磁気活性化細胞を分離し、滑膜液由来間葉系幹細胞が家兎モデルからの浄化戦略を並べ替え

要約

この記事では、簡単な分離そしてニュージーランド白ウサギ滑液からの間葉系幹細胞の浄化のためのシンプルで経済的プロトコルを示します。

要約

間葉系幹細胞 (Msc) は、細胞ベースの治療の主要な細胞ソースです。MSCs 関節腔滑液から軟骨組織工学用をされる可能性があります可能性があります。滑液 (SF MSCs) から MSCs は関節の再生のための有望な候補と考えられてきたし、彼らの潜在的な治療効果は重要な研究課題の後半。ニュージーランド白ウサギの膝関節腔から SF MSCs は人間の再生医療を評価するために最適化された並進モデルとして用いることができます。CD90 ベース磁気活性化細胞 (MAC) 技術を並べ替え、このプロトコルこの家兎モデルからウサギが SF MSCs (rbSF-MSCs) 正常取得ならびにさらに完全に区別するためにそれらを誘導することによってこれらの細胞の MSC の表現型を示します骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞。したがって、このアプローチは、細胞生物学の研究と簡単な装置や手順を使用してティッシュ エンジニア リングで適用できます。

概要

MSCs は、特に軟骨病変のための再生医療のための貴重な情報源として提案されています。MSCs では、軟骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、骨格筋細胞と内臓の間質細胞を含む広くその高膨張率と多系統分化潜在的な¹のための幹細胞移植の領域を展開します。MSCs は、骨格筋、滑膜、骨髄、脂肪^2,3,4から分離できます。調査結果にも、あるビジョ滑液の MSCs の存在と前の研究が関節再生^5,6の有望な候補として滑液由来 Msc (SF MSCs) を発見します。

しかし、研究と人間のサンプルの臨床実験は多くの倫理的な問題の対象となります。代わりに、ウサギはされているし、MSCs の移植が軟骨の損傷を修復することができますを示すために最も一般的に使用される動物種であり続けます。近年、研究者数の増加は、両方生体外でウサギ間葉系幹細胞 (rbMSCs) を研究しているし生体内で、これらの細胞は、細胞生物学、組織生理学におけると同様に人間の MSCs。同様に、rbMSCs は人間の MSCs のように軸線維芽細胞の形態を表示するプラスチックの表面に付着することがあります。さらに、ウサギ間葉系サンプル、シンプルで簡単に⁷を入手します。さらに、最も重要なポイントは、CD44、CD90, CD105 などの表面マーカーを rbMSCs に表現として MSC 集団の同定の基準に一致してである多系統分化の能力が維持されること細胞療法^8,9国際社会によって定義されます。特に、滑膜液 chondroprogenitors、非肥大軟骨分化表現型関節軟骨再生^{10、11、適切な細胞源のため TGF-β 1 による場合の対応 12}。

しかし、SF MSCs の分離は臍帯、脂肪組織、末梢血、骨髄など、他の組織から大きく異なる。現在、浄化および SF MSCs の並べ替えのための最も一般的なアプローチはフローサイトメトリー ・免疫ビーズに基づく並べ替え、フローサイトメトリー法には、特定の環境と非常に高価な楽器¹³が必要ですが。

この記事は、白ウサギ ニュージーランドから滑液のサンプル集のシンプルで低侵襲の手順を示します。中には、rbSF MSCs 安定拡大培養CD90 正磁気ビーズによるプロシージャで分離されたし。最後に、プロトコルは、高純度と収穫の細胞源から生存率 MSCs を取得する方法を示します。

このプロトコルでは、形態、特定のマーカーと幹細胞の多能性の式に基づいて分離 rbSF MSCs が特徴です。CD45 と CD34 の式が負の値に対し、流れの cytometry ベース診療は CD44 と CD105 の重要な肯定的な表現を明らかにします。最後に、rbSF mscsの in vitroアッセイは、これらの細胞の骨、軟骨、脂肪細胞の分化を示しています。

