从兔模型中分离纯化滑液源性间充质干细胞的磁活化细胞分选策略

摘要

本文提出了一种简单而经济的协议, 直接隔离和纯化新西兰白兔滑液间充质干细胞。

摘要

间充质干细胞 (MSCs) 是细胞治疗的主要细胞来源。关节腔滑液中的 MSCs 可能用于软骨组织工程。滑膜液中的骨髓间充质干细胞被认为是促进关节再生的候选者, 其潜在的治疗效果已成为晚期的一个重要研究课题。从新西兰白兔的膝腔中的 SF 干细胞可以作为一种优化的转化模型来评估人体再生医学。通过 CD90-based 磁活化细胞分选 (mac) 技术, 该协议成功地从该兔模型中获得了兔 SF-mscs (rbSF), 并通过诱导它们分化为进一步充分展示了这些细胞的 MSC 表型。成骨细胞, 脂肪细胞和软骨。因此, 这种方法可以应用于细胞生物学研究和组织工程中, 使用简单的设备和程序。

引言

骨髓间充质干细胞被认为是再生医学的宝贵来源, 尤其是软骨损伤。骨髓间充质干细胞, 包括软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞和内脏基质干细胞, 由于其高扩张率和多谱系分化潜能¹, 广泛扩大了干细胞移植的面积。MSCs 可从骨骼肌、滑膜、骨髓和脂肪组织中分离出^2、3、4。研究结果还 confirmed 了在滑膜液中的 MSCs 的存在, 先前的调查已经确定了滑膜液源性 mscs (SF-mscs) 作为关节再生^5、6的有望候选者。

然而, 人体标本的研究和前期实验受到许多伦理问题的影响。相反, 兔子一直是并且继续是最常用的动物种类表明, 骨髓间充质干细胞移植可以修复软骨损伤。近年来, 越来越多的研究人员研究了兔间充质干细胞 (rbMSCs)的体外和体内作用, 因为这些细胞在细胞生物学和组织生理学上与人的 MSCs 相似。同样, rbMSCs 能够附着在塑料表面, 显示纺锤体成纤维细胞形态, 如在人类 MSCs 中。此外, 家兔间充质样品简单易获得⁷。此外, 最关键的一点是, rbMSCs 明确的表面标记, 如 CD44, CD90, 和 CD105, 并认为多血统分化潜力保持, 这是符合标准的鉴定的 MSC 人口作为由国际社会为细胞疗法定义^8,9。特别是, 滑膜液生发能够在 TGF-β1诱导下的非肥厚软骨, 从而使其适合表型关节软骨再生^10,11的细胞源, ¹²。

然而, 与其他组织 (包括脐带、脂肪组织、外周血、骨髓) 的分离有很大的不同。目前, 采用流式细胞术和磁珠分选方法对 SF MSCs 进行纯化和分类是最常用的方法, 尽管流式细胞术法需要特定的环境和高成本的仪器¹³。

本文介绍了一种简便、微创的新西兰白兔滑液标本采集方法。在该过程中, rbSF-MSCs 在体外稳定扩张, 然后以 CD90 正磁珠为基础进行分离。最后, 该协议显示了如何从收获的细胞来源获得高纯度和生存能力的 MSCs。

在该协议中, 分离的 rbSF-MSCs 的特点是基于它们的形态学, 特定标记的表达, 和干细胞的干细胞。基于流式细胞术的免疫分型揭示了 CD44 和 CD105 的显著阳性表达, 而 CD45 和 CD34 的表达呈阴性。最后, 对 rbSF 骨髓间充质干细胞的体外测定表明了这些细胞的成骨、脂肪和软骨分化。

