رسم الخرائط الأيض: رصد النشاط نازعة لاكتات مباشرة في الأنسجة

Summary

يمكننا وصف بروتوكول لرسم خرائط التوزيع المكاني للنشاط الأنزيمي للإنزيمات التي تولد نيكوتيناتميدي الأدنين وأميد النيكوتنك (NAD(P)H) + H + في عينات الأنسجة مباشرة.

Abstract

تعيين النشاط الأنزيمي في الزمان والمكان أمر بالغ الأهمية لفهم الأساس الجزيئي لسلوك الخلية في أنسجة طبيعية والمرض. فحوصات النشاط الأيضي في الموقع يمكن أن توفر معلومات عن التوزيع المكاني لنشاط التمثيل الغذائي داخل أنسجة. نحن نقدم هنا بروتوكولا مفصلاً لرصد نشاط إنزيم لاكتات نازعة في عينات الأنسجة مباشرة. لاكتات نازعة محدداً هاما لما إذا كان سيتم تحويل الجلوكوز المستهلكة للطاقة عن طريق تحلل الهوائية أو اللاهوائية. يتم توفير محلول يحتوي على لاكتات وند لقسم أنسجة مجمدة. سيتم تحويل الخلايا ذات النشاط العالي لاكتات نازعة لاكتات المقدمة إلى بيروفات، بينما في نفس الوقت تحويل توفير نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide (NAD) إلى NADH وبروتون، التي يمكن الكشف عنها استناداً إلى الحد من نيتروتيترازوليوم الأزرق إلى فورمازان، الذي هو تصور ترسبات زرقاء. يمكننا وصف بروتوكول مفصلة لمراقبة نشاط نازعة لاكتات في الجلد الماوس. تطبيق هذا البروتوكول، وجدنا أن النشاط نازعة لاكتات مرتفع في الخلايا الجذعية هادئة الشعرة داخل الجلد. وكشف تطبيق البروتوكول على الخلايا الجذعية الجنينية الماوس مثقف تلطيخ أعلى في استزراع الخلايا الجذعية الجنينية من الخلايا الليفية الجنينية الماوس. كشف تحليل للشريان الاورطي الماوس طازجة معزولة تلطيخ في خلايا العضلات الملساء عمودي للشريان الاورطي. يمكن استخدام المنهجية المقدمة إلى خريطة مكانياً نشاط الإنزيمات التي تولد بروتون في الأنسجة المجمدة أو الطازجة.

Introduction

فهم المواقع داخل الأنسجة التي يكون للإنزيمات مرتفعة أو منخفضة النشاط أمر ضروري لفهم التنمية وعلم وظائف الأعضاء. كثيرا ما تستخدم مستويات نسخة أو البروتين كالأمهات البديلات للنشاط الأنزيمي. وفي حين يمكن أن تكون مثل هذه الدراسات مفيدة، أنها لا توفر المعلومات التي يمكن أن تكون حاسمة بالنسبة لتحديد نشاط إنزيم في، مثل التعديلات بوستترانسلاشونال، ووجود البروتين المجمعات، أو الترجمة للانزيم سوبسيلولار. عندما يتم قياس النشاط الأنزيمي مباشرة، فإنه غالباً ما رصد في ليساتيس البروتين المتجانس التي لم تعد تحتوي على معلومات حول الخلايا الفردية داخل الخليط أو التوزيع المكاني للخلايا مع نشاط عالية أو منخفضة داخل أنسجة.

نحن نقدم هنا بروتوكول مفصل لرسم خرائط التوزيع المكاني للنشاط الأنزيمي داخل عينة أنسجة. وتستند المنهجية الدراسات السابقة مما يدل على أنه يمكن استخدام أملاح تيترازوليوم لتعريب النشاط ديهيدروجيناسيس، وريدوكتاسيس، وأوكسيداسيس في الأنسجة المجمدة¹. بهذه الأساليب، تتشكل formazan تستعصي على الحل المياه عندما يتم نقل البروتونات إلى سولت^2،تيترازوليوم³. نازعة الجلوكوز-6-فوسفات يولد نادف وبروتون، وتم الكشف عن نشاط تيترازوليوم. وقد تم رصد نازعة الجلوكوز-6-فوسفات في السمك المفلطح الأوروبي خلايا الكبد⁴، في الخلايا السنخية النوع 2 من الرئتين⁵ والنيفرون الكلي⁵. كما استخدمت أملاح تيترازوليوم لرصد النشاط transketolase في الأنسجة المجمدة⁶. واستخدمت مؤخرا نهجاً مماثلاً مراقبة نشاط dehydrogenases متعددة في نفس الأنسجة على الشرائح المجاورة⁷.

