마그네틱 활성화 전략을 분리 하 고 정화 활 액 액체 파생 된 중간 엽 줄기 세포는 토끼 모델에서 정렬 셀

요약

이 문서 간단 분리와 뉴질랜드 백색 토끼 활 액 액체에서 중간 엽 줄기 세포의 정화에 대 한 간단 하 고 경제적인 프로토콜을 제공합니다.

초록

중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 세포 기반 치료에 대 한 주요 셀 소스. 관절 강 활 액 액체에서 MSCs 연골 조직 공학에 잠재적으로 사용할 수 있었습니다. 활 액 액체 (SF-MSCs)에서 MSCs 간주 되었습니다 관절 재생을 위한 유망한 후보자 그리고 그들의 잠재적인 치료 혜택 했다 그들 중요 한 연구 주제를 늦게. 뉴질랜드 백색 토끼의 무릎 구멍에서 SF-MSCs 인간의 재생 의학을 평가 하는 최적화 된 변환 모델로 사용할 수 있습니다. CD90 기반 자석 활성화 된 셀 정렬 (맥) 기술을 통해이 프로토콜 성공적으로 토끼 SF-MSCs (rbSF-MSCs)이 토끼 모델에서 가져오고 더 완벽 하 게 유도 하는 그들을 차별화 하 여 이러한 셀의 MSC 표현 형 보여줍니다. osteoblasts, adipocytes, 그리고 chondrocytes입니다. 따라서,이 방법은 세포 생물학 연구와 간단한 장비 및 절차를 사용 하 여 조직 공학에 적용할 수 있습니다.

서문

MSCs 연골 병 변을 위해 특히 재생 의학에 대 한 귀중 한 소스 제안 되어 있다. MSCs, chondrocytes, osteoblasts, adipocytes, 골격 myocytes 및 내장 stromal 세포를 포함 하 여 광범위 하 게 그들의 높은 확장 속도 멀티 혈통 차별화 잠재적인¹인해 줄기 세포 이식에 대 한 영역을 확장 합니다. MSCs는 골격 근육, 막, 골 수 및 지방 조직^2,,34에서 격리 될 수 있습니다. 결과 또한 confirmed 활 액 액체에서 MSCs의 존재 그리고 이전 연구는 관절 재생^5,6유망한 후보자로 활 액 액체 파생 MSCs (SF-MSCs)를 발견 했다.

그러나, 연구와 임상 실험 인간의 샘플에 많은 윤리적 문제에 적용 됩니다. 대신, 토끼 고 가장 일반적으로 사용 되는 동물 종 MSCs의 이식 연골 손상을 복구할 수 있습니다 설명 하기 위해 계속. 최근 몇 년 동안, 연구원의 증가 수는 토끼 중간 엽 줄기 세포 (rbMSCs) 모두 공부 생체 외에서 그리고 vivo에서이 세포는 그들의 세포질 생물학 및 조직 생리학에서 인간의 비슷합니다 MSCs. 마찬가지로, rbMSCs는 인간의 MSCs에서 스핀 들 섬유 형태를 표시 하는 플라스틱 표면에 고착 할 수 있다. 또한, 토끼 중간 엽 샘플 간단 하 고 쉽게⁷을 얻을 수 있다. 또한, 가장 중요 한 포인트는 rbMSCs CD44, CD90, CD105, 등 표면 마커를 표현 하 고 기준으로 MSC 인구의 식별에 대 한 동의 잠재적인 다중 계보 차별화 유지 되는 세포 치료^8,9에 대 한 국제 사회에 의해 정의. 특히, synovial 유체 chondroprogenitors 때 TGF-β1, 따라서 그들 phenotypically 관절 연골 재생^{10,11, 적당 한 셀 소스 만들기에 의해 유도 된 비 hypertrophic chondrogenesis 할 수 있다 12}.