研究方案

所有动物实验都是按照区域伦理委员会的指导方针进行的, 所有动物程序都是由深圳市第二人民医院机构动物护理和使用委员会批准的。

1. 分离和培养 rbSF-MSCs

1. 准备为动物做法
   1. 制备 skeletally 成熟的新西兰雌性白兔, 用于收集 rbSF-MSCs. 在麻醉和冲洗术手术前一天对兔子进行一次临床检查。
      注: 体格检查应包括体重 (2.0-2.5 公斤)、性别 (女性)、体温、呼吸率和心率。临床健康家兔的参数间隔为呼吸率为 30-50 分钟, 心率为 220-280 分钟, 体温为 38-39 摄氏度。
   2. 在麻醉前将动物快速6小时。
2. 动物麻醉的准备和做法
   1. 用笼子约束兔子 (见材料表), 然后将3% 戊巴比妥钠注射到边缘耳静脉中, 剂量为1毫升/千克, 用于全身麻醉。
   2. 把兔子放在一个舒适的背卧位置。
   3. 监测麻醉期间家兔的呼吸速率、心率和体温。
   4. 在其眼睛上使用眼科软膏, 以防止麻醉时的干燥。
   5. 评估 Guedel 分类¹⁴后的麻醉深度。
3. MSCs 分离培养的制备
   1. 培养 rbSF-MSCs, 准备500毫升的商业培养基 (见材料表) 补充10% 商业补充 (见材料表), 10% 胎牛血清 (血清) 和1% 青霉素-链霉素。
   2. 在37摄氏度的水浴中孵化培养基。
   3. 准备500毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS), 用于细胞分离和细胞洗涤。
   4. 准备100毫升的等渗盐水溶液治疗膝关节腔冲洗术程序。
4. 兔膝关节关节滑膜fl uid 的采集
   1. 选择一个面积约 5 x 5 厘米的大小在膝盖周围和剃须从这个地区的兔毛使用安全电动剃须刀。
   2. 交替使用聚维酮碘溶液和75% 乙醇消毒程序现场3x。然后, 在该区域彻底干燥后应用无菌窗帘。
   3. 注射 1-2 毫升的等渗盐水溶液, 使用无菌皮下注射注射器 (2 毫升), 进入膝关节腔从外侧关节空间, 移动膝盖 3-4x, 然后吸出所有的滑液在室温下。
   4. 过滤滑膜fluid 通过40µm 尼龙细胞过滤器去除任何碎片在4小时内。
5. rbSF-MSCs 的培养
   1. 在室温下收集50毫升离心机管和离心机的过滤fluid, 1500 转每分钟10分钟。
   2. 离心后丢弃上清液, 用 PBS 清洗颗粒, 用完全培养基并用重悬颗粒, 然后将培养基在100毫米的盘子中。
   3. 在含有 5% CO₂的湿润气氛中孵化37摄氏度的菜肴。
   4. 48小时后, 用新鲜培养基补充菜肴, 去除任何非黏附细胞。每星期更换两次培养基2周作为通道 0 (P0)。
      注: 应该有大约 1 x 10⁴黏附细胞。活细胞/毫升在 SF 大约 2 x 10²/毫升。
   5. 经过14天的初步电镀, 许多殖民地应该已经形成的文化菜肴。选择直径大于2毫米的菌落。通过在盘子底部追踪它们的圆周来标记所选菌落所在的位置。
   6. 使用细胞刮刀丢弃菌落 < 2 毫米宽。用克隆的圆柱体, 用大约5µL 0.25% 胰蛋白酶消化选定的菌落, 并将菌落转移到新的盘子里, 作为通道 1 (P1)。
6. 术后动物护理
   1. 遵循标准的机构操作程序进行术后监测和从麻醉中恢复。
   2. 每10分钟监测一只兔子的生命体征, 直到它恢复知觉为止。最后, 将有意识的动物转移到笼子里。在完全恢复之前, 不要将已经进行过手术的兔子退回到其他动物的公司。
   3. 手术后, 用0.1% 聚维酮碘消毒现场, 每天2x 天3天。

2. rbSF-MSCs 和原代培养的 CD90-positive 磁活化细胞分选 (mac)