プロトコル

地域倫理委員会ガイドラインに従ってすべての動物実験を行い、動物のすべてのプロシージャは、機関動物ケアおよび使用委員会の深セン第二人民病院、深セン大学によって承認されました。

1. 分離し、rbSF MSCs の文化

1. 動物のプロシージャのための準備
   1. RbSF のコレクションの骨格成熟女性ニュージーランド白ウサギを準備-MSCs。 1 日麻酔と穿刺のプロシージャ前にウサギの臨床検査を実行します。
      注: 身体検査は、心拍数と呼吸数、体温 (女性) の性別 (2.0 〜 2.5 kg) の重量を含める必要があります。臨床的に健康なウサギのパラメーター間隔は 38-39 ° C の体温、心拍数 220-280 分呼吸率 30-50 分。
   2. 麻酔の前に 6 時間動物を高速です。
2. 薬品および動物の麻酔の手順
   1. ケージでウサギを抑制 (材料の表を参照)、し、全身麻酔のための 1 mL/kg の用量で耳静脈に 3% ペントバルビ タール ナトリウムを注入します。
   2. 快適な背臥位でウサギを配置します。
   3. 麻酔中に呼吸数、心拍数、ウサギの体の温度を監視します。
   4. 麻酔中の乾燥を防ぐために、その目に眼科の軟膏を使用します。
   5. Guedel の分類¹⁴の後麻酔の深さを評価します。
3. MSCs の分離と培養のための準備
   1. RbSF MSCs を育成する培地商業の 500 mL を準備 (材料の表を参照) を添加した商業 10% 補足 (材料の表を参照)、10% 牛胎児血清 (FBS)、および 1% ペニシリン-ストレプトマイシン。
   2. 水お風呂で 37 ° C で培養液を孵化させなさい。
   3. 電池隔離および細胞洗浄用リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) の 500 mL を準備します。
   4. 膝窩洞穿刺プロシージャの等張生理食塩水液 100 mL を準備します。
4. ウサギの膝関節の関節滑膜溝 uid のコレクション
   1. 膝の周囲サイズが約 5 × 5 cm の領域を選択し、安全の電気シェーバーを使用してこのエリアからウサギの毛を剃る。
   2. また、消毒手順サイト 3 ポビドン ヨード ソリューションと 75% エタノールと x。そして、地域は完全に乾燥した後に滅菌ドレープを適用します。
   3. 3-4 x 横関節領域から膝の関節腔に滅菌皮下注射器 (2 mL) を使用して、膝を移動、等張食塩水の 1-2 mL を注入し、室温ですべての滑液を吸います。
   4. 4 時間以内の任意の残骸を削除する 40 μ m ナイロン携帯こし器を通って滑膜の気体をフィルターします。
5. RbSF MSCs の文化
   1. 50 mL 遠沈管、室温で 10 分間、1,500 rpm で遠心分離フィルターの気体を収集します。
   2. 遠心分離後に上清を破棄、PBS でペレットを洗浄、完全な培養液中でペレットを再懸濁します、プレート 100 mm 料理中。
   3. 37 ° c 5% CO₂を含む加湿雰囲気で料理を孵化させなさい。
   4. 48 時間後に、任意の非付着性細胞を除去する新鮮な培地で料理を補充します。0 (P0) の通路として 2 週間週 2 回、媒体を交換します。
      注: 約 1 × 10⁴付着性のセルが必要があります。実行可能なセル/平方フィートの ml は約 2 × 10²/mL です。
   5. 初期のめっきの後 14 日後の培養皿で多くの植民地を形成している必要があります。直径 2 mm 以上のコロニーを選択します。マーク選択したコロニーが皿の底に彼らのまわりを追跡することであります。
   6. < 2 mm 幅、セルのスクレーパーを使用してコロニーを破棄します。0.25% トリプシン、クローニング シリンダーを使用しての約 5 μ L で選択したコロニーを消化し、通路 1 (P1) として植民地を新しい料理に転送します。
6. 術後の動物の世話
   1. 術後監視と麻酔からの回復のための標準的な制度運用手順に従います。
   2. 意識を取り戻したがそれまでウサギの 10 分ごとのバイタル サインを監視します。最終的に、理性的な動物を檻に転送します。それは完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けているウサギは返されません。
   3. 術後、0.1% ポビドン ヨード、3 日間の日 x 2 とサイトを消毒します。