그러나, SF MSCs의 절연 탯, 지방 조직, 말 초 혈액 및 골 수를 포함 하 여 다른 조직에서 크게 다르다. 현재, 비록 흐름 cytometry 방법을 사용 하려면 특정 환경 및 매우 비싼 악기¹³cytometry 및 immunomagnetic 구슬 기반 정렬 정화 및 SF-MSCs의 정렬에 대 한 가장 일반적인 방식입니다.

이 문서는 흰 토끼 뉴질랜드에서 활 액 액체 샘플의 간단 하 고 최소한 침략 적 컬렉션에 대 한 절차를 제공합니다. 절차 동안, rbSF-MSCs 안정적으로 확장 된 생체 외에서 그리고 CD90 긍정적인 자기 비드 기반 절차와 격리. 마지막으로, 프로토콜에는 높은 순도와 수확된 셀 소스에서 생존 MSCs를 구하는 방법을 보여 줍니다.

이 프로토콜에서 격리 rbSF-MSCs는 그들의 형태학, 특정 마커 및 pluripotency 줄기 세포에 대 한 표현에 따라 특징 이다. CD45와 CD34의 표현 부정적인 반면 교류 cytometry 기반 immunophenotyping CD44 및 CD105의 중요 한 긍정적인 표현을 보여준다. 마지막으로, 분석 결과 생체 외에서 rbSF-MSCs에 대 한이 셀의 osteogenic, adipogenic, 및 chondrogenic 분화를 보여 줍니다.

프로토콜

모든 동물 실험 지역 윤리 위원회 지침에 따라 실시 했다 그리고 모든 동물성 절차 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 심천 제 2 인민 병원, 심천 대학으로 승인 했다.

