Asignación de metabolismo: Supervisar la actividad de la deshidrogenasa del lactato directamente en el tejido

Resumen

Se describe un protocolo para el mapeo de la distribución espacial de la actividad enzimática de las enzimas que generan nicotinatmide adenina-dinucleótido-fosfato (NAD(P)H) + H + directamente en muestras de tejido.

Resumen

Asignación de actividad enzimática en el espacio y el tiempo es fundamental para entender las bases moleculares del comportamiento celular en tejido normal y la enfermedad. In situ el análisis de la actividad metabólica puede proporcionar información sobre la distribución espacial de la actividad metabólica dentro de un tejido. Aquí proporcionamos un protocolo detallado para el seguimiento de la actividad de la enzima lactato deshidrogenasa directamente en muestras de tejido. Lactato deshidrogenasa es un factor determinante de si la glucosa consumida se convertirán en energía mediante glucólisis aeróbica o anaeróbica. Se proporciona una solución que contiene lactato y NAD a una sección de tejido congelado. Células con actividad alta lactato deshidrogenasa convierte el lactato siempre piruvato, mientras que al mismo tiempo convertir base de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) a NADH y un protón, que se puede detectar en la reducción de azul de formazán, que es visualizada como un precipitado de azul de nitrotetrazolio. Se describe un protocolo detallado para el seguimiento de actividad de lactato deshidrogenasa en piel de ratón. Aplicación de este protocolo, se encontró que la actividad de la lactato deshidrogenasa es alta en las células de vástago del folículo quieto dentro de la piel. Aplicar el protocolo a células madre embrionarias de ratón cultivados reveló la coloración mayor en células de vástago embrionarias cultivadas de fibroblastos embrionarios de ratón. Análisis de la aorta de ratón recién aislado revelaron la coloración en las células musculares lisas perpendiculares a la aorta. La metodología proporcionada puede utilizarse para el mapa espacial de la actividad de las enzimas que generan un protón en el tejido fresco o congelado.

Introducción

Entender las ubicaciones dentro de los tejidos en los que las enzimas tienen actividad alta o baja es esencial para la fisiología y desarrollo de la comprensión. Niveles de transcripción o de la proteína a menudo se utilizan como sustitutos para la actividad enzimática. Mientras que este tipo de estudios puede ser informativo, no proporcionan información que puede ser crítico para la determinación de actividad de una enzima, tales como las modificaciones post-traduccionales, la presencia de complejos de la proteína, o la localización subcelular de la enzima. Cuando la actividad enzimática se mide directamente, a menudo se controla en los lysates de homogeneizados de proteínas que no contienen información sobre células individuales dentro de la mezcla o la distribución espacial de las células con actividad alta o baja dentro de un tejido.

Aquí proporcionamos un protocolo detallado para el mapeo de la distribución espacial de la actividad enzimática dentro de una muestra de tejido. La metodología se basa en estudios anteriores demostrando que sales de tetrazolio pueden utilizarse para localizar la actividad de Deshidrogenasas reductasas y oxidasas en el tejido congelado¹. Con estos métodos, un precipitado insoluble en agua se forma cuando los protones son transferidos a un tetrazolio sal^2,3. Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa genera NADPH y un protón y se ha detectado actividad de tetrazolio. Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa ha sido monitoreada en platija Europea hepatocitos⁴, en las células alveolares tipo 2 de los pulmones⁵ y nefronas del riñón⁵. Sales de tetrazolio también se han utilizado para supervisar la actividad de la transcetolasa en tejido congelado⁶. Un acercamiento similar fue utilizado recientemente para supervisar la actividad de Deshidrogenasas múltiples en el mismo tejido en diapositivas adyacentes⁷.

Aquí describimos un método para utilizar sales de tetrazolio para supervisar la distribución espacial de la actividad de la deshidrogenasa del lactato (figura 1). Lactato deshidrogenasa puede convertir el piruvato generado por glucólisis a lactato y la reacción inversa. Actividad de la lactato deshidrogenasa, en consecuencia, es un determinante importante de la entrada de piruvato en el ciclo del ácido tricarboxílico versus su secreción como lactato. Niveles de lactato en la sangre a menudo se utilizan para diagnosticar una variedad de enfermedades, incluyendo cáncer^8,9,10, porque puede indicar que la lesión o enfermedad ha dañado las células y la enzima ha sido liberada.