2. CD90 正磁気活性化セルの並べ替え (MAC) rbSF MSCs と初代培養の

1. サンプル準備
   1. セルの周りに達する場合 80% の confluency、培地を吸引、0.25% の 1-2 の mL を追加してそれぞれの皿にトリプシン-EDTA。
   2. 細胞の剥離を許可するように 2 〜 3 分の料理を孵化させなさい。
   3. 一度セルを取り外したら、トリプシンを不活化する培地の等しい量を追加します。
   4. 細胞懸濁液を 40 μ m 細胞のストレーナー通過 15 mL チューブに濾液を収集し、後、スピンダウン 600 × g 10 分間室温でのセル。
   5. バッファーを実行する MAC で細胞ペレットを再懸濁します (PBS、pH 7.2, 0.5% ウシ血清アルブミン、2 ミリメートルの EDTA) のセル数をカウントすると。
2. 磁気ラベリング
   注: は、列、スタンド、および区切り記号 (材料の表を参照) を含むキットを並べ替え磁気活性化細胞と rbSF MSCs を並べ替えます。
   1. 診断を使用して細胞の数を決定します。
   2. 4 ° C で 10 分間 300 × g の細胞懸濁液を遠心分離します。完全に上清を吸引します。
   3. 10 の⁷の合計セルごと再懸濁バッファーの 80 μ L を追加します。
   4. ^{10 総細胞、}モノクローナル抗家兎 CD90 抗体の共役のマイクロ ビーズの 20 μ L を追加します。
   5. 磁気ビーズと均等に管内細胞をミックスし、暗闇の中で 15 分間の 4 ° C でそれらを孵化させなさい。
   6. チューブに 1 mL の 10 の⁷セルごとのバッファーを追加し、セルを洗浄する 4 ° C で 10 分間 300 × g で遠心分離します。遠心分離後、上清を破棄します。
   7. 500 μ L の 10 の⁷セルごとのバッファーでペレットを再懸濁します。
3. 磁気分離
   1. 磁気分離装置の磁気フィールドに前面に列翼を持つ列を配置します。
   2. 10 の⁷セルごとのバッファーの 500 μ L と磁気分離装置 (MS) 列をすすいでください。
   3. 列に単一細胞懸濁液を転送します。これらのラベルのない細胞を破棄する磁場を通過する否定的な細胞ができます。
   4. 列バッファーの 500 μ L で 1-2 x 10 の⁷セルごと洗って流れを破棄します。
   5. 遠心分離機管 (15 mL) に列を転送します。
   6. 列に 1 mL の 10 の⁷セルごとのバッファーを追加し、磁気標識細胞を洗い流すため列にプランジャーをすぐにプッシュします。
   7. CD90 の純度を高めるため MS 欄に前述の手順を繰り返して、⁺細胞は、溶出画分を豊かにすることができます。
   8. 300 × g 10 分で細胞懸濁液を遠心、上清を吸引、培養培地でそれを再懸濁します。
4. 文化、CD90 の⁺ rbSF MSCs
   1. 磁気活性化細胞選別後 100 mm の料理の細胞を接種します。
   2. 37 ° c 5% CO₂加湿セル インキュベーターで料理を孵化させなさい。
   3. 初代培養の 80-90% の合流点を達成すると、約 7-10 日で消化 0.25% トリプシン-EDTA と通路付着性のセル 2 (P2) の通路に 1:2 の希釈でそれら。
   4. 同じメソッドを使用して、細胞を通過通過 3 (P3)の in vitroアッセイに使用ことができます。
      注: サブカルチャー、浄化後約 1 × 10⁷ rbSF MSCs が取得されます。