1. 격리와 rbSF-MSCs 문화

1. 동물 절차에 대 한 준비
   1. RbSF의 컬렉션에 대 한 skeletally 성숙 여성 뉴질랜드 백색 토끼를 준비-MSCs. 마 취와 arthrocentesis 절차 전에 어느 날 토끼의 임상 시험 수행.
      참고: 검 무게 (2.0-2.5 k g), 성별 (여성), 고 체온, 호흡 속도 심장 박동을 포함 해야 합니다. 임상적으로 건강 한 토끼에 대 한 매개 변수 간격 있으며 호흡 속도 대 한 30-50 분, 심장 박동에 대 한 220-280 분 38-39 ° C 온도 대 한.
   2. 동물 마 취 전에 6 h에 대 한 빠른.
2. 준비 및 동물 마 취에 대 한 절차
   1. 감 금 소를 가진 토끼를 억제 ( 재료의 표참조), 다음 3 %pentobarbital 나트륨 전신 마 취에 대 한 1 mL/kg의 복용량에 한계 귀 정 맥에 주사 하 고.
   2. 토끼 편안한 휴식 등 쪽 위치에 놓습니다.
   3. 마 취 동안 토끼의 체온, 심장 박동, 호흡 속도 모니터링 합니다.
   4. 그것의 눈에 안과 연 고를 사용 하 여 마 취 동안 건조를 방지 하기 위해.
   5. Guedel의 분류¹⁴다음 마 취의 깊이 평가 합니다.
3. MSCs 절연 및 재배에 대 한 준비
   1. RbSF-MSCs를 육성, 상업 문화 매체의 500 mL 준비 보충 ( 재료의 표참조) 10% 상업 보충 ( 재료의 표참조), 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 그리고 1% 페니실린-스.
   2. 물 욕조에 37 ° C에서 배양을 품 어.
   3. 세포 분리 및 세포 세척에 대 한 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 500 mL를 준비 합니다.
   4. 무릎 구멍 arthrocentesis 절차에 대 한 100 mL isotonic 식 염 수 솔루션의 준비.
4. 토끼의 무릎에서 관절 활 액 흐름이 uid의 컬렉션
   1. 크기는 무릎 주위에 지역 약 5 x 5 cm를 선택 하 고 안전 전기 면도기를 사용 하 여이 영역에서 토끼 머리를 면도.
   2. 또는 소독 절차 사이트 3 povidone 요오드 솔루션 및 75% 에탄올 x. 영역은 완전히 말린 후, 무 균 커튼 적용.
   3. 3-4 x, isotonic 식 염 수 솔루션을 사용 하 여 살 균 피하 주사기 (2 mL), 측면 관절 공간에서 무릎 관절 구멍으로 무릎을 이동 1-2 mL를 주사 하 고 실 온에서 모든 활 액 액체를 빨 아.
   4. 4 h 이내 어떤 파편 든 지 제거 하 40 µ m 나일론 셀 스 트레이너를 통해 synovial fluid를 필터링 합니다.
5. RbSF-MSCs의 문화
   1. 50 mL 원심 분리기 튜브에 실 온에서 10 분 원심 1500 rpm에서 필터링 된 fluid를 수집 합니다.
   2. 원심 분리 후에 상쾌한 삭제, PBS 가진 펠 릿을 세척, 완전 한 문화 매체와 펠 릿 resuspend 그리고 접시 100mm 요리에서 매체.
   3. 37 ° c 5% CO₂를 포함 하는 습도 분위기에서 요리를 품 어.
   4. 48 h 후 어떤 비 부착 한 세포를 제거 하는 신선한 매체와 요리를 보충. 대체 매체 통로 0 (P0)으로 2 주 동안 일주일에 두 번.
      참고: 약 1 × 10⁴ 부착 셀을 하 고 있어야 합니다. SF에서 가능한 셀/ml은 약 2 × 10²/mL.
   5. 14 일 후 초기 도금 따르고, 많은 식민지 문화 요리에서 형성 해야한다. 직경에서 2 m m 보다 큰 식민지를 선택 합니다. 선택 된 식민지 접시 바닥에 그들의 둘레를 추적 하 여 위치를 표시 합니다.
   6. 식민지 < 2 폭 mm, 세포 스 크레이 퍼를 사용 하 여 삭제 합니다. 복제 실린더를 사용 하 여 0.25 %trypsin 약 5 µ L로 선택 된 식민지를 소화 하 고 통과 1 (P1)로 새로운 접시에 식민지를 전송.
6. 수술 동물 치료
   1. 수술 후 모니터링 및 마 취에서 회복 기관 표준 운영 절차를 따르십시오.
   2. 의식 회복 될 때까지 10 분 마다 토끼의 생체 신호를 모니터링 합니다. 마지막으로, 의식 동물 케이지 전송. 그것은 완전히 복구 될 때까지 다른 동물의 회사를 수술을 겪고 있다 토끼를 반환 하지 않습니다.
   3. 후 작업, 0.1 %povidone 요오드, 2 3 일 동안 하루 x 사이트를 소독.

