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Resumo

Este artigo apresenta um protocolo simples e económico para o simples isolamento e purificação de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial do coelho branco Nova Zelândia.

Resumo

Células-tronco mesenquimais (MSCs) são a fonte principal da célula para a terapia baseada em células. MSCs de líquido sinovial cavidade articular potencialmente poderiam ser usados para engenharia de tecidos de cartilagem. MSCs de líquido sinovial (SF-MSCs) foram considerados candidatos promissores para a regeneração articular, e seu potencial benefício terapêutico fez-lhes um tópico de pesquisa importante de tarde. SF-MSCs da cavidade do joelho do coelho Nova Zelândia branco podem ser empregados como um modelo otimizado translacional para avaliar humana medicina regenerativa. Por meio de CD90 à base magnética registrados da célula classificação tecnologias (MACS), este protocolo com sucesso Obtém coelho SF-MSCs (rbSF-MSCs) deste modelo de coelho e mais totalmente demonstra o fenótipo MSC dessas células induzindo os para diferenciar a osteoblastos, adipócitos e condrócitos. Portanto, esta abordagem pode ser aplicada em pesquisa da biologia celular e engenharia de tecidos, utilizando procedimentos e equipamentos simples.

Introdução

MSCs têm sido sugeridos como uma fonte valiosa para a medicina regenerativa, especialmente, para lesões da cartilagem. MSCs, incluindo osteoblastos, condrócitos, adipócitos, miócitos esqueléticos e células estromais viscerais, amplamente expandem as áreas de transplante de células-tronco devido a sua alta expansão taxa e linhagem multi diferenciação potencial1. MSCs podem ser isolados do esqueleto muscular, membrana sinovial, medula óssea e tecido adiposo2,3,4. As conclusões têm também confirmed a presença de MSCs no líquido sinovial, e anterior pesquisa identificou MSCs derivado de líquido sinoviais (SF-MSCs) como candidatos promissores para regeneração articular5,6.

No entanto, pesquisa e experimentação pré-clínica em amostras humanas estão sujeitas a muitas questões éticas. Em vez disso, os coelhos têm sido e continuam a ser os mais usados espécies animais para demonstrar que o transplante de MSCs pode reparar danos na cartilagem. Nos últimos anos, um número crescente de pesquisadores estudaram células-tronco mesenquimais coelho (rbMSCs), ambos em vitro e em vivo, como estas células são MSCs semelhantes ao ser humano em sua fisiologia celular biologia e tecido. Da mesma forma, os rbMSCs são capazes de aderir a superfícies plásticas, morfologia do eixo-fibroblasto como humanos MSCs. Além disso, amostras de mesenquimais coelho são simples e fáceis de obter7. Além disso, os pontos cruciais são que o rbMSCs expressar marcadores de superfície, tais como CD44, CD90 e CD105, e que o potencial de diferenciação de linhagem multi é preservada, que está de acordo com os critérios para a identificação de populações de MSC como definida pela sociedade internacional de terapia celular8,9. Em particular, chondroprogenitors de líquido sinoviais são capazes de não-hipertrófica condrogênese quando induzido por TGF-β1, tornando-os fontes de celular adequada para a cartilagem articular fenotipicamente regeneração10,11, 12.

No entanto, o isolamento de SF-MSCs é muito diferente de outros tecidos, incluindo o cordão umbilical, tecido adiposo, sangue periférico e medula óssea. Atualmente, as abordagens mais comuns para a purificação e a classificação de SF-MSCs são citometria de fluxo e Fima baseado no grânulo classificação, embora o método de citometria de fluxo requer um ambiente específico e altamente caro instrumentos13.

Este artigo apresenta um procedimento simples e minimamente invasivo coleção de amostras de líquido sinovial da Nova Zelândia coelhos brancos. Durante o procedimento, os MSCs-rbSF são estàvel expandido em vitro e então isolaram com CD90 positivo magnética do grânulo procedimentos baseados. Finalmente, o protocolo mostra como obter o MSCs com um elevado grau de pureza e viabilidade das fontes de células colhidos.