Hay cuatro genes de la lactato deshidrogenasa: LDHA, LDHB, LDHC y LDHD¹¹. Se cree que han surgido de la duplicación de un temprano LDHA gene¹²LDHA y LDHB. LDH es activa como un tetrámero y LDHA y LDHB pueden formar homotetramers y heterotetramers uno con el otro. LDHA se divulga para tener una mayor afinidad por el piruvato, mientras que LDHB se divulga para tener una mayor afinidad por el lactato y preferentemente convertir lactato a piruvato¹³. El promotor LDHA contiene sitios de Unión para los HIF1α, cMYC y FOXM1 transcripción factores¹¹. Además, como muchas otras enzimas glicolíticas^14,15, LDH puede ser modificada por modificaciones post-traduccionales. Receptor de factor de crecimiento fibroblástico 1 puede fosforilan LDHA Y10, que promueve la formación de tetrámero, o Y83, que promueve la NADH sustrato Unión¹⁶. LDHA también puede ser acetilado¹⁷. Por estas razones, una comprensión completa de la actividad LDH requiere supervisión no sólo los niveles de proteínas LDH y actividad de la enzima.

Además el método que presentamos aquí, otros enfoques se han utilizado para supervisar la actividad de la lactato deshidrogenasa. Actividad de la deshidrogenasa de lactato puede ser monitoreado espectrofotométricamente en lisado homogenizada proteína. La generación de NADH como lactato se convierte en piruvato puede ser medida basada en absorbancia a 340 nm, mientras que la desaparición de NADH puede controlarse como piruvato es convertido a lactato¹⁸. Actividad de la lactato deshidrogenasa también ha sido monitoreado con la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI). ¹³ C piruvato puede ser administrada y la conversión de piruvato a lactato puede ser monitoreada como la relación entre [1 -¹³C] lactato / [1 -¹³C] piruvato. Elevados ratios de [1 -¹³C] lactato / [1 -¹³C] piruvato se han observado en tejido de cáncer¹⁹. Mientras que los enfoques basados en la MRI pueden proporcionar información sobre actividad de la deshidrogenasa del lactato en condiciones normales y los tejidos de la enfermedad, las metodologías no tienen la resolución necesaria para determinar el nivel de actividad en células específicas. La metodología que aquí puede proporcionar información sobre la actividad de la lactato deshidrogenasa en las áreas de tejido e incluso en las células.

Mediante ensayos de actividad en situ , encontramos que la actividad de la lactato deshidrogenasa es alta en las células de vástago del folículo de pelo de piel de ratón²⁰. También se usó el método para monitorear la actividad de lactato deshidrogenasa en las células madre embrionarias cultivadas y la actividad es mayor en las células de la capa de alimentador. Finalmente, supervisar la actividad de la lactato deshidrogenasa en aorta de ratón fresco y observó tinción en las células musculares lisas. Describimos aquí un protocolo detallado para el seguimiento de actividad de lactato deshidrogenasa en piel de ratón congelado.

Protocolo

Todos los experimentos descritos fueron aprobados por el Comité de cuidado Animal de la Universidad de California, Los Ángeles.

1. generar diapositivas de piel de ratón congelado

1. Eutanasia a ratones según política de la institución.
   Nota: Siga la política institucional para la ropa de protección. Todos los protocolos que implican animales deben ser aprobados por el Comité institucional de cuidado de animales.
2. Quitar el pelo del ratón con un recortador de pelo.
3. Hacer incisiones en la piel con unas tijeras. Con unas pinzas, levantar la piel de ratón. Con unas tijeras, corte la sección de la piel.
4. Llenar el cryomold con congelación reactivo compuesto (véase Tabla de materiales).
5. Secciones de piel lugar en rellenos cryomolds con unas pinzas de punta de aguja. Oriente la piel de modo que rebanadas de tejido generará una sección transversal de la piel desde la epidermis a la dermis, la hipodermis y el músculo (figura 2).
   Nota: si es posible, montaje experimental y de control ratones juntos en la misma cryomold por lo que pueden ser seccionadas en la misma diapositiva y procesados juntos. Tenga cuidado de no para crear burbujas.
6. Lugar cryomold en la superficie plana de un bloque de hielo seco en un cubo de hielo y permita que se congele. Siguen la orientación de la piel. Ajustar si es necesario.
   Nota: Utilice guantes criogénicos cuando manipule el hielo seco.
7. Transferencia de cryomolds en un congelador de-80 ° C para el almacenamiento. Las muestras se pueden mantener en el congelador durante aproximadamente 3 meses sin pérdida significativa de la actividad enzimática. No deje que las secciones congeladas secar.
8. Usando un criostato a-20 ° C, rodaja de tejido para crear secciones 7-10 μm de grosor de la piel mejor morfología²¹.

2. preparación de portaobjetos para tinción

1. Establecer el conjunto de diapositivas para ser probado. Un control deslizante en el cual se destinará NAD y otro control slide en el que el sustrato, lactato, será retenida. Incluyen un portaobjetos de control positivo de un bloque de tejido congelado previamente investigado.
2. Brevemente arreglar diapositivas que contiene secciones de piel con formol al 4% durante 5 minutos por Pipetear 1 mL de formol al 4% en la diapositiva o al procesar varias diapositivas, sumergiendo los portaobjetos en un recipiente con formalina al 4%.
   Nota: Se asegurará la fijación de que la piel no pele de las correderas en los siguientes procedimientos y conservar la morfología de la piel.
   PRECAUCIÓN: El formol es cancerígeno y peligroso; guantes, no dejarlo tocar su piel y realizar este paso en una campana de humos químicos.
3. Lavarlas portaobjetos con al menos 1 fosfato mL con tampón salino, pH 7,4, por porta por pipeteo o inmersión.

