenchymateuses du liquide synovial de Nouvelle-Zélande lapin blanc.

Résumé

Cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont la source principale de cellule pour la thérapie cellulaire. MSCs du fluide synovial de la cavité articulaire susceptibles de servir pour l’ingénierie tissulaire du cartilage. MSCs de liquide synovial (SF-MSCs) ont été considérés comme des candidats prometteurs pour la régénération articulaire, et leur bénéfice thérapeutique potentiel a fait d’eux un sujet de recherche importants de la fin. SF-MSCs de la cavité du genou les lapins blancs de Nouvelle-Zélande peuvent être utilisés comme un modèle optimisé translationnel afin d’évaluer la médecine régénérative humaine. Au moyen de base CD90 cell activé magnétique tri technologies (MACS), ce protocole avec succès obtient lapin SF-MSCs (rbSF-MSCs) de ce modèle de lapin et plus pleinement montre le phénotype de la maîtrise de ces cellules par incitant à faire la différence à ostéoblastes, les adipocytes et les chondrocytes. Par conséquent, cette approche peut être appliquée dans la recherche en biologie cellulaire et ingénierie tissulaire en utilisant des procédures et des équipements simples.

Introduction

MSCs ont été proposées comme une source précieuse pour la médecine régénérative, surtout pour les lésions du cartilage. MSCs, y compris les chondrocytes, ostéoblastes, adipocytes, myocytes squelettiques et viscérales cellules stromales, étendre largement les zones destinés à la transplantation de cellules souches en raison de leur forte expansion taux et lignées multiples différenciation possibles¹. MSCs peuvent être isolés dans le squelette musculaire, membrane synoviale, la moelle osseuse et le tissu adipeux^2,3,4. Résultats ont confirmé aussi la présence de MSCs dans le liquide synovial, et des recherches antérieures a identifié MSCs de dérivés de liquide synoviales (SF-MSCs) comme candidats prometteurs pour régénération articulaire^5,6.

Cependant, recherche et expérimentation préclinique sur échantillons humains sont soumis à nombreuses questions éthiques. Au lieu de cela, les lapins ont été et continuent d’être le plus couramment utilisé des espèces animales pour démontrer que la transplantation de MSCs peut réparer les lésions du cartilage. Ces dernières années, un nombre croissant de chercheurs ont étudié les cellules souches mésenchymateuses de lapin (rbMSCs) les deux in vitro et in vivo, que ces cellules sont semblables aux humains MSCs dans leur physiologie cellulaire de la biologie et de tissus. De même, les rbMSCs sont capables d’adhérer aux surfaces plastiques, affichant la morphologie de la broche-fibroblaste comme dans MSCs humaines. En outre, les échantillons mésenchymateuses lapin sont simples et faciles à obtenir⁷. En outre, les points cruciaux sont que rbMSCs expriment des marqueurs de surface, telles que CD44 CD90 et CD105, et que la différenciation des lignées multiples potentielle est préservée, ce qui est en accord avec les critères d’identification des populations de MSC comme défini par la société internationale de thérapie cellulaire^8,9. En particulier, chondroprogenitors fluides synoviales sont capables de non-hypertrophique chondrogenèse lorsque induite par le TGF-β1, rendant les sources cellulaire appropriée pour le cartilage articulaire phénotypiquement régénération^{10,11, 12}.

Toutefois, l’isolement de SF-MSCs est très différent des autres tissus, y compris le cordon ombilical, le tissu adipeux, sang périphérique et la moelle osseuse. Actuellement, les approches courantes pour la purification et le tri des SF-MSCs sont cytométrie en flux et immunomagnetic axée sur la perle tri, bien que la méthode de cytométrie de flux nécessite un environnement spécifique et très coûteux instruments¹³.

Cet article présente une procédure simple et peu invasive recueillir des échantillons de liquide synovial de Nouvelle Zélande lapins blancs. Au cours de la procédure, les rbSF-MSCs sont solidement développé in vitro et ensuite isolement avec CD90 positives procédures fondées sur les perles magnétiques. Enfin, le protocole montre comment obtenir les MSCs avec une grande pureté et de la viabilité dans les sources de cellules récoltées.