Neste protocolo, os rbSF-MSCs isoladas são caracterizadas com base na sua morfologia, expressão de marcadores específicos e pluripotência para células-tronco. Immunophenotyping baseados em citometria de fluxo revela uma expressão significativa e positiva de CD44 e CD105, Considerando que a expressão de CD45 e CD34 é negativa. Finalmente, um ensaio em vitro para rbSF-MSCs demonstra a diferenciação osteogênica, adipogenic e chondrogenic dessas células.

Protocolo

Todos os animais de experimentos foram conduzidos em conformidade com as diretrizes regionais do Comitê de ética, e todos os procedimentos de animais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e do uso Comissão de Shenzhen segundo pessoas Hospital, Universidade de Shenzhen.

1. isole e cultura as rbSF-MSCs

  1. Preparativos para o procedimento de animais
    1. Preparar com esqueleto maduro feminina Nova Zelândia coelhos brancos para a coleção de rbSF-MSCs. realizar um exame clínico dos coelhos um dia antes do procedimento de anestesia e artrocentese.
      Nota: o exame físico deve incluir peso (2.0-2.5 kg), gênero (feminino) e temperatura corporal, frequência respiratória e cardíaca. Intervalos de parâmetro para coelhos clinicamente saudáveis são 30-50 min para a taxa de respiração, 220-280 min para a frequência cardíaca e 38-39 ° C para a temperatura do corpo.
    2. Rapidamente os animais para 6 h antes da anestesia.
  2. Preparações e procedimento para a anestesia de animais
    1. Conter o coelho com uma gaiola (ver Tabela de materiais) e em seguida, injetar 3% pentobarbital de sódio na veia marginal da orelha, na dose de 1 mL/kg para anestesia geral.
    2. Coloque o coelho em uma posição confortável e dorsal-reclinada.
    3. Monitore a frequência respiratória, frequência cardíaca e temperatura do corpo do coelho durante a anestesia.
    4. Use pomada oftalmológica em seus olhos, para evitar o ressecamento durante a anestesia.
    5. Avalie a profundidade da anestesia classificação14 de Guedela seguir.
  3. Preparação para MSCs isolamento e cultivo
    1. Para cultivar rbSF-MSCs, preparar 500 mL de meio de cultura comercial (ver Tabela de materiais) suplementado com 10% de comercial complementar (ver Tabela de materiais), 10% soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina.
    2. Incube o meio de cultura a 37 ° C em banho-maria.
    3. Prepare 500 mL de soro fisiológico de tampão fosfato (PBS) para isolamento de célula e a lavagem da célula.
    4. Prepare 100 mL de solução salina isotônica para o procedimento de artrocentese cavidade do joelho.
  4. Coleção de uid disquete sinovial articular do joelho do coelho
    1. Selecione uma área de cerca de 5 x 5 cm de tamanho em torno do joelho e raspar o pelo de coelho dessa área usando um barbeador elétrico de segurança.
    2. Alternadamente, desinfectar o local de procedimento 3 x com povidona iodo solução e 75% de etanol. Em seguida, aplica sterile drapeja depois que a área tem secado completamente.
    3. Injectar 1-2 mL de solução salina isotônica, usando uma seringa hipodérmica estéril (2 mL), para a cavidade articular do joelho do espaço articular lateral, mova o joelho x 3-4 e depois sugar todo o líquido sinovial em temperatura ambiente.
    4. Filtre o fluid sinovial através de um filtro de célula de nylon µm 40 para remover quaisquer detritos dentro de 4 h.
  5. Cultura dos rbSF-MSCs
    1. Recolha o filtrado fluid em tubos de centrífuga de 50 mL e centrifugar a 1.500 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente.
    2. Descartar o sobrenadante após a centrifugação, lavar a pelota com PBS, resuspenda o pellet com meio de cultura completo e então o meio em pratos de 100 mm da placa.
    3. Incube os pratos a 37 ° C numa atmosfera umidificada contendo 5% de CO2.
    4. Após 48 h, reabastecer os pratos com meio fresco para remover todas as células não-aderentes. Substitua o médio duas vezes por semana durante 2 semanas como passagem 0 (P0).
      Nota: Deve haver cerca de 1 x 104 células aderentes. Células/ml viável em SF são cerca de 2 x 102/mL.
    5. Após 14 dias o chapeamento inicial, muitas colônias devem ter se formado nos pratos de cultura. Selecione as colônias maiores que 2 mm de diâmetro. Mark, onde localizam-se as colônias selecionadas traçando sua circunferência na parte inferior do prato.
    6. Descarte as colônias < 2 mm de largura, utilizando raspadores de célula. Digerir as colônias selecionadas com cerca de 5 µ l de tripsina 0,25%, usando um cilindro de clonagem e transferir as colônias para um novo prato como passagem 1 (P1).
  6. Cuidados pós-operatórios de animais
    1. Siga os procedimentos de funcionamento institucionais padrão para acompanhamento pós-operatório e recuperação da anestesia.
    2. Monitore os sinais vitais o cada 10 min coelho até que ele recuperou a consciência. Finalmente, transfira o animal consciente para a gaiola. Não retornam um coelho que se submeteu a cirurgia para a companhia de outros animais até que ele se recuperou totalmente.
    3. Pós-operação, desinfecte o local com 0,1% de iodopovidona, 2x ao dia por 3 dias.