يصف لنا هنا أسلوب استخدام أملاح تيترازوليوم لمراقبة التوزيع المكاني للنشاط نازعة لاكتات (الشكل 1). ويمكن تحويل نازعة لاكتات بيروفات المتولدة عن تحلل اللبن، ورد فعل عكسي. النشاط نازعة لاكتات نتيجة لذلك محدداً هاما لدخول بيروفات دورة حمض تريكاربوكسيليك مقابل لها إفراز كما لاكتات. كثيرا ما تستخدم مستويات اللاكتات في الدم لتشخيص مجموعة من الأمراض، بما في ذلك السرطان^8،،من⁹¹⁰، نظراً لأنه يمكن الإشارة أن المرض أو الإصابة أضرار الخلايا وقد تم الإفراج عن الإنزيم.

وهناك أربعة اللاكتات نازعة الجينات: لدها، لدب، لدهك، ولدهد¹¹. ويعتقد أن نشأت من الازدواجية في أوائل الجينات لدها¹²لدها ولدهب. رابطة حقوق الإنسان النشط تيترامير ويمكن أن تشكل لدها ولدب هوموتيتراميرس وهيتيروتيتراميرس مع بعضها البعض. ويقال لدها أن يكون أعلى النسب بيروفات، بينما يقال لدهب تقارب أعلى لاكتات، وترتبط بشكل تفضيلي بتحويل اللاكتات إلى بيروفات¹³. مروج لدها يحتوي على مواقع الربط ل HIF1α، كميك و FOXM1 عوامل النسخ¹¹. وباﻹضافة إلى ذلك، مثل العديد من الآخرين الإنزيمات جليكوليتيك^14،15، يمكن تعديل رابطة حقوق الإنسان بواسطة التعديلات بوستترانسلاشونال. يمكن فوسفوريلاتي مستقبلات عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية 1 لدها Y10، الذي يشجع تشكيل تيترامير، أو Y83، الذي يعزز NADH الركازة ملزمة¹⁶. كما يمكن لدها أسيتيلاتيد¹⁷. لهذه الأسباب، يتطلب فهم كامل لنشاط رابطة حقوق الإنسان رصد مستويات البروتين رابطة حقوق الإنسان، بل نشاط الإنزيم كذلك.

بالإضافة إلى الأسلوب نحن الحاضرين هنا، استخدمت نهج أخرى لمراقبة نشاط نازعة لاكتات. ويمكن رصد نشاط نازعة لاكتات سبيكتروفوتوميتريكالي في البروتين المتجانس ليستي. توليد NADH كما يتم تحويل اللاكتات إلى بيروفات يمكن أن يقاس استناداً إلى امتصاص في 340 نانومتر، بينما يمكن رصدها في اختفاء NADH كما يتم تحويل بيروفات إلى لاكتات¹⁸. وقد تم رصد نشاط نازعة لاكتات أيضا مع التصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي). ¹³ ج-بيروفات يمكن أن تدار وتحويل بيروفات لاكتات يمكن رصدها بنسبة [1-¹³ج] لاكتات/[1-¹³ج] بيروفات. ارتفاع نسب [1-¹³ج] لاكتات/[1-¹³ج] بيروفات قد لوحظت في أنسجة السرطان¹⁹. بينما النهج القائم على التصوير بالرنين المغناطيسي يمكن أن تقدم معلومات عن النشاط نازعة لاكتات في العادي وأمراض الأنسجة، المنهجيات التي لا تملك القرار بحاجة إلى تحديد مستوى النشاط في الخلايا المحددة. المنهجية المقدمة هنا يمكن تقديم معلومات عن نشاط نازعة لاكتات في مجالات النسيج وحتى في الخلايا المفردة.

استخدام فحوصات النشاط في الموقع ، وجدنا أن نشاط نازعة لاكتات مرتفع في الخلايا الجذعية جريب الشعر من الجلد الماوس²⁰. كما استخدمنا الطريقة لرصد نشاط نازعة لاكتات في استزراع الخلايا الجذعية الجنينية والعثور على النشاط أعلى في الخلايا الجذعية من الطبقة المغذية. وأخيراً، رصد نشاط نازعة لاكتات في الشريان الاورطي الماوس الطازجة ولاحظ تلطيخ في خلايا العضلات الملساء. يصف لنا هنا بروتوكول مفصلة لمراقبة نشاط نازعة لاكتات في الجلد الماوس المجمدة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

جميع التجارب التي وصفت بموافقة "اللجنة رعاية الحيوان" في جامعة كاليفورنيا، لوس أنجلوس.