Dans le présent protocole, les rbSF-CSM isolées sont caractérisés basé sur leur morphologie, l’expression de marqueurs spécifiques et la pluripotence des cellules souches. Immunophénotypage axée sur la cytométrie de flux révèle une expression positive significative du CD44 et CD105, tandis que l’expression de CD45 et CD34 est négative. Enfin, un essai in vitro avec de rbSF-MSCs montre la différenciation ostéogénique, adipocytaire et chondrogéniques de ces cellules.

Protocole

Toutes les expériences sur des animaux ont été menées selon les directives d’éthique Comité régionales, et toutes les procédures d’animaux ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité Shenzhen deuxième populaire de l’hôpital, Université de Shenzhen.

1. isoler et Culture les rbSF-CSM

1. Préparatifs de la procédure de l’animale
   1. Préparer le squelette-mature femme Nouvelle Zélande lapins blancs pour la collecte de rbSF-MSCs. effectuer un examen clinique des lapins un jour avant la procédure anesthésie et arthrocentèse.
      Remarque : les examens physiques devrait inclure poids (2,0 à 2,5 kg), sexe (féminin) et température corporelle, rythme respiratoire et cardiaque. Intervalles de paramètre pour les lapins cliniquement sains sont 30 à 50 min pour le taux de respiration, 220-280 min pour la fréquence cardiaque et 38-39 ° C pour la température du corps.
   2. Rapidement les animaux pendant 6 h avant l’anesthésie.
2. Préparations et procédure pour l’anesthésie des animaux
   1. Retenir le lapin avec une cage (voir Table des matières) et ensuite injecter 3 % pentobarbital sodique dans la veine marginale oreille à une dose de 1 mL/kg pour l’anesthésie générale.
   2. Placer le lapin dans une position dorsale-position allongée confortable.
   3. Surveiller la fréquence respiratoire, fréquence cardiaque et la température corporelle du lapin pendant l’anesthésie.
   4. La pommade ophtalmologique sur ses yeux pour prévenir le dessèchement pendant l’anesthésie.
   5. Évaluer la profondeur de l’anesthésie après classification^{14 de Guedel}.
3. Préparation pour MSCs isolement et culture
   1. Pour cultiver rbSF-MSCs, préparer 500 mL de milieu de culture commercial (voir Table des matières) additionné de 10 % commercial supplément (voir Table des matières), 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % la pénicilline-streptomycine.
   2. Incuber le milieu de culture à 37 ° C dans un bain d’eau.
   3. Préparer 500 mL d’une solution saline du tampon phosphate (PBS) pour l’isolation de cellules et le lavage de la cellule.
   4. Préparer 100 mL d’une solution saline isotonique pour la procédure d’arthrocentèse cavité du genou.
4. Collection d’uid fl synovial articulaire du genou du lapin
   1. Sélectionnez une zone de 5 x 5 cm environ en taille autour du genou et se raser les poils de lapin de ce domaine à l’aide d’un rasoir électrique de sécurité.
   2. Vous pouvez également désinfecter le site de la procédure 3 x avec la povidone iode solution et 75 % d’éthanol. Après que la zone est complètement sèche, appliquer stérile drape.
   3. Injecter 1 à 2 mL de solution saline isotonique, à l’aide d’une seringue hypodermique stérile à (2 mL), dans la cavité articulaire du genou de l’espace articulaire latérale, déplacer le genou 3-4 x et puis aspirer tout le liquide synovial à température ambiante.
   4. Le liquide synovial filtrer sur un filtre de cellule en nylon à 40 µm pour enlever tous les débris dans les 4 h.
5. Culture des rbSF-MSCs
   1. Recueillir le liquide filtré dans des tubes à centrifuger 50 mL et centrifuger à 1 500 tr/min pendant 10 min à température ambiante.
   2. Jeter le surnageant après la centrifugation, laver le culot avec du PBS, resuspendre le culot avec le milieu de culture complet et la plaque puis le milieu en boîtes de 100 mm.
   3. Incuber les boîtes à 37 ° C en atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂.
   4. Après 48 h, reconstituer les plats avec un milieu frais pour enlever toutes les cellules non adhérentes. Remplacer le milieu deux fois par semaine pendant 2 semaines comme passage 0 (P0).
      Remarque : Il devrait y avoir environ 1 x 10⁴ cellules adhérentes. Cellules viables/ml en SF sont environ 2 x 102/ml.
   5. Après 14 jours après l’ensemencement initial, beaucoup de colonies si a formé dans les récipients de culture. Sélectionner les colonies plus de 2 mm de diamètre. Marquez l’endroit où se trouvent les colonies sélectionnées en traçant leur circonférence sur le fond du plat.
   6. Jeter les colonies < 2 mm de large, à l’aide de grattoirs à cellules. Digérer les colonies sélectionnés environ 5 µl de 0,25 % de trypsine, à l’aide d’un cylindre de clonage et transférer les colonies à un nouveau plat comme passage 1 (P1).
6. Soins post-opératoires des animaux
   1. Conformément aux procédures standard institutionnel d’exploitation pour la surveillance post-opératoire et de l’anesthésie.
   2. Surveiller les signes vitaux du lapin toutes les 10 min jusqu'à ce qu’il a repris connaissance. Enfin, transférer l’animal conscient à la cage. Ne retournez pas un lapin qui a subi une chirurgie à la compagnie des autres animaux jusqu'à ce qu’elle a entièrement récupéré.
   3. Après l’opération, désinfecter le site avec 0,1 % polyvidone iodée, 2 fois par jour pendant 3 jours.