2. CD90-positivo magnético ativado celular classificação (MACS) do rbSF-MSCs e cultura primária

  1. Preparação da amostra
    1. Quando as células chegam em torno de confluência de 80%, Aspire o meio e em seguida, adicione 1-2 mL de 0,25% Trypsin-EDTA para cada prato.
    2. Incube os pratos para 2-3 min permitir o desprendimento de células.
    3. Uma vez que as células são desanexadas, adicione uma quantidade igual de meio de cultura para inactivar a tripsina.
    4. Passar a suspensão de células através de um filtro de célula de 40 µm, recolher o filtrado em um tubo de 15 mL e em seguida girar para baixo as células a 600 × g por 10 min à temperatura ambiente.
    5. Resuspenda o pellet de células em MACS executando o tampão (PBS, pH 7.2, albumina de soro bovino 0,5% e 2 mM EDTA) e em seguida, contar o número de celular.
  2. Rotulagem magnética
    Nota: Classificar os MSCs-rbSF com uma kit contendo separadores (ver Tabela de materiais), um carrinho e colunas de classificação magnética-ativado da pilha.
    1. Determine o número de células usando um hemocytometer.
    2. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 300 × g por 10 min a 4 ° C. Completamente, Aspire o sobrenadante.
    3. Adicione 80 µ l de tampão de ressuspensão por 107 células total.
    4. Para 107 células total, adicione 20 µ l de microbeads conjugado com anticorpo monoclonal anticoelho CD90.
    5. Misture as esferas magnéticas e células uniformemente nos tubos e, em seguida, incube-os a 4 ° C por 15 min no escuro.
    6. Adicionar 1 mL de tampão por 107 células ao tubo e centrifugá-la a 300 × g por 10 min a 4 ° C, para lavar as células. Desprezar o sobrenadante após a centrifugação.
    7. Resuspenda o pellet em 500 µ l de buffer por 107 células.
  3. Separação magnética
    1. Coloque a coluna com as asas de coluna para a frente no campo magnético do separador magnético.
    2. Lave a coluna de separador magnético (MS) com 500 µ l de buffer por 107 células.
    3. Transferi a suspensão única célula na coluna. Deixe que as células negativas passar através do campo magnético para descartar essas células sem rótulo.
    4. Lavar a coluna 1-2x com 500 µ l de buffer por 107 células e descartar o escoamento.
    5. Transferi a coluna para um tubo de centrifugação (15 mL).
    6. Adicionar 1 mL de tampão de por 107 células para a coluna e então imediatamente empurrar o êmbolo para a coluna para retirar as pilhas etiquetadas magneticamente.
    7. Repita o procedimento acima com uma segunda Column MS para aumentar a pureza do CD90+ células, que podem enriquecer a fração eluted.
    8. Centrifugar a suspensão celular de 300 × g durante 10 minutos, aspirar o sobrenadante e ressuspendê-lo com meio de cultura.
  4. Cultura da CD90+ rbSF-MSCs
    1. Inocule as células em pratos de 100 mm, após a separação magnética celular ativado.
    2. Incube a 37 ° C numa incubadora de célula umidificado com 5% CO2pratos.
    3. Quando a confluência de 80-90% da cultura primária é alcançada, em aproximadamente 7-10 dias, digerir as células aderentes com 0,25% Trypsin-EDTA e passagem-los em uma diluição de 1:2 para fazer a passagem 2 (P2).
    4. Use o mesmo método para passar as células de passagem 3 (P3), que podem ser usadas para os ensaios em vitro .
      Nota: Após a sub-cultura e purificação, são obtidos aproximadamente 1 x 107 rbSF-MSCs.