3. rbSF MSCs の同定

1. フローサイトメトリーによる rbSF MSCs の表面マーカー確認
   1. MSCs が P3 で 80-90% の合流は、PBS のセルを洗浄し、0.25% の 1 mL とそれらを扱うトリプシン-EDTA。次に、セルを取り外すまで 2 〜 3 分の 37 ° C で MSCs をインキュベートします。
   2. 10 mL の PBS を使用してセルを収穫、円錐管 (15 mL) にそれらを転送、室温で 5 分間 300 × g で遠心分離機のこと。
   3. 培養上清を捨てます。500 μ L の PBS で細胞ペレットを再懸濁し、1.5 mL チューブにそれを転送します。
   4. FITC 結合し、PE 標識抗体 (アイソタイプ、FITC CD34/PE CD45、FITC CD105 PE CD44) 4 ° C で暗闇の中で 1 時間の 1: 100 希釈を孵化させなさい
   5. 室温で 5 分間 300 × g でこの混合物を遠心し、各時間 5 分 300 × g で遠心分離によって PBS で 2 回細胞を洗浄します。培養上清を捨てます。
   6. 500 μ L の PBS で細胞を再懸濁します、細胞懸濁液を丸底チューブ (5 mL) に転送し、流れの cytometer を使用してそれを分析します。
      注: 2 つの蛍光チャンネル cytometer でデータの集録: 533/30 と 585/40。各アイソタイプ蛍光アイソタイプ コントロールを使用して、適切なレーザーの電圧を調整し、ピークの左と右の両方のエッジを表示する蛍光ヒストグラムを取得するために必要な最低の強度を設定します。統計解析 10,000 イベントの最小値を収集します。
2. RbSF MSCs の multidifferentiation
   注: 使用 P3 rbSF - multidifferentiationの in vitroアッセイの MSCs。
   1. 骨分化誘導
      1. 骨誘導培地を準備: L-アスコルビン酸-2-リン酸、α-グリセロリン酸の 10 ミリメートルと 100 の 50 mM を含む DMEM basic (1 x) デキサメタゾンの nM。
      2. 6 ウェル培養プレートの 10 の³セル/cm²で細胞を播くし、骨誘導培地でそれらを文化します。
      3. 3 週間ごとに 3 日間誘導培地を変更します。
      4. 分化が完了した後、室温で 30 分間 4% ホルムアルデヒドとセルを修正、セルの汚れ 1 %5 分洗いそれら 3 アリザリン赤と PBS¹⁵x。
   2. 脂肪細胞分化
      1. 脂肪分化誘導培地を準備: DMEM basic (1 x) インドメタシンの 100 mM、組換えヒトインスリンの 10 mg/mL、デキサメタゾン、1 mM と 0.5 mM 3-イソブチル-1 - メチルキサンチンから成る。
      2. P3 rbSF MSCs の脂肪分化誘導培地で 3 週間治療します。
      3. 3 週間後オイル赤い O を使用して脂肪細胞の分化を確認する中性脂質液胞を染色します。常温で 30 分 4% ホルムアルデヒド溶液セルを修正し、洗い、そして PBS¹⁶3 x。
   3. 軟骨細胞分化
      1. 軟骨細胞誘導培地を準備: DMEM basic (1 x)、サプリメント、L-プロリン、100 nM デキサメタゾンの, ピルビン酸ナトリウムの L-アスコルビン酸-2-リン酸と 1 mM の 50 mM の 0.35 mM TGFβ1、1% の 10 ng/mL から成る。