2. CD90 séropositifs magnétique activé cellule Tri (CMA) du rbSF-MSCs et Culture primaire

1. Préparation des échantillons
   1. Lorsque les cellules atteignent près de 80 % confluence, aspirer le milieu et puis ajoutez 1 à 2 mL de 0,25 % trypsine-EDTA à chaque plat.
   2. Incuber les plats pendant 2-3 min afin de permettre le détachement de la cellule.
   3. Une fois que les cellules sont détachent, ajouter une quantité égale de milieu de culture pour inactiver la trypsine.
   4. Passer la suspension cellulaire à travers un tamis de cellule de 40 µm, recueillir le filtrat dans un tube de 15 mL et ensuite filer vers le bas les cellules à 600 × g pendant 10 min à température ambiante.
   5. Resuspendre le culot dans MACS tampon (PBS, pH 7,2, 0,5 % d’albumine sérique bovine et 2 mM EDTA) et ensuite compter le nombre de cellules.
2. Marquage magnétique
   NOTE : Trier les rbSF-CSM avec une cellule magnétique activé tri trousse contenant des colonnes, un stand et les séparateurs (voir Table des matières).
   1. Déterminer le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
   2. Centrifuger la suspension de cellules à 300 × g pendant 10 min à 4 ° C. Totalement aspirer le surnageant.
   3. Ajouter 80 µL de tampon de resuspension par 10 cellules total⁷ .
   4. Pour 10 cellules total⁷ , ajouter 20 µL de microbilles conjugué avec un anticorps monoclonal de CD90 anti-lapin.
   5. Mélanger les billes magnétiques et les cellules uniformément dans les tubes, puis les incuber à 4 ° C pendant 15 minutes dans l’obscurité.
   6. Ajouter 1 mL de tampon par 10⁷ cellules dans le tube et centrifuger à 300 × g pendant 10 min à 4 ° C pour laver les cellules. Jeter le surnageant après la centrifugation.
   7. Resuspendre le culot dans 500 µL de tampon par 10⁷ cellules.
3. Séparation magnétique
   1. Placer la colonne avec les ailes de la colonne vers l’avant dans le champ magnétique du séparateur magnétique.
   2. Rincer la colonne séparateur magnétique (MS) avec 500 µL de tampon par 10⁷ cellules.
   3. Transférer la suspension de la cellule dans la colonne. Laisser les cellules négatives passent par le champ magnétique de se défaire de ces cellules sans étiquette.
   4. Laver la colonne x 1-2 avec 500 µL de tampon par 10⁷ cellules et éliminer les intermédiaires.
   5. Transférer la colonne dans un tube à centrifuger (15 mL).
   6. Ajouter 1 mL de tampon par 10⁷ cellules de la colonne et immédiatement pousser le piston dans la colonne afin d’éliminer les cellules magnétiquement étiquetées.
   7. Répétez la procédure ci-dessus avec un MS Column d’augmenter la pureté du CD90⁺ cellules, qui peuvent enrichir la fraction d’élution.
   8. Centrifuger la suspension de cellules à 300 × g pendant 10 min, aspirer le surnageant et remettre en suspension il au milieu de culture.
4. Culture de la CD90⁺ rbSF-MSCs
   1. Ensemencer les cellules en boîtes de 100 mm après le tri des cellules activées magnétique.
   2. Incuber les boîtes à 37 ° C dans un incubateur à cellules humidifié avec 5 % de CO₂.
   3. Lorsque la confluence de 80 à 90 % de la culture primaire est obtenue, à environ 7-10 jours, digérer les cellules adhérentes avec 0,25 % de trypsine-EDTA et passage à une dilution de 1 / 2 pour faire le passage 2 (P2).
   4. Utiliser la même méthode pour passer les cellules au passage 3 (P3), qui peuvent être utilisés pour les tests in vitro .
      Remarque : Après la sous-culture et la purification, on obtient environ 1 x 10⁷ rbSF-MSCs.