3. identificação do rbSF-MSCs

  1. Confirmação de marcador de superfície das rbSF-MSCs por citometria de fluxo
    1. Quando os MSCs confluente de 80-90%, em P3, lavam-se as células com PBS e tratá-los com 1 mL de 0,25% Trypsin-EDTA. Em seguida, incube os MSCs a 37 ° C durante 2-3 minutos até que as células são desanexadas.
    2. Colher as células usando 10 mL de PBS, transferi-los para um tubo cónico (15 mL) e centrifugá-los a 300 × g por 5 min à temperatura ambiente.
    3. Descarte os sobrenadantes. Ressuspender as células em 500 µ l de PBS e transferir para um tubo de 1,5 mL.
    4. Incubar uma diluição de 1: 100 de anticorpos conjugado FITC e PE-conjugados (isotipo, FITC-CD34/PE-CD45, FITC-CD105/PE-CD44) por 1h no escuro a 4 ° C.
    5. Esta mistura a 300 × g por 5 min à temperatura de centrifugação e lavar as células duas vezes com PBS por centrifugação a 300 × g por 5 min cada tempo. Descarte os sobrenadantes.
    6. Ressuspender as células em 500 µ l de PBS, transferir a suspensão de células para um tubo de fundo redondo (5 mL) e analisá-lo usando um citômetro de fluxo.
      Nota: Aquisição de dados em um citômetro equipado com dois canais de fluorescência: 533/30 e 585/40. Para cada fluorescência isotype, usar o isotipo controle para ajustar a tensão apropriada do laser e definir a intensidade mínima necessária para obter um histograma de fluorescência que exibe as bordas esquerdas e direita do pico. Recolha um mínimo de 10.000 eventos para as análises estatísticas.
  2. Multidifferentiation dos rbSF-MSCs
    Nota: Uso P3 rbSF-MSCs para os ensaios multidifferentiation em vitro .
    1. Diferenciação osteogênica
      1. Prepare o suporte de indução osteogênica: DMEM basic (1x), contendo 50 milímetros de L-ascórbico ácido-2-fosfato 10 mM de α-glicerofosfato e 100 nM de dexametasona.
      2. As células a 103 células/cm2 em uma placa de cultura de tecidos de 6-poços de sementes e cultura-los no meio de indução osteogênica.
      3. Altere o meio de indução em 3 dias por 3 semanas.
      4. Consertar as células com formol 4% durante 30 min à temperatura ambiente, depois de concluída a diferenciação, as células de mancha com vermelho de alizarina 1% por 5 min e depois lavar os 3 x com PBS15.
    2. Diferenciação de Adipogenic
      1. Prepare o suporte de indução de adipogenic: DMEM basic (1x), consistindo de 100 mM de indometacina, 10 mg/mL de insulina humana recombinante, 1mm de dexametasona e 0,5 mM de 3-isobutil-1-methylxanthine.
      2. Trate os P3 rbSF-MSCs para 3 semanas no meio de indução de adipogenic.
      3. Após 3 semanas, mancha os vacúolos de lipídios neutros usando O vermelho de óleo para confirmar a diferenciação de adipogenic. Consertar as células em uma solução de formol 4% durante 30 min à temperatura ambiente e em seguida lavá-los 3x com PBS16.
    3. Chondrogenic diferenciação
      1. Prepare o suporte de indução de chondrogenic: DMEM basic (1x), consistindo de 10 ng/mL de TGFβ1, 1% de seu suplemento, 0,35 mM de L-prolina, 100 nM de dexametasona, 50mm de L-ascórbico ácido-2-fosfato e 1 mM de piruvato de sódio.