1. 样品准备
   1. 当细胞达到大约80% 融合, 吸入培养基, 然后添加 1-2 毫升0.25% 胰蛋白酶-EDTA 到每道菜。
   2. 将盘子孵化 2-3 分钟, 允许细胞脱离。
   3. 一旦细胞分离, 添加同等数量的培养基以使胰蛋白酶失效。
   4. 通过40µm 细胞过滤器通过细胞悬浮液, 收集15毫升管中的滤液, 然后在室温下将细胞在 600 x g 处旋转10分钟。
   5. 并用重悬细胞颗粒在 mac 运行缓冲 (PBS, pH 值 7.2, 0.5% 牛血清白蛋白, 2 毫米 EDTA), 然后计数的细胞数。
2. 磁性标签
   注意: 将 rbSF-MSCs 与包含列、支架和分隔符的磁性激活单元格分拣套件进行排序 (见材料表)。
   1. 使用 hemocytometer 确定单元格编号。
   2. 离心机细胞悬浮在 300 x g 10 分钟在4°c。完全吸入上清液。
   3. 每 10⁷个单元格中添加80µL 的泥沙缓冲区。
   4. 对于 10⁷的总细胞, 添加20µL 的微珠与单克隆抗兔 CD90 抗体结合。
   5. 将磁性珠子和细胞均匀地混合在试管中, 然后在黑暗中孵化4摄氏度, 15 分钟。
   6. 将每 10⁷个细胞的1毫升缓冲液添加到管中, 然后将其离心在 300 x g 处以10摄氏度为4分钟, 以洗涤细胞。离心后要丢弃上清液。
   7. 并用重悬每 10⁷细胞的500µL 缓冲颗粒。
3. 磁性分离
   1. 将柱面与柱翼放在磁选机的磁场中。
   2. 用每 10⁷个单元格中500µL 的缓冲器冲洗磁选机 (MS) 柱。
   3. 将单个单元格悬浮体转移到该列中。让阴性细胞通过磁场来丢弃这些未标记的细胞。
   4. 用每 10⁷个单元格的500µL, 将 1-2x 列洗净, 然后丢弃该流。
   5. 将该列转移到离心管 (15 毫升)。
   6. 将每 10⁷个单元格的缓冲区的1毫升添加到该列, 然后立即将柱塞推入该列, 以冲出磁性标记的单元格。
   7. 重复上述步骤与第二个 MS 专栏, 以提高 CD90⁺细胞纯度, 这可以丰富的洗脱分数。
   8. 离心细胞悬浮在 300 x g 10 分钟, 吸入上清, 并与培养基并用重悬。
4. CD90⁺ rbSF-MSCs 的培养
   1. 在磁性活化细胞分类后, 在100毫米的菜肴中接种细胞。
   2. 孵化的菜肴在37°c 在一个湿润细胞孵化器与 5% CO₂。
   3. 当主要培养的 80-90% 汇合达到, 在大约 7-10 天, 消化黏附的细胞与0.25% 胰蛋白酶-EDTA 并且通过他们在1:2 稀释使段落 2 (P2)。
   4. 使用相同的方法将细胞传递到 3 (P3), 可用于体外测定。
      注: 亚培养纯化后, 可获得约 1 x 10⁷ rbSF MSCs。