2. CD90 긍정적인 자기 활성화 셀 정렬 (맥) rbSF-MSCs 및 주 문화

1. 샘플 준비
   1. 80 %confluency, 매체, 발음 한 다음 0.25%의 1-2 mL을 추가 셀 주위에 도달 하는 때 각 요리에 트립 신-EDTA.
   2. 셀 분리 수 있도록 2-3 분 요리를 품 어.
   3. 세포 분리는 일단 비활성화는 트립 신 문화 매체의 동일한 금액을 추가 합니다.
   4. 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 세포 현 탁 액을 통과, 15 mL 튜브에 여과 액을 수집 하 고 실 온에서 10 분 600 × g에서 셀 아래로 회전.
   5. 버퍼를 실행 하는 맥에서 셀 펠 릿 resuspend (PBS, pH 7.2, 0.5% 소 혈 청 알 부 민와 2 mM EDTA) 및 셀 수를 계산 하는 다음.
2. 마그네틱 라벨
   참고: 자기 활성화 셀 정렬 열, 서, 및 구분 기호 ( 자료의 표참조)를 포함 하는 키트 rbSF-MSCs를 정렬 합니다.
   1. hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 결정 합니다.
   2. 4 ° c.에서 10 분 동안 300 × g에서 세포 현 탁 액을 원심 완전히는 상쾌한 발음.
   3. 10⁷ 총 셀 당 물의 resuspension 버퍼의 80 µ L를 추가 합니다.
   4. 10⁷ 총 셀에 대 한 단일 클로 널 항 토끼 CD90 항 체로 활용 하는 microbeads의 20 µ L를 추가 합니다.
   5. 어둠 속에서 15 분 동안 4 ° C에서 그들을 품 어 다음 자석 구슬 및 셀 튜브에 균등 하 게 섞는다.
   6. 튜브, 10⁷ 셀 당 버퍼의 1 mL을 추가 하 고 셀을 씻어 4 ° C에서 10 분 동안 300 × g에서 원심. 원심 분리 후에 상쾌한 폐기.
   7. 10⁷ 셀 당 버퍼의 500 µ L에 펠 릿을 resuspend.
3. 자력 분리
   1. 장소는 열 열 자석 분리기의 자기장으로 앞에 날개.
   2. 10⁷ 셀 당 버퍼의 500 µ L 자석 분리기 (MS) 열을 씻어.
   3. 열에 단일 세포 현 탁 액을 전송 합니다. 이러한 레이블이 셀을 삭제 하는 자기장을 통과 하는 부정적인 세포를 하자.
   4. 10⁷ 셀 당 열 버퍼의 500 µ L 1-2 x를 세척 하 고 흐름을 통해 삭제.
   5. 원심 분리기 튜브 (15 mL)에 열을 전송 합니다.
   6. 10⁷ 셀 당 버퍼의 1 mL는 열을 추가 하 고 즉시에 자석으로 레이블이 지정 된 셀에 밖으로 플러시 열에 플런저를 밀어.
   7. CD90의 순도 높이기 위해 두 번째 MS 열 상기 절차 반복⁺ 세포, eluted 분수의 질을 높일 수 있습니다.
   8. 10 분 동안 300 × g에서 세포 현 탁 액을 원심, 상쾌한, 발음 그리고 문화 매체와 resuspend.
4. 문화는 CD90의⁺ rbSF-MSCs
   1. 마그네틱 활성화 된 세포 분류 후 100 mm 접시에 셀을 예방.
   2. 5% CO₂습도 셀 인큐베이터에서 37 ° C에서 요리를 품 어.
   3. 주 문화의 합류 점 80-90% 달성, 약 7-10 일 때 0.25% Trypsin EDTA와 통로와 부착 세포 소화 통로 2 (P2)을 1:2 희석에 그들.
   4. 통과 셀 통로 3 (P3), 체 외에서 분석 실험을 위해 사용 될 수 있는 동일한 메서드를 사용 합니다.
      참고: 하위 문화 정화 후 약 1 x 10⁷ rbSF-MSCs 얻을 수 있습니다.