3. identification des rbSF-MSCs

1. Confirmation de marqueur de surface des rbSF-MSCs par cytométrie en flux
   1. Lorsque les MSCs sont confluents de 80 à 90 % à P3, laver les cellules avec du PBS et traitez-les avec 1 mL de 0,25 % trypsine-EDTA. Puis, incuber les MSCs à 37 ° C pendant 2-3 min jusqu'à ce que les cellules sont détachent.
   2. Récolter les cellules à l’aide de 10 mL de PBS, transférez-les dans un tube conique (15 mL) et les centrifuger à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
   3. Jeter le surnageant. Resuspendre le culot dans 500 µL de PBS et transférer dans un tube de 1,5 mL.
   4. Incuber une dilution au 1/100 de l’anticorps conjugué FITC et PE-conjugué (isotype, FITC-CD34/PE-CD45, FITC-CD105/PE-CD44) pendant 1 h dans l’obscurité à 4 ° C.
   5. Centrifuger ce mélange à 300 × g pendant 5 min à température ambiante et laver les cellules deux fois avec du PBS par centrifugation à 300 × g pendant 5 minutes chaque fois. Jeter le surnageant.
   6. Remettre en suspension les cellules de 500 µL de PBS, transférer la suspension de cellules dans un tube à fond rond (5 mL) et l’analyser à l’aide d’un cytomètre en flux.
      NOTE : Acquisition de données sur un cytomètre doté de deux canaux de fluorescence : 533/30 et 585/40. Pour chaque isotype de fluorescence, utilisez le contrôle de l’isotype d’ajuster la tension laser approprié et définir l’intensité minimale requise pour obtenir un histogramme de fluorescence qui affiche les bords gauche et droite du pic. Recueillir un minimum de 10 000 événements pour les analyses statistiques.
2. Multidifferentiation des rbSF-MSCs
   Remarque : Utilisation P3 rbSF-MSCs pour les dosages multidifferentiation in vitro .
   1. Différenciation ostéogénique
      1. Préparer le milieu ostéogénique induction : DMEM basic (1 x) contenant de 50 mM de phosphate-2-acide L-ascorbique, 10 mM de le α-glycérophosphate et 100 nM de dexaméthasone.
      2. Les cellules à 10³ cellules/cm² dans une plaque de culture de tissu de 6 puits de semences et leur culture dans le milieu de l’induction ostéogénique.
      3. Changer le milieu inducteur tous les 3 jours pendant 3 semaines.
      4. Fixer les cellules avec 4 % de formaldéhyde pendant 30 min à température ambiante après la différenciation est terminée, en détachant les cellules avec le rouge d’alizarine 1 % pendant 5 min et puis lavez les 3 x avec PBS¹⁵.
   2. Différenciation adipocytaire
      1. Préparer le milieu d’induction adipocytaire : DMEM basic (1 x), composé de 100 mM de l’indométhacine, 10 mg/mL de l’insuline humaine recombinante, 1 mM de la dexaméthasone et 0,5 mM de la 3-isobutyl-1-méthylxanthine.
      2. Traiter les P3 rbSF-CSM pendant trois semaines dans le milieu d’induction adipocytaire.
      3. Après 3 semaines, tacher les vacuoles de lipides neutres à l’aide de l’huile rouge O pour confirmer la différenciation adipocytaire. Fixer les cellules dans une solution de formaldéhyde de 4 % pendant 30 min à température ambiante et puis lavez-les 3 x avec PBS¹⁶.
   3. Différenciation chondrogéniques
      1. Préparer le milieu d’induction chondrogéniques : DMEM basic (1 x) composé de 10 ng/mL de TGFβ1, 1 % de son supplément, 0,35 mM de L-proline, 100 nM de dexaméthasone, 50 mM de L-ascorbique acide-2-phosphate et 1 mM de pyruvate de sodium.