1-إنشاء شرائح جلد الماوس المجمدة

1. Euthanize الفئران وفقا لسياسة المؤسسة.
   ملاحظة: اتباع سياسة مؤسسية للملابس الواقية. يجب أن يوافق جميع البروتوكولات التي تنطوي على الحيوانات "لجنة رعاية الحيوان المؤسسية".
2. إزالة الشعر الماوس مع المتقلب شعر الحيواني.
3. جعل شقوق في الجلد باستخدام مقص. استخدام الملقط، رفع الجلد بعيداً عن الماوس. باستخدام مقص، قص المقطع الجلد بعيداً.
4. ملء كريومولد مع تجميد كاشف مركب (انظر الجدول للمواد).
5. مكان الجلد المقاطع إلى كريومولدس مليئة باستخدام الملقط إبرة الآنف. توجيه الجلد حيث أن شرائح الأنسجة سوف تولد مقطع عرضي في الجلد من البشرة إلى الأدمة واللحمة والعضلات (الشكل 2).
   ملاحظة: إذا كان ذلك ممكناً، جبل التجريبي ومكافحة الفئران معا في كريومولد نفسه حتى يمكن مقطوع على الشريحة نفسها ومعالجتها معا. الحرص على عدم خلق فقاعات.
6. وضع كريومولد على سطح مستو كتلة من الثلج الجاف دلو الجليد وتتيح تجميد. وتواصل مراقبة التوجه للجلد. تعديل إذا لزم الأمر.
   ملاحظة: ارتداء القفازات المبردة عند التعامل مع الثلج الجاف.
7. نقل كريومولدس في ثلاجة-80 درجة مئوية للتخزين. يمكن الاحتفاظ بالعينات في الثلاجة لمدة 3 أشهر تقريبا دون فقدان كبير للنشاط الأنزيمي. لا تدع الأجزاء المجمدة تجف.
8. استخدام كريوستات في-20 درجة مئوية، الأنسجة شريحة لإنشاء الأقسام 7-10 ميكرون سميكة ل مورفولوجية الجلد أفضل²¹.

2-إعداد الشرائح لتلطيخ

1. إنشاء مجموعة الشرائح لفحصها. وتشمل شريحة تحكم التي سيتم حجب ند وعنصر تحكم آخر الشرائح التي الركازة، لاكتات، سيتم اقتطاع. وتشمل شريحة تحكم إيجابي من كتلة أنسجة مجمدة سابقا بالتحقيق.
2. بإيجاز فيكس الشرائح التي تحتوي على أقسام الجلد مع 4% فورمالين لمدة 5 دقائق أما بواسطة بيبيتينج 1 مل من 4% فورمالين على الشريحة، أو عند تجهيز شرائح متعددة، بغمس الشرائح في وعاء يحتوي على 4% فورمالين.
   ملاحظة: تثبيت البرنامج سيكفل الجلد لا تقشر من الشرائح أثناء الإجراءات التالية والحفاظ على مورفولوجية الجلد.
   تنبيه: الفورمالين مادة مسرطنة وخطرة؛ ارتداء القفازات، لا تدع أنها تلمس جلدك وتنفيذ هذه الخطوة في غطاء الأبخرة كيميائية.
3. أغسل الشرائح مع مالا يقل عن 1 مل الفوسفات مخزنة المالحة، درجة الحموضة 7.4، كل شريحة أما عن طريق بيبيتينج أو غمس.

3-إعداد تلطيخ الحل

1. دوامة الكواشف معا لتلطيخ نازعة لاكتات النشاط (50 مم تريس الأس الهيدروجيني 7.4، 750 ميكرون NADP، 80 ميكرومتر phenazine ميثوسولفاتي (PMS) وكلوريد نيتروتيترازوليوم الأزرق ميكرومتر 600 ولاكتات 30 ملم) في أنبوب حجم مناسب اعتماداً على مقدار التلوين الحل المطلوب.
   ملاحظة: 1 مل كافية لتغطي كامل شريحة واحدة.
2. تعد حلاً ثانية التي يوجد جميع الكواشف ما عدا NAD. إعداد حل ثالث فيه جميع الكواشف موجودة ما عدا لاكتات.