3입니다. rbSF-MSCs의 식별

1. Cytometry에 의해 rbSF MSCs의 표면 표식 확인
   1. MSCs P3에 80-90% 합칠 때, PBS로 세포 세척 하 고 0.25%의 1 mL와 함께 그들을 치료 트립 신-EDTA. 그런 다음 셀 분리 될 때까지 2-3 분 동안 37 ° C에서 MSCs 품 어.
   2. PBS의 10 mL를 사용 하 여 셀을 수확, 원뿔 튜브 (15 mL)에 그들을 전송 하 고 실 온에서 5 분 동안 300 × g에서 원심.
   3. supernatants 삭제 합니다. PBS의 500 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 1.5 mL 튜브에 그것을 전송.
   4. FITC 활용 및 PE 활용 된 항 체의 (isotype, FITC CD34/PE CD45, FITC CD105/PE CD44) 4 ° c.에 어둠 속에서 1 시간에 1: 100 희석을 품 어
   5. 실 온에서 5 분 동안 300 × g에이 혼합물을 원심 고 PBS로 두 번 셀 때마다 5 분 300 × g에서 원심 분리 하 여 세척. supernatants 삭제 합니다.
   6. PBS의 500 µ L에 셀 resuspend, 라운드-하단 튜브 (5 mL)에 세포 현 탁 액 전송 및 교류 cytometer를 사용 하 여 분석.
      참고: 두 개의 형광 채널을 갖춘 cytometer에서 데이터 수집: 533/30 고 585/40. 각 isotype 형광에 isotype 컨트롤을 사용 하 여 적절 한 레이저 전압을 조정 하 고 피크의 왼쪽 및 오른쪽 가장자리를 표시 하는 형광 막대 그래프를 얻을 하는 데 필요한 최소 강도 설정 합니다. 통계 분석에 대 한 10000 이벤트의 최소를 수집 합니다.
2. RbSF-MSCs의 multidifferentiation
   참고: 사용 P3 rbSF-MSCs는 생체 외에서 multidifferentiation 분석 실험에 대 한.
   1. Osteogenic 차별화
      1. Osteogenic 유도 매체 준비: DMEM basic (1x) L-아 스 코르 빈 산-2-인산 염, α-glycerophosphate의 10 m m 100의 50mm 포함 dexamethasone의 nM.
      2. 6 잘 조직 문화 접시에 10³ 셀/c m² 에서 셀 씨 고 osteogenic 유도 매체에 문화.
      3. 3 주 동안 3 일 마다 유도 매체를 변경 합니다.
      4. 분화가 완료 된 후 실 온에서 30 분 동안 4% 포름알데히드와 셀을 수정, 셀 얼룩 5 분, 그리고 다음 세척 그들 3에 대 한 1% 알리자린 레드 PBS¹⁵x.
   2. Adipogenic 차별화
      1. Adipogenic 유도 매체 준비: DMEM basic (1 x) indomethacin의 100 m m, 재조합 인간 인슐린의 10 mg/mL, dexamethasone의 1 m m와 0.5 m m 3-isobutyl-1-methylxanthine의 구성 된.
      2. Adipogenic 유도 매체에 3 주 동안 P3 rbSF-MSCs를 취급 합니다.
      3. 3 주 후, 기름 빨간 O를 사용 하 여 adipogenic 차별화를 확인 하는 중립 지질 그들을 얼룩. 실 온에서 30 분 동안 4% 포름알데히드 용액에 셀을 수정 하 고 그들을 씻어 다음 PBS¹⁶3 배.
   3. Chondrogenic 차별화
      1. Chondrogenic 유도 매체 준비: DMEM basic (1 x)으로 구성 된 TGFβ1, 1%의 10 ng/mL의 그것의 보충, L-프롤린, 100 nM dexamethasone의, 나트륨 pyruvate의 L-아 스 코르 빈 산-2-인산 염, 및 1 m m의 50mm의 0.35 m m.