      2. ペレット培養軟骨細胞誘導を使用します。MSCs ではペレットを形成するポリプロピレン チューブ (15 mL) で 10 分間 1500 rpm - 5 × 10⁵ P3 rbSF を遠心します。
      3. ペレットを培養軟骨細胞誘導培地で 3 週間。
      4. 3 週間ごとに 3 日間媒体を変更します。
      5. 3 週間誘導後パラフィン包埋細胞ペレットを埋め込む、4 mm スライスにセクションおよび 0.1% を使用してそれらを染色トルイジン ブルー¹⁷部屋の温度で 30 分間。
3. 総 RNA の抽出および量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (qRT PCR) による解析
   1. 商業の RNA の抽出を使用して 3 週間分化誘導後細胞の総 RNA キット (材料の表を参照) を特定します。
      1. 培養皿で培養液を削除し、分離試薬の 1 つの mL を追加します。
      2. ソリューションが均質になるまで繰り返しピペッティングにより細胞を溶解させます。それを 3 分間室温でインキュベートします。
      3. 1.5 mL 遠心チューブに細胞ライセートを転送します。
      4. 100 μ L のクロロホルムを加えて手 15 x でそれを振る 3 分間室温で混合物を孵化させなさい。
      5. 4 ° C で 15 分間、12,000 × g でチューブを遠心分離します。培養上清を新しい 1.5 mL 遠心チューブに転送します。
      6. 500 μ L のイソプロパノールを加えて室温で 10 分間の RNA の沈殿物します。
      7. 12,000 × g で遠心する 10 minat 4 ° CRNA ペレットが管の下部に表示されます。
      8. 上澄みを除去し、75% エタノール 500 μ L を追加します。RNA ペレットを洗浄するか、数秒間管を簡単にスピンします。4 ° C で 5 分間 7,500 × g で遠心分離します。
      9. 残留エタノールを削除します。
      10. 10 μ L の DEPC 水に RNA ペレットを溶かし、氷の上にチューブを配置します。
   2. 逆 DNA 合成と cDNA に総 RNA の転写キット (材料の表を参照してください)。
      注: は、氷の上すべての次の手順を実行します。
      1. 逆のトランスクリプションのマスター ミックスを準備します。
      2. RNA の 1 μ g と各チューブに DNase 処理 RNA の 25 μ L を追加します。
      3. PCR サーマルサイクラーを使用して以下の温度で混合物を孵化させなさい: 26 ° C (ランダムな hexamers をアニールする) 10 分で 42 ° C 45 分 (逆転写) と (逆転写酵素を不活性化) に 10 分間、75 ° C。
      4. すぐに量的なリアルタイム PCR によって生成される cDNA を分析したり、-20 ° C で保存
   3. 定量的リアルタイム PCR システムと遺伝子発現解析を実行します。
      1. QRT PCR マスター ミックスを使用 (材料の表を参照) PCR を行う。Ppar γ、Agg、Runx2 GAPDH の PCR のプライマーは、表 1に表示されます。
      2. 2^−ΔΔCT法を用いた遺伝子発現を計算します。
      3. 標準的な統計解析ソフトウェアを使用して統計分析を行います。独立したサンプルの t 検定を使用して、グループの平均を比較します。