4-احتضان الشرائح في تلطيخ الحل

1. بلطف بيبيت الحل المصبوغة أو حلول السيطرة على استعداد الشرائح يشمل المقطع بأكمله (1 مل غير كافية لشريحة واحدة). إذا كان يجري تجهيز شرائح متعددة معا، وتراجع كافة الشرائح في الحل المصبوغة في نفس الوقت (تأكد من الحاوية وقد حل ما يكفي لتغطي كامل المقطع الأنسجة).
2. احتضان الشرائح في بيئة هوميديفيد على 37 درجة مئوية في الظلام. إذا كان تلطيخ الحل فوق الشريحة، ضع الشريحة في بيئة هوميديفيد لمنع التبخر.

5-جهاز عرض الشرائح

1. مراقبة تحويل الحل المصبوغة من واضحة إلى الأزرق بالمعاينة البصرية. عندما وصلت العينات إلى المستوى المنشود من الزرقة، التوقف عن رد فعل عن طريق إزالة الحل المصبوغة.
   ملاحظة: للجلد، يكفي 10 دقيقة. الوقت سيتوقف على الجهاز والنشاط الأنزيمي.
2. شطف الشرائح مع الفوسفات مخزنة المالحة قبل بيبيتينج (1 مل غير كافية لكل شريحة) أو غمس.
   ملاحظة: يجب الاحتفاظ أي العينات التي سيتم مقارنتها ببعضها البعض في حل المصبوغة لنفس المقدار من الوقت.

6-كونتيرستين وجبل

1. بيبيت كونتيرستاين على الشرائح عند الشرائح وصلت إلى مستوى مناسب من الزرقة.
   ملاحظة: سوف توفر كونتيرستينس التي بدورها النواة أحمر أو أخضر الجيدة النقيض الأزرق تم إنشاؤها بواسطة formazan مرسب.
2. جبل مع مائي أو غير المائية تصاعد المتوسطة²². قطرات واحد إلى ثلاثة (40-50 ميليلتر) من تصاعد المتوسطة يكفي تبعاً لحجم بكشف الغطاء.

7-صورة الشرائح وتحديدها كمياً

1. صورة الشرائح تحت مجهر خفيفة. تأخذ صوراً لتجريبية ونماذج التحكم وكافة عناصر سلبية في 10 X 20 X و 40 X التكبير.
2. تحديد كثافة وصمة عار الزرقاء في مناطق مختلفة مع برمجيات تحليل الصورة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

أننا قد أبلغوا نتائج لفحوصات في الموقع النشاط في الماوس الجلد²⁰. كما هو موضح في الشكل 3، لاحظنا أعقبت ارتفاع مستويات النشاط نازعة لاكتات في الخلايا الجذعية جريب الشعر في قاعدة الشعرة عند الإجراءات الموصوفة أعلاه. هذه النتائج كانت تؤكده ا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يمكن استخدام الأسلوب الموصوفة هنا لرصد نشاط نازعة لاكتات أو غيرها الإنزيمات الاستقلابية التي تولد NADH أو نادف، في أنواع الخلايا المختلفة داخل أنسجة أو في أجزاء مختلفة من الأنسجة على مر الزمن. لاكتات نازعة إنزيم مهم لفهم بيولوجيا الخلايا الجذعية والأورام، والقدرة على مراقبة نشاط نازعة لاك...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical instruments			For collecting skin from euthanized mice
Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm	Fisher Scientific	NC9511236	For freezing mouse skin
Tissue-Tek O.C.T. compound	Fisher Scientific	NC9638938	For mounting cryomolds
Ice bucket	Fisher Scientific	07-210-106
Dry Ice
Polysine Adhesion Slide	Fisher Scientific	12-545-78
4% formalin	Fisher Scientific	23-245-684	Dilluted in water
phosphate buffered saline, pH 7.4
vortex
Tris base	Fisher Scientific	23-245-684
NAD	Sigma-Aldrich	N7004
Phenazine methosulfate	Sigma-Aldrich	P9625
Nitrotetrazolium blue chloride	Sigma-Aldrich	N6876
Lithium L-lactate	Sigma-Aldrich	L2250	Substrate
37°C incubator (or tissue culture incubator)
Braziliant! Counter stain	Anatech	861	Counter stain
Mounting medium	Vector Laboratories	H-5000
Cover slips for slides	Fisher Scientific	12-544D
Light microscope