      2. Utiliser le pellet mise en culture pour l’induction chondrogéniques. Centrifuger 5 × 10⁵ P3 rbSF-MSCs à 1500 tr/min pendant 10 min dans un tube en polypropylène (15 mL) pour former une boulette.
      3. Culture des granulés pendant 3 semaines avec le milieu d’induction chondrogéniques.
      4. Changer le support tous les 3 jours pendant 3 semaines.
      5. Après l’induction de 3 semaines, incorporer le culot cellulaire avec de la paraffine, section, il en tranches de 4 mm et détachant à l’aide de 0,1 % bleu de Toluidine pendant 30 min à température ambiante¹⁷.
3. Extraction de l’ARN totale et analyse quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR)
   1. Isoler l’ARN total des cellules après l’induction de la différenciation de 3 semaines en utilisant l’extraction de l’ARN commerciale nécessaire (voir la Table des matières).
      1. Enlever le milieu de culture dans la boîte de Petri et puis ajouter 1 mL de réactif de l’isolement.
      2. Lyse des cellules par pipetage répétées jusqu'à ce que la solution soit homogène. Il incuber à température ambiante pendant 3 min.
      3. Transvaser le lysat cellulaire dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
      4. Ajouter 100 µL de chloroforme, secouez-le par main 15 x et incuber le mélange à température ambiante pendant 3 min.
      5. Centrifuger le tube à 12 000 x g pendant 15 min à 4 ° C. Transvaser le surnageant dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL.
      6. Ajouter 500 µL d’isopropanol et précipiter l’ARN pendant 10 min à température ambiante.
      7. Centrifuger à 12 000 × g minat 10 4 ° C. Le culot de RNA devrait être visible au fond du tube.
      8. Retirez le surnageant et puis ajouter 500 µL d’éthanol 75 %. Brièvement, faites tourner le tube pendant plusieurs secondes pour laver le culot de RNA. Il centrifuger à 7 500 × g pendant 5 min à 4 ° C.
      9. Supprimer l’éthanol résiduel.
      10. Dissoudre le culot de RNA dans 10 µL d’eau DEPC et placer les tubes sur la glace.
   2. Marche arrière transcrire l’ARN total en ADNc avec une synthèse de l’ADN nécessaire (voir la Table des matières).
      Remarque : Effectuez toutes les procédures suivantes sur la glace.
      1. Préparer le mélange maître de la transcriptase inverse.
      2. Ajouter 25 µL d’ARN DNase traités dans chaque tube avec 1 µg d’ARN.
      3. Incuber le mélange aux températures suivantes à l’aide d’un thermocycleur PCR : 26 ° C pendant 10 min (pour permettre les hexamères aléatoire de recuire), 42 ° C pendant 45 min (transcriptase inverse) et à 75 ° C pendant 10 min (inactiver la transcriptase inverse).
      4. Immédiatement analyser l’ADNc obtenu par quantitative PCR en temps réel, ou conserver à-20 ° C.
   3. Effectuer l’analyse d’expression de gène avec un système de PCR quantitatif en temps réel.
      1. Utilisez qRT-PCR Master Mix (voir Table des matières) pour effectuer des PCR. Les amorces PCR pour GAPDH, Runx2, Agg et PPARγ sont énumérés au tableau 1.
      2. Calculer l’expression des gènes à l’aide de la méthode^ΔΔCT 2⁻.
      3. Procéder à une analyse statistique en utilisant un logiciel de statistique standard. Un échantillon indépendant t-test permet de comparer les moyens du groupe.