結果

分離・精製・ rbSF MSCs の文化:
このプロトコルは、rbSF-MSCs MSC 表面マーカー CD90 の式に基づいて分離するのに MAC を使用します。RbSF MSCs の分離・精製とキャラクタリゼーション ・体外培養のプロトコルのプロセス フロー図を図 1に示します。

磁気活性化細胞と CD90 (MAC) を並...

ディスカッション

滑液の MSCs の存在は、細胞ベースの治療のための代替を提供します。以前の研究では、受傷後の期間⁵と相関する可能性があります彼らの滑液で間葉系幹細胞の多量を含む傷害のサイトを示しています。滑液の MSCs は、負傷^18,19後自然治癒を高めるための組織に有益な可能性があります。SF MSCs の臨床応用は主な理由は関節で SF MSCs ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
MesenGro	StemRD	MGro-500 1703	Warm in 37 °C water bath before use
MesenGro Supplement	StemRD	MGro-500 M1512	Component of MSCs culture medium
DMEM basic	Gibco Inc.	C11995500BT	MSCs differentiation medium
Isotonic saline solution	Litai, China	5217080305	Cavity arthrocentesis procedure reagent
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	HyClone Inc.	SH30256.01B	PBS, free of Ca2+/Mg2+
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Inc.	10099-141	Component of MSCs culture medium
Povidone iodine solution	Guangdong, China	150605	Sterilization agent
75% ethanol	Lircon, china	170917	Sterilization agent
0.25% Trypsin/EDTA	Gibco Inc.	25200-056	Cell dissociation reagent
1% Penicillin-Streptomycin	Gibco Inc.	15140-122	Component of MSCs medium
MACS Running Buffer	MiltenyiBiotec	5160112089	Containing phosphate-buffered saline (PBS), 0.5% bovine serum albumin(BSA), and 2 mMEDTA
CD90 antibody conjugated MicroBeads	MiltenyiBiotec	5160801456	For magnetic activated cell sorting
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256	Component of MSCs chondrogenic differentiation
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756	Component of MSCs osteogenic differentiation
ITS	BD	354352	1%, Component of MSCs chondrogenic differentiation
L-proline	Sigma-Aldrich	P5607	0.35 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation
L-ascorbic acid-2-phosphate	Sigma-Aldrich	A8960	50 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation
3-isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I5879	0.5 mM, Component of adipogenic differentiation
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378	100 mM, Component of adipogenic differentiation
TGFβ1	Peprotech	100-21	10 ng/mL, Component of MSCs chondrogenic differentiation
α-glycerophsphate	Sigma-Aldrich	G6751	Component of MSCs osteogenic differentiation
CD34 Polyclonal Antibody, FITC Conjugated	Bioss	bs-0646R-FITC	Hematopoietic stem cells marker
Mouse antirabbit CD44	Bio-Rad	MCA806GA	Thy-1 membrane glycoprotein (MSCs marker)
CD45 (Monoclonal Antibody)	Bio-Rad	MCA808GA	Hematopoietic stem cells marker
CD105 antibody	Genetex	GTX11415	MSCs marker
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	I9030	Precipitates RNA extraction organic phases
Trichloromethane	Wenge, China	61553	Extract total RNA
Trizol	Invitrogen	15596-018	Isolate total RNA
SYBR green master mix	Takara Bio, Japan	RR420A	PCR test
cDNA synthesis kit	Takara Bio, Japan	RR047A	Reverse-transcribed to complementary DNA
Alizarin Red	Sigma-Aldrich	A5533	Staining of calcium compounds
Toluidine Blue	Sigma-Aldrich	89640	Staining of cartilaginous tissue
Oil Red O solution	Sigma-Aldrich	O1391L	Lipid vacuole staining
Equipment
MiniMACS Separator	MiltenyiBiotec	130-042-102	For magnetic activated cell sorting
MultiStand	MiltenyiBiotec	130-042-303	For magnetic activated cell sorting
MS Columns	MiltenyiBiotec	130-042-201	For magnetic activated cell sorting
Cell Strainer	FALCON Inc.	352340	40 μm nylon
Hemocytometer	ISOLAB Inc.	075.03.001	Cell counting
Falcon 100 mm dish	Corning	353003	Cell culture dish
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C	RNA Extraction and PCR
Centrifuge Tubes	Sigma-Aldrich	91050	Gamma-sterilized
High-speed centrifuge	Eppendorf	5804R	Centrifuge cells
Carbon dioxide cell incubator	Thermo scientific	3111	Cell culture
Real-Time PCR Instrument	Life Tech	QuantStudio	Real-Time quantitative polymerase chain reaction
Flow cytometer	BD Biosciences	342975	Cell analyzer
Pipettor	Eppendorf	O25456F	Transfer the liquid
Cloning cylinder	Sigma-Aldrich	C3983-50EA	Isolate and pick individual cell colonies
Sterile hypodermic syringe	Double-Dove, China	131010	Arthrocentesis procedure
Rabbit cage	Zhike, China	ZC-TGD	Restrain the rabbit