      2. 펠 릿 chondrogenic 유도 배양을 사용 합니다. 5 × 10⁵ P3 rbSF-MSCs는 펠 릿을 형성 하는 폴 리 프로필 렌 튜브 (15 mL)에서 10 분 1500 rpm에서 원심
      3. Chondrogenic 유도 매체와 3 주 동안 알 약을 문화.
      4. 3 주 동안 3 일 마다 매체를 변경 합니다.
      5. 3 주 유도 후 파라핀으로 셀 펠 릿을 포함, 4 m m 조각으로 섹션 및 0.1%를 사용 하 여 얼룩 톨루이 블루 실내 온도¹⁷시 30 분.
3. 총 RNA 추출 및 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR) 분석
   1. 분리 상업 RNA 적 출을 사용 하 여 3 주 분화 유도 후 세포의 총 RNA 키트 ( 재료의 표참조).
      1. 문화 접시에 있는 문화 매체를 제거 하 고 격리 시 약의 1 mL를 추가 합니다.
      2. 솔루션은 동 질 때까지 반복 pipetting으로 세포를 lyse. 3 분 동안 실내 온도에 그것을 품 어.
      3. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포 lysate를 전송할.
      4. 클로 프롬의 100 µ L을 추가 하 고 손으로 15 x, 그것을 흔들어 3 분 동안 실내 온도에 혼합물을 품 어.
      5. 4 ° c.에 15 분 동안 12000 × g에서 관을 원심 새로운 1.5 mL microcentrifuge 관으로는 supernatants 전송.
      6. 소 프로 파 놀의 500 µ L을 추가 하 고 실 온에서 10 분 동안 RNA 침전.
      7. 12000 × g에서 원심 분리기는 10 minat 위한 4 ° c. RNA 펠 릿은 튜브의 맨 아래에 표시 되어야 합니다.
      8. 제거는 상쾌한 고 75% 에탄올 500 µ L를 추가 합니다. 짧게 RNA 펠 릿을 세척을 몇 초 동안 튜브를 회전 합니다. 4 ° c.에서 5 분 동안 7500 × g에서 원심
      9. 잔여 에탄올을 제거 합니다.
      10. DEPC 물 10 µ L에서 RNA 펠 릿을 녹이 고 얼음에 튜브를 놓습니다.
   2. 반대로 cDNA DNA 합성으로 총 RNA 녹음 키트 ( 재료의 표참조).
      참고: 얼음에 모두 다음 절차를 수행 합니다.
      1. 반전 녹음 방송 마스터 믹스를 준비 합니다.
      2. RNA의 1 µ g 각 튜브를 DNase 취급 RNA의 25 µ L를 추가 합니다.
      3. PCR 열 cycler를 사용 하 여 다음과 같은 온도에서 혼합물을 품 어: 26 ° C (anneal 하 임의 hexamers 수 있도록) 10 분, 45 분 (반전 녹음 방송)와 75 ° C 10 분 (비활성화는 역전사) 42 ° C.
      4. 즉시 분석 정량 실시간 PCR에 의해 결과 cDNA 또는-20 ° c.에 그것을 저장합니다
   3. 실시간 정량 PCR 시스템과 유전자 표정 분석을 수행 합니다.
      1. QRT-PCR 주인 혼합 사용 ( 재료의 표참조) PCR을 수행 하. GAPDH, Runx2, Agg를 가진 PCR 뇌관은 표 1에 나열 됩니다.
      2. 유전자 발현 2^−ΔΔCT 메서드를 사용 하 여 계산 합니다.
      3. 표준 통계 소프트웨어를 사용 하 여 통계 분석을 수행 합니다. 독립 표본 t-검정을 사용 하 여 그룹 방법 비교.