      2. Use o pellet de cultivo para a indução de chondrogenic. Centrifugue a 5 × 105 P3 rbSF-MSCs a 1500 rpm durante 10 minutos em um tubo de polipropileno (15 mL) para formar um pellet.
      3. Cultura as pelotas por 3 semanas com o meio de indução de chondrogenic.
      4. Altere o meio de cada 3 dias por 3 semanas.
      5. Após a indução de 3 semanas, incorporar o centrifugado com parafina, seção-lo em fatias de 4 mm e manchá-las usando 0.1% azul de toluidina por 30 min à temperatura ambiente de17.
  3. Extração de RNA total e análise por reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (qRT-PCR)
    1. Isolar o RNA total das células após a indução da diferenciação de 3 semanas usando a extração de RNA comercial kit (veja a Tabela de materiais).
      1. Remover o meio de cultura a placa de cultura e, em seguida, adicione 1 mL do reagente de isolamento.
      2. Lise as células pipetando repetidamente até que a solução é homogênea. -Incube à temperatura ambiente por 3 min.
      3. Transferi o lisado celular em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
      4. Adicione 100 µ l de clorofórmio, agitá-lo pela mão de 15x e incubar a mistura à temperatura ambiente por 3 min.
      5. Centrifugar o tubo a 12.000 × g por 15 min a 4 ° C. Transferi os sobrenadantes para um novo tubo de microcentrifuga de 1,5 mL.
      6. Adicionar 500 µ l de isopropanol e precipitar o RNA durante 10 minutos à temperatura ambiente.
      7. Centrifugar a 12.000 × g por 10 minat 4 ° C. A pelota do RNA deve ser visível na parte inferior do tubo.
      8. Remover o sobrenadante e em seguida, adicione 500 µ l de etanol a 75%. Brevemente, gire o tubo durante vários segundos para lavar a pelota do RNA. -Centrifugar a 7.500 × g por 5 min a 4 ° C.
      9. Remova o etanol residual.
      10. Dissolva a pelota do RNA em 10 µ l de água DEPC e coloque os tubos no gelo.
    2. Reverso transcrever total do RNA em cDNA com uma síntese de DNA kit (veja a Tabela de materiais).
      Nota: Execute todos os procedimentos a seguir no gelo.
      1. Prepare a mistura de mestre de transcrição reversa.
      2. Adicione 25 µ l de RNA DNase-tratados a cada tubo com 1 µ g de RNA.
      3. Incubar a mistura a temperaturas a seguir usando um termociclador PCR: 26 ° C durante 10 minutos (para permitir os hexâmeros aleatórios recozer), 42 ° C por 45 min (transcrição reversa) e 75 ° C por 10 min (inactivar o transcriptase reversa).
      4. Imediatamente analisar o cDNA resultante por PCR quantitativo em tempo real, ou armazená-lo a-20 ° C.
    3. Realizar a análise de expressão do gene com um sistema PCR quantitativo em tempo real.
      1. Use o qRT-PCR Master Mix (consulte Tabela de materiais) para realizar o PCR. Os primers PCR para GAPDH, Runx2, Agg e PPARγ estão listados na tabela 1.
      2. Calcule a expressão gênica usando o métodoΔΔCT 2−.
      3. Realizar uma análise estatística usando o software padrão estatístico. Use um teste t de amostras independentes para comparar os meios do grupo.