Résultats

Isolement, Purification et la Culture des rbSF-MSCs :
Ce protocole utilise des MACS d’isoler rbSF-MSCs, basés sur l’expression du marqueur de surface MSC CD90. Un diagramme de flux de processus d’isolement des rbSF-MSCs, purification et la caractérisation et le protocole de culture in vitro est illustré à la Figure 1.

Morphologie des cellules après de...

Discussion

L’existence de MSCs dans le liquide synovial offre une alternative pour la thérapie cellulaire. Des études antérieures ont montré que les blessures sites contiennent des quantités plus élevées de cellules souches mésenchymateuses dans leur liquide synovial, qui peuvent être positivement corrélée avec la période post-traumatique⁵. Les MSCs dans le liquide synovial peuvent être bénéfiques au tissu pour améliorer la cicatrisation spontanée après une blessure¹⁸

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
MesenGro	StemRD	MGro-500 1703	Warm in 37 °C water bath before use
MesenGro Supplement	StemRD	MGro-500 M1512	Component of MSCs culture medium
DMEM basic	Gibco Inc.	C11995500BT	MSCs differentiation medium
Isotonic saline solution	Litai, China	5217080305	Cavity arthrocentesis procedure reagent
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	HyClone Inc.	SH30256.01B	PBS, free of Ca2+/Mg2+
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Inc.	10099-141	Component of MSCs culture medium
Povidone iodine solution	Guangdong, China	150605	Sterilization agent
75% ethanol	Lircon, china	170917	Sterilization agent
0.25% Trypsin/EDTA	Gibco Inc.	25200-056	Cell dissociation reagent
1% Penicillin-Streptomycin	Gibco Inc.	15140-122	Component of MSCs medium
MACS Running Buffer	MiltenyiBiotec	5160112089	Containing phosphate-buffered saline (PBS), 0.5% bovine serum albumin(BSA), and 2 mMEDTA
CD90 antibody conjugated MicroBeads	MiltenyiBiotec	5160801456	For magnetic activated cell sorting
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256	Component of MSCs chondrogenic differentiation
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756	Component of MSCs osteogenic differentiation
ITS	BD	354352	1%, Component of MSCs chondrogenic differentiation
L-proline	Sigma-Aldrich	P5607	0.35 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation
L-ascorbic acid-2-phosphate	Sigma-Aldrich	A8960	50 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation
3-isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I5879	0.5 mM, Component of adipogenic differentiation
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378	100 mM, Component of adipogenic differentiation
TGFβ1	Peprotech	100-21	10 ng/mL, Component of MSCs chondrogenic differentiation
α-glycerophsphate	Sigma-Aldrich	G6751	Component of MSCs osteogenic differentiation
CD34 Polyclonal Antibody, FITC Conjugated	Bioss	bs-0646R-FITC	Hematopoietic stem cells marker
Mouse antirabbit CD44	Bio-Rad	MCA806GA	Thy-1 membrane glycoprotein (MSCs marker)
CD45 (Monoclonal Antibody)	Bio-Rad	MCA808GA	Hematopoietic stem cells marker
CD105 antibody	Genetex	GTX11415	MSCs marker
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	I9030	Precipitates RNA extraction organic phases
Trichloromethane	Wenge, China	61553	Extract total RNA
Trizol	Invitrogen	15596-018	Isolate total RNA
SYBR green master mix	Takara Bio, Japan	RR420A	PCR test
cDNA synthesis kit	Takara Bio, Japan	RR047A	Reverse-transcribed to complementary DNA
Alizarin Red	Sigma-Aldrich	A5533	Staining of calcium compounds
Toluidine Blue	Sigma-Aldrich	89640	Staining of cartilaginous tissue
Oil Red O solution	Sigma-Aldrich	O1391L	Lipid vacuole staining
Equipment
MiniMACS Separator	MiltenyiBiotec	130-042-102	For magnetic activated cell sorting
MultiStand	MiltenyiBiotec	130-042-303	For magnetic activated cell sorting
MS Columns	MiltenyiBiotec	130-042-201	For magnetic activated cell sorting
Cell Strainer	FALCON Inc.	352340	40 μm nylon
Hemocytometer	ISOLAB Inc.	075.03.001	Cell counting
Falcon 100 mm dish	Corning	353003	Cell culture dish
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C	RNA Extraction and PCR
Centrifuge Tubes	Sigma-Aldrich	91050	Gamma-sterilized
High-speed centrifuge	Eppendorf	5804R	Centrifuge cells
Carbon dioxide cell incubator	Thermo scientific	3111	Cell culture
Real-Time PCR Instrument	Life Tech	QuantStudio	Real-Time quantitative polymerase chain reaction
Flow cytometer	BD Biosciences	342975	Cell analyzer
Pipettor	Eppendorf	O25456F	Transfer the liquid
Cloning cylinder	Sigma-Aldrich	C3983-50EA	Isolate and pick individual cell colonies
Sterile hypodermic syringe	Double-Dove, China	131010	Arthrocentesis procedure
Rabbit cage	Zhike, China	ZC-TGD	Restrain the rabbit