결과

고립, 정화, 및 rbSF-MSCs의 문화:
이 프로토콜 맥을 사용 하 여 rbSF-MSCs, MSC 표면 마커 CD90의 식에 따라 분리. RbSF-MSCs의 고립, 정화, 그리고 특성화 및 생체 외에서 문화 프로토콜의 공정 흐름도 그림 1에 표시 됩니다.

마그네틱 활성화 셀 CD90와 (맥)을 정렬 후 셀 형태:
첫째,...

토론

활 액 액체에 MSCs의 존재 휴대에 기초를 둔 치료에 대 한 대안을 제공합니다. 이전 연구 부상 사이트 후 부상 기간⁵와 긍정적으로 상관 될 수 있습니다 그들의 활 액 액체에 중간 엽 줄기 세포의 높은 금액을 포함 나타났습니다. 활 액 액체에 MSCs 부상^18,19후 자연 치유 향상을 위한 조직에 도움이 될 수 있습니다. 문학에서 SF MSCs의 임상 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
MesenGro	StemRD	MGro-500 1703	Warm in 37 °C water bath before use
MesenGro Supplement	StemRD	MGro-500 M1512	Component of MSCs culture medium
DMEM basic	Gibco Inc.	C11995500BT	MSCs differentiation medium
Isotonic saline solution	Litai, China	5217080305	Cavity arthrocentesis procedure reagent
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	HyClone Inc.	SH30256.01B	PBS, free of Ca2+/Mg2+
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Inc.	10099-141	Component of MSCs culture medium
Povidone iodine solution	Guangdong, China	150605	Sterilization agent
75% ethanol	Lircon, china	170917	Sterilization agent
0.25% Trypsin/EDTA	Gibco Inc.	25200-056	Cell dissociation reagent
1% Penicillin-Streptomycin	Gibco Inc.	15140-122	Component of MSCs medium
MACS Running Buffer	MiltenyiBiotec	5160112089	Containing phosphate-buffered saline (PBS), 0.5% bovine serum albumin(BSA), and 2 mMEDTA
CD90 antibody conjugated MicroBeads	MiltenyiBiotec	5160801456	For magnetic activated cell sorting
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256	Component of MSCs chondrogenic differentiation
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756	Component of MSCs osteogenic differentiation
ITS	BD	354352	1%, Component of MSCs chondrogenic differentiation
L-proline	Sigma-Aldrich	P5607	0.35 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation
L-ascorbic acid-2-phosphate	Sigma-Aldrich	A8960	50 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation
3-isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I5879	0.5 mM, Component of adipogenic differentiation
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378	100 mM, Component of adipogenic differentiation
TGFβ1	Peprotech	100-21	10 ng/mL, Component of MSCs chondrogenic differentiation
α-glycerophsphate	Sigma-Aldrich	G6751	Component of MSCs osteogenic differentiation
CD34 Polyclonal Antibody, FITC Conjugated	Bioss	bs-0646R-FITC	Hematopoietic stem cells marker
Mouse antirabbit CD44	Bio-Rad	MCA806GA	Thy-1 membrane glycoprotein (MSCs marker)
CD45 (Monoclonal Antibody)	Bio-Rad	MCA808GA	Hematopoietic stem cells marker
CD105 antibody	Genetex	GTX11415	MSCs marker
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	I9030	Precipitates RNA extraction organic phases
Trichloromethane	Wenge, China	61553	Extract total RNA
Trizol	Invitrogen	15596-018	Isolate total RNA
SYBR green master mix	Takara Bio, Japan	RR420A	PCR test
cDNA synthesis kit	Takara Bio, Japan	RR047A	Reverse-transcribed to complementary DNA
Alizarin Red	Sigma-Aldrich	A5533	Staining of calcium compounds
Toluidine Blue	Sigma-Aldrich	89640	Staining of cartilaginous tissue
Oil Red O solution	Sigma-Aldrich	O1391L	Lipid vacuole staining
Equipment
MiniMACS Separator	MiltenyiBiotec	130-042-102	For magnetic activated cell sorting
MultiStand	MiltenyiBiotec	130-042-303	For magnetic activated cell sorting
MS Columns	MiltenyiBiotec	130-042-201	For magnetic activated cell sorting
Cell Strainer	FALCON Inc.	352340	40 μm nylon
Hemocytometer	ISOLAB Inc.	075.03.001	Cell counting
Falcon 100 mm dish	Corning	353003	Cell culture dish
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C	RNA Extraction and PCR
Centrifuge Tubes	Sigma-Aldrich	91050	Gamma-sterilized
High-speed centrifuge	Eppendorf	5804R	Centrifuge cells
Carbon dioxide cell incubator	Thermo scientific	3111	Cell culture
Real-Time PCR Instrument	Life Tech	QuantStudio	Real-Time quantitative polymerase chain reaction
Flow cytometer	BD Biosciences	342975	Cell analyzer
Pipettor	Eppendorf	O25456F	Transfer the liquid
Cloning cylinder	Sigma-Aldrich	C3983-50EA	Isolate and pick individual cell colonies
Sterile hypodermic syringe	Double-Dove, China	131010	Arthrocentesis procedure
Rabbit cage	Zhike, China	ZC-TGD	Restrain the rabbit