3. preparar solución de tinción

1. Reactivos juntos Vortex para la tinción de actividad de la deshidrogenasa del lactato (50 mM de Tris pH 7.4, 750 μm NADP, 80 μm phenazine methosulfate (PMS), 600 μm azul de nitrotetrazolio cloruro y lactato de 30 mM) en un tubo de tamaño adecuado dependiendo de la cantidad de tinción solución necesaria.
   Nota: 1 mL es suficiente para cubrir completamente una diapositiva.
2. Preparar una segunda solución en la que todos los reactivos están presentes excepto NAD. Preparar una solución tercera en la que todos los reactivos están presentes excepto lactato.

4. Incube los portaobjetos en solución de tinción

1. Soluciones de control en las diapositivas preparadas cubriendo la sección en su totalidad o pipetee suavemente la solución de tinción (1 mL es suficiente para una diapositiva). Si se procesan juntos varias diapositivas, sumerja todas las diapositivas en la solución de tinción a la vez (Asegúrese de que el envase tiene suficiente solución para cubrir completamente la sección del tejido).
2. Incubar los portaobjetos en un ambiente humidificado a 37 ° C en la oscuridad. Si la solución de tinción es encima de la diapositiva, coloque el portaobjetos en un ambiente humidificado para evitar la evaporación.

5. supervisar las diapositivas

1. Controlar la conversión de la solución de tinción de claro a azul por inspección visual. Cuando las muestras han alcanzado el nivel deseado de color azulado, detener la reacción mediante la eliminación de la solución de tinción.
   Nota: Para la piel, 10 minutos es suficiente. El tiempo dependerá del órgano y la actividad enzimática.
2. Enjuague los portaobjetos con tampón fosfato salino mediante pipeteo (1 mL es suficiente para cada diapositiva) o inmersión.
   Nota: Las muestras que se compararán entre sí deben mantenerse en solución de tinción para la misma cantidad de tiempo.

6. contratinción y Monte

1. Pipeta de un contraste en las diapositivas cuando las diapositivas han alcanzado un nivel adecuado de color azulado.
   Nota: Counterstains que los núcleos rojo o verde proporcionará buen contraste con el azul creado por el precipitado precipitante.
2. Monte con acuoso o no acuoso medio²²de montaje. Una a tres gotas (40-50 μL) de medio de montaje es suficiente dependiendo del tamaño de la hoja de cubierta.

7. diapositivas de imágenes y cuantificar

1. Imagen se desliza bajo un microscopio de luz. Tomar fotografías de experimental y las muestras de control y todos los controles negativos 10 X, 20 X y 40 aumentos.
2. Determinar la intensidad de la mancha azul en diferentes regiones con software de análisis de imagen.

Resultados

Hemos divulgado previamente resultados para en situ los ensayos de actividad en piel de ratón²⁰. Como se muestra en la figura 3, se observaron altos niveles de actividad de lactato deshidrogenasa en las células madre de folículo piloso en la base del folículo del pelo cuando los procedimientos describen anteriormente fueron seguidos. Estos resultados fueron corroborados por célula de fluorescencia activada clasificación ...

Discusión

El método aquí descrito puede utilizarse para supervisar la actividad de la deshidrogenasa del lactato u otras enzimas metabólicas que generan NADH o NADPH, en diferentes tipos celulares dentro de un tejido o diferentes porciones de un tejido con el tiempo. Lactato deshidrogenasa es una enzima importante para la comprensión de la biología de los tumores y las células madre, y la capacidad para monitorear la actividad de la lactato deshidrogenasa en las células individuales es probable que proporcionar penetracione...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical instruments			For collecting skin from euthanized mice
Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm	Fisher Scientific	NC9511236	For freezing mouse skin
Tissue-Tek O.C.T. compound	Fisher Scientific	NC9638938	For mounting cryomolds
Ice bucket	Fisher Scientific	07-210-106
Dry Ice
Polysine Adhesion Slide	Fisher Scientific	12-545-78
4% formalin	Fisher Scientific	23-245-684	Dilluted in water
phosphate buffered saline, pH 7.4
vortex
Tris base	Fisher Scientific	23-245-684
NAD	Sigma-Aldrich	N7004
Phenazine methosulfate	Sigma-Aldrich	P9625
Nitrotetrazolium blue chloride	Sigma-Aldrich	N6876
Lithium L-lactate	Sigma-Aldrich	L2250	Substrate
37°C incubator (or tissue culture incubator)
Braziliant! Counter stain	Anatech	861	Counter stain
Mounting medium	Vector Laboratories	H-5000
Cover slips for slides	Fisher Scientific	12-544D
Light microscope