Resultados

Isolamento, purificação e cultura dos MSCs-rbSF:
Este protocolo usa MACS para isolar rbSF-MSCs, baseados na expressão do marcador de superfície MSC CD90. Um diagrama de fluxo de processo de rbSF-MSCs isolamento, purificação e caracterização e o protocolo de cultura em vitro é mostrado na Figura 1.

Morfologia celular após magnético celular ativado class...

Discussão

A existência de MSCs no líquido sinovial fornece uma alternativa para a terapia baseada em células. Estudos anteriores mostraram que a lesão sites contêm quantidades mais elevadas de células-tronco mesenquimais em seu líquido sinovial, que pode ser positivamente correlacionada com o período pós-lesão5. Os MSCs no líquido sinovial podem ser benéficos para o tecido, para reforçar a cura espontânea após uma lesão18,19. A aplic...

Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

Este estudo foi suportado financeiramente pelos seguintes subsídios: Fundação de ciências naturais da China (n. º 81572198; N. º 81772394); o fundo para a construção de alto nível de disciplina médica da Universidade de Shenzhen (n º 2016031638); a Fundação de pesquisas médicas da província de Guangdong, China (n. º A2016314); e ciência de Shenzhen e tecnologia de projetos (n. º JCYJ20170306092215436; Não. JCYJ20170412150609690; Não. JCYJ20170413161800287; Não. SGLH20161209105517753; Não. JCYJ20160301111338144).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
MesenGroStemRDMGro-500 1703Warm in 37 °C water bath before use
MesenGro SupplementStemRDMGro-500 M1512Component of MSCs culture medium
DMEM basicGibco Inc.C11995500BTMSCs differentiation medium
Isotonic saline solutionLitai, China5217080305Cavity arthrocentesis procedure reagent
Phosphate-Buffered Saline (PBS)HyClone Inc.SH30256.01BPBS, free of Ca2+/Mg2+
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco Inc.10099-141Component of MSCs culture medium
Povidone iodine solutionGuangdong, China150605Sterilization agent
75% ethanolLircon, china170917Sterilization agent
0.25% Trypsin/EDTAGibco Inc.25200-056Cell dissociation reagent
1% Penicillin-StreptomycinGibco Inc.15140-122Component of MSCs medium
MACS Running BufferMiltenyiBiotec5160112089Containing phosphate-buffered saline (PBS), 0.5% bovine serum albumin(BSA), and 2 mMEDTA
CD90 antibody conjugated MicroBeadsMiltenyiBiotec5160801456For magnetic activated cell sorting
Sodium pyruvateSigma-AldrichP2256Component of MSCs chondrogenic differentiation
DexamethasoneSigma-AldrichD1756Component of MSCs osteogenic differentiation
ITSBD3543521%, Component of MSCs chondrogenic differentiation
L-prolineSigma-AldrichP56070.35 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation
L-ascorbic acid-2-phosphateSigma-AldrichA896050 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation
3-isobutyl-1-methylxanthineSigma-AldrichI58790.5 mM, Component of adipogenic differentiation
IndomethacinSigma-AldrichI7378100 mM, Component of adipogenic differentiation
TGFβ1Peprotech100-2110 ng/mL, Component of MSCs chondrogenic differentiation
α-glycerophsphateSigma-AldrichG6751Component of MSCs osteogenic differentiation
CD34 Polyclonal Antibody, FITC ConjugatedBiossbs-0646R-FITCHematopoietic stem cells marker
Mouse antirabbit CD44Bio-RadMCA806GAThy-1 membrane glycoprotein (MSCs marker)
CD45 (Monoclonal Antibody)Bio-RadMCA808GAHematopoietic stem cells marker
CD105 antibodyGenetexGTX11415MSCs marker
Isopropyl alcoholSigma-AldrichI9030Precipitates RNA extraction organic phases
TrichloromethaneWenge, China61553Extract total RNA
TrizolInvitrogen15596-018Isolate total RNA
SYBR green master mixTakara Bio, JapanRR420APCR test
cDNA synthesis kitTakara Bio, JapanRR047AReverse-transcribed to complementary DNA
Alizarin RedSigma-AldrichA5533Staining of calcium compounds
Toluidine BlueSigma-Aldrich89640Staining of cartilaginous tissue
Oil Red O solutionSigma-AldrichO1391LLipid vacuole staining
Equipment
MiniMACS SeparatorMiltenyiBiotec130-042-102For magnetic activated cell sorting
MultiStandMiltenyiBiotec130-042-303For magnetic activated cell sorting
MS ColumnsMiltenyiBiotec130-042-201For magnetic activated cell sorting
Cell StrainerFALCON Inc.35234040 μm nylon
HemocytometerISOLAB Inc.075.03.001Cell counting
Falcon 100 mm dishCorning353003Cell culture dish
Microcentrifuge tubeAxygenMCT-150-CRNA Extraction and PCR
Centrifuge TubesSigma-Aldrich91050Gamma-sterilized
High-speed centrifugeEppendorf5804RCentrifuge cells
Carbon dioxide cell incubatorThermo scientific3111Cell culture
Real-Time PCR InstrumentLife TechQuantStudioReal-Time quantitative polymerase chain reaction
Flow cytometerBD Biosciences342975Cell analyzer
PipettorEppendorfO25456FTransfer the liquid
Cloning cylinderSigma-AldrichC3983-50EAIsolate and pick individual cell colonies
Sterile hypodermic syringeDouble-Dove, China131010Arthrocentesis procedure
Rabbit cageZhike, ChinaZC-TGDRestrain the rabbit

Referências

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