3. rbSF-MSCs 的鉴定

1. 流式细胞仪 rbSF 的表面标记确认
   1. 当 MSCs 在 P3 80-90% 汇合时, 用 PBS 冲洗细胞, 并用1毫升0.25% 胰蛋白酶-EDTA 进行治疗。然后, 在37摄氏度处孵育 MSCs 2-3 分钟, 直到细胞分离。
   2. 用10毫升的 PBS 收割细胞, 将它们转移成锥形管 (15 毫升), 在室温下将其离心在 300 x g 上5分钟。
   3. 丢弃上清液。并用重悬500µL 中的细胞颗粒, 并将其转化为1.5 毫升管。
   4. 孵化1:100 稀释 FITC 共轭和 PE 共轭抗体 (同种, FITC-CD34/PE-CD45, FITC-CD105/PE-CD44) 为1小时在黑暗中4°c。
   5. 将此混合物在室温下以 300 x g 为5分钟, 每两次离心一次, 用 300 x g 离心法将电池清洗一次。丢弃上清液。
   6. 并用重悬500µL 中的细胞, 将细胞悬浮液转移到圆底管 (5 毫升) 中, 并用流式细胞仪进行分析。
      注: 在装有两个荧光通道的细胞仪上获取数据: 533/30 和585/40。对于每个同种荧光, 使用同种控制来调整适当的激光电压, 并设置获得荧光直方图所需的最小强度, 以显示峰值的左和右边缘。为统计分析收集至少1万个事件。
2. rbSF-MSCs 的 Multidifferentiation
   注: 使用 P3 rbSF 干细胞体外multidifferentiation 测定。
   1. 成骨分化
      1. 制备成骨诱导培养基: DMEM 基本 (1x), 含有50毫米的 l-抗坏血酸 acid-2-phosphate,10 毫米的α甘油和100毫微米的地塞米松。
      2. 种子细胞在 10³细胞/cm²在6良好的组织培养板和培养他们在成骨诱导培养基。
      3. 每3天更换一次感应培养基3周。
      4. 在区分完成后, 在室温下固定4% 甲醛30分钟的细胞, 用1% 茜素红染成5分钟的细胞, 然后用 PBS¹⁵清洗3x。
   2. 脂肪分化
      1. 制备脂肪诱导介质: DMEM 基本 (1x), 由100毫米消炎痛、10毫克/毫升重组人胰岛素、1毫米地塞米松和0.5 毫米3异丁基-1-甲基黄嘌呤组成。
      2. 在脂肪诱导培养基中治疗 P3 rbSF-MSCs 3 周。
      3. 3周后, 用油红 O 染色中性脂质泡, 确认脂肪分化。在室温下将4% 甲醛溶液中的细胞固定30分钟, 然后用 PBS¹⁶冲洗3x。
   3. 软骨分化
      1. 制备软骨诱导介质: DMEM 基本 (1x), 由 TGFβ1 10 ng/毫升、1% 补充剂、0.35 毫米 l-脯氨酸、100 nM 地塞米松、50毫米 l-抗坏血酸 acid-2-phosphate 和1毫米丙酮酸钠组成。
      2. 使用颗粒培养软骨诱导。离心机 5×10⁵ P3 rbSF-MSCs, 1500 rpm 10 分钟, 在聚丙烯管 (15 毫升) 形成颗粒。
      3. 用软骨诱导培养基培养3周的颗粒。
      4. 每3天更换一次培养基3周。
      5. 3周诱导后, 将细胞颗粒嵌入石蜡切片, 将其切片成4毫米切片, 在室温¹⁷时用0.1% 甲苯胺蓝染色30分钟。
3. 定量实时聚合酶链反应 (qRT PCR) 对总 RNA 的提取和分析
   1. 用商业 RNA 萃取试剂盒分离出3周后细胞的总 RNA (见材料表)。
      1. 去除培养基中的培养基, 然后加入1毫升的隔离试剂。
      2. 通过重复吹打溶解细胞, 直到溶液是均匀的。在室温下孵化3分钟。
      3. 将细胞裂解液转化为1.5 毫升离心管。
      4. 加100µL 氯仿, 用手摇动 15x, 室温下将混合物孵化3分钟。
      5. 离心管在 1.2万 x g 15 分钟在4摄氏度。将上清液转移到一个新的1.5 毫升离心管。
      6. 添加500µL 异丙醇, 在室温下沉淀 RNA 10 分钟。
      7. 离心机在 1.2万 x g 为 10 minat 4 °c。RNA 颗粒应该在管子的底部可见。
      8. 取出上清, 然后添加500µL 75% 乙醇。简要旋转管几秒钟, 以洗涤 RNA 颗粒。离心机它在 7500 x g 为5分钟在4°c。
      9. 除去残留的乙醇。
      10. 将 RNA 颗粒溶解在10µL 的 DEPC 水中, 将管子放在冰上。
   2. 用 DNA 合成试剂盒将总 RNA 反转转录成 cDNA (见材料表)。
      注: 在冰上执行以下所有步骤。
      1. 准备反向转录大师组合。
      2. 添加25µL DNase 处理的 rna 到每个管与1µg 的 rna。
      3. 使用 PCR 热循环仪在以下温度下孵化混合物:26 °c 10 分钟 (允许随机 hexamers 退火), 42 °c 45 分钟 (反转转录) 和75°c 10 分钟 (使逆转录酶失效)。
      4. 立即通过定量的实时 PCR 分析结果 cDNA, 或将其存储在-20 摄氏度。
   3. 采用定量实时 PCR 系统进行基因表达分析。
      1. 使用 qRT pcr 的主组合 (见材料表) 进行 pcr。GAPDH、Runx2、Agg 和 PPARγ的 PCR 引物列于表 1。
      2. 使用 2^−ΔΔCT方法计算基因表达。
      3. 使用标准统计软件进行统计分析。使用独立的样本 t 检验来比较组的方法。

结果

rbSF-MSCs 的分离、纯化和培养:
根据 MSC 表面标记 CD90 的表达式, 该协议使用 mac 隔离 rbSF MSCs。图 1显示了 rbSF-MSCs 的分离、纯化和表征以及体外培养协议的工艺流程图。

磁性活化细胞分选 (mac) 与 CD90 后的细胞形态学:
首先, 对于 mac, immunolabel MSCs 与 CD90 磁珠。离心后, 并?...

讨论

在滑膜液中 MSCs 的存在为细胞治疗提供了一种替代方法。以往的研究表明, 损伤部位在滑液中含有较高数量的间充质干细胞, 这可能与损伤后⁵期呈正相关。在滑膜液中的 MSCs 可能有利于组织, 以加强在伤害^18,19的自发愈合。在文献中很少涉及 sf 间充质干细胞的临床应用, 主要是因为关节内的 sf-mscs 的机制仍未确定²⁰。琼...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
MesenGro	StemRD	MGro-500 1703	Warm in 37 °C water bath before use
MesenGro Supplement	StemRD	MGro-500 M1512	Component of MSCs culture medium
DMEM basic	Gibco Inc.	C11995500BT	MSCs differentiation medium
Isotonic saline solution	Litai, China	5217080305	Cavity arthrocentesis procedure reagent
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	HyClone Inc.	SH30256.01B	PBS, free of Ca2+/Mg2+
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Inc.	10099-141	Component of MSCs culture medium
Povidone iodine solution	Guangdong, China	150605	Sterilization agent
75% ethanol	Lircon, china	170917	Sterilization agent
0.25% Trypsin/EDTA	Gibco Inc.	25200-056	Cell dissociation reagent
1% Penicillin-Streptomycin	Gibco Inc.	15140-122	Component of MSCs medium
MACS Running Buffer	MiltenyiBiotec	5160112089	Containing phosphate-buffered saline (PBS), 0.5% bovine serum albumin(BSA), and 2 mMEDTA
CD90 antibody conjugated MicroBeads	MiltenyiBiotec	5160801456	For magnetic activated cell sorting
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256	Component of MSCs chondrogenic differentiation
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756	Component of MSCs osteogenic differentiation
ITS	BD	354352	1%, Component of MSCs chondrogenic differentiation
L-proline	Sigma-Aldrich	P5607	0.35 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation
L-ascorbic acid-2-phosphate	Sigma-Aldrich	A8960	50 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation
3-isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I5879	0.5 mM, Component of adipogenic differentiation
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378	100 mM, Component of adipogenic differentiation
TGFβ1	Peprotech	100-21	10 ng/mL, Component of MSCs chondrogenic differentiation
α-glycerophsphate	Sigma-Aldrich	G6751	Component of MSCs osteogenic differentiation
CD34 Polyclonal Antibody, FITC Conjugated	Bioss	bs-0646R-FITC	Hematopoietic stem cells marker
Mouse antirabbit CD44	Bio-Rad	MCA806GA	Thy-1 membrane glycoprotein (MSCs marker)
CD45 (Monoclonal Antibody)	Bio-Rad	MCA808GA	Hematopoietic stem cells marker
CD105 antibody	Genetex	GTX11415	MSCs marker
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	I9030	Precipitates RNA extraction organic phases
Trichloromethane	Wenge, China	61553	Extract total RNA
Trizol	Invitrogen	15596-018	Isolate total RNA
SYBR green master mix	Takara Bio, Japan	RR420A	PCR test
cDNA synthesis kit	Takara Bio, Japan	RR047A	Reverse-transcribed to complementary DNA
Alizarin Red	Sigma-Aldrich	A5533	Staining of calcium compounds
Toluidine Blue	Sigma-Aldrich	89640	Staining of cartilaginous tissue
Oil Red O solution	Sigma-Aldrich	O1391L	Lipid vacuole staining
Equipment
MiniMACS Separator	MiltenyiBiotec	130-042-102	For magnetic activated cell sorting
MultiStand	MiltenyiBiotec	130-042-303	For magnetic activated cell sorting
MS Columns	MiltenyiBiotec	130-042-201	For magnetic activated cell sorting
Cell Strainer	FALCON Inc.	352340	40 μm nylon
Hemocytometer	ISOLAB Inc.	075.03.001	Cell counting
Falcon 100 mm dish	Corning	353003	Cell culture dish
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C	RNA Extraction and PCR
Centrifuge Tubes	Sigma-Aldrich	91050	Gamma-sterilized
High-speed centrifuge	Eppendorf	5804R	Centrifuge cells
Carbon dioxide cell incubator	Thermo scientific	3111	Cell culture
Real-Time PCR Instrument	Life Tech	QuantStudio	Real-Time quantitative polymerase chain reaction
Flow cytometer	BD Biosciences	342975	Cell analyzer
Pipettor	Eppendorf	O25456F	Transfer the liquid
Cloning cylinder	Sigma-Aldrich	C3983-50EA	Isolate and pick individual cell colonies
Sterile hypodermic syringe	Double-Dove, China	131010	Arthrocentesis procedure
Rabbit cage	Zhike, China	ZC-TGD	Restrain the rabbit