매핑 대사: 조직에서 직접 젖 산 효소 활동 모니터링

요약

우리 nicotinatmide 아데닌 디뉴클레오티드 인산 (NAD(P)H) + H + 조직 샘플에서 직접 생성 하는 효소 효소 활동의 공간적 분포를 매핑하기 위한 프로토콜 설명.

초록

공간과 시간에 효소 활동을 매핑 하는 것이 정상 조직과 질병에서 셀 동작의 분자 기초를 이해 하기 위한 중요 합니다. 신진 대사 활동 분석 실험 현장에 는 조직 내에서 신진 대사 활동의 공간적 분포에 대 한 정보를 제공할 수 있습니다. 여기 조직 샘플에서 직접 효소 젖 산 효소의 활동을 모니터링 하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 젖 산 효소 포도 당 소비 호 기성 또는 혐 기성 해당 분해를 통해 에너지로 변환 하는 것입니다 여부의 중요 한 결정 이다. 젖 고 나드를 포함 하는 솔루션은 냉동된 조직 섹션에 제공 됩니다. 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD) NADH를 검출 될 수 있다 양성자의 감소에 따라 제공 하는 동시에 변환 하는 동안 높은 젖 산 효소 활동에 포함 된 셀 pyruvate에 제공 된 젖 산을 변환 됩니다. nitrotetrazolium 블루 침전으로 시각화 formazan 블루. 우리는 마우스 피부에서 젖 산 효소 활동을 모니터링 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜을 적용, 우리는 젖 산 효소 활동은 높은 무부하 머리 여 포 줄기 세포는 피부 내에 발견. 마우스 미 발달 섬유 아 세포 보다 배양된 미 발달 줄기 세포에서 높은 얼룩 공개 교양된 마우스 배아 줄기 세포를 적용 하는 프로토콜. 갓 절연된 마우스 대동맥의 분석 계시 수직 대동맥 평활 근 세포에 얼룩. 제공 하는 방법론 공간적으로 냉동 또는 신선한 조직에 양성자를 생성 하는 효소의 활동을 매핑하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

있는 효소는 높은 또는 낮은 활동 조직 내의 위치를 이해 하는 것은 이해 개발 및 생리학에 대 한 필수적입니다. 사본 또는 단백질 레벨은 효소 활동에 대 한 대리 모 알선으로 자주 사용 된다. 이러한 연구는 유익 수 있습니다, 그들은 포스트 번역 상 수정, 단백질 복합물, 또는 효소의 subcellular 지 방화의 존재 하는 효소의 활동을 결정 하기 위한 중요 한 수 있는 정보를 제공 하지 않습니다. 효소 활동은 직접 측정 하는 경우 더 이상 높은 또는 낮은 활동은 조직 내에서 혼합물 또는 셀의 공간 분포 내에서 개별 셀에 대 한 정보를 포함 하는 무 균된 단백질 lysates에 자주 모니터링 합니다.

여기는 조직 샘플 내에서 효소 활동의 공간 배급을 매핑하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 방법론은 tetrazolium 염 dehydrogenases, reductases, 및 냉동된 조직¹에서 oxidases의 활동을 지역화를 사용할 수 있습니다 설명 하는 이전 연구를 기반으로 합니다. 이러한 방법으로, 물 불용 성 formazan 형성 때 양성자 tetrazolium 소금^2,3에 전송 됩니다. 포도 당-6-인산 효소는 NADPH와 양성자, 생성 하 고 tetrazolium 활동 감지 되었습니다. 포도 당-6-인산 효소는 유럽 넙치 hepatocytes⁴, 폐⁵ 의 2 형 폐 포 세포와 신장⁵nephrons에서에서 모니터링 되었습니다. Tetrazolium 소금 또한 냉동된 조직⁶transketolase 활동을 모니터링 하는 데 사용 되었습니다. 비슷한 접근 방식은 최근 인접 한 슬라이드⁷에 동일한 조직에 여러 개의 dehydrogenases의 활동을 모니터링 하는 데 사용 되었다.

여기 tetrazolium 염을 사용 하 여 (그림 1) 젖 산 효소 활동의 공간적 분포를 모니터링 하는 방법을 설명 합니다. 젖 산 효소 분해 젖이 나올, 하 고 역 반응에 의해 생성 된 pyruvate를 변환할 수 있습니다. 젖 산 효소 활동은 결과적으로 그것의 분 비로 젖이 나올 대 tricarboxylic 산 주기로 pyruvate의 입구를 결정 하는 중요 한 이다. 젖 산 수치 종종 다양 한 질병 이나 상해는 손상 된 세포와 효소가 릴리스 되었습니다 나타낼 수 있기 때문에 암^8,,910를 포함 하 여 질병을 진단 하는 데 사용 됩니다.

4 젖 산 효소 유전자를 있다: LDHA, LDHB, LDHC, 및 LDHD¹¹. LDHA와 LDHB는 초기 LDHA 유전자¹²의 중복에서 발현 생각 된다. LDH는 tetramer로 활성 이며 LDHA 및 LDHB homotetramers와 함께 heterotetramers를 형성할 수 있다. LDHA LDHB는 젖 산에 대 한 높은 선호도를 보고 pyruvate¹³우선적으로 젖 산을 변환 하는 동안 pyruvate에 대 한 높은 선호도가지고 보고 있다. LDHA 발기인 HIF1α, cMYC 및 FOXM1 녹음 방송 요인¹¹에 대 한 바인딩 사이트를 포함 되어 있습니다. 또한, 같은 많은 다른 glycolytic 효소^14,15, LDH 포스트 번역 상 수정에 의해 수정할 수 있습니다. 섬유 아 세포 성장 인자 수용 체 1 Y10 tetramer 형성을 촉진, 또는 NADH 기질 바인딩¹⁶촉진 Y83 LDHA phosphorylate 수 있습니다. LDHA acetylated¹⁷수도 있습니다. 이러한 이유로, LDH 활동의 완전 한 이해 LDH 단백질 수준, 하지만 효소의 활동 뿐만 아니라 모니터링 해야 합니다.

우리가 여기에 제시 하는 메서드와 다른 접근 젖 산 효소 활동을 모니터링 하는 데 사용 되었습니다. 무 균 단백질 lysate spectrophotometrically 젖 산 효소 활동을 모니터링할 수 있습니다. NADH 생성 젖 산 pyruvate 변환으로 측정 될 수 있다 340 흡 광도에 따라 nm, 동안 pyruvate는 젖 산¹⁸변환으로 NADH의 실종을 모니터링할 수 있습니다. 젖 산 효소 활동은 또한 자기 공명 영상 (MRI)와 모니터링 되었습니다. ¹³ C-pyruvate를 관리할 수 있습니다 하 고 젖이 나올에 pyruvate의 변환의 비율으로 감시 될 수 있다 [1-¹³C] 젖이 나올 / [1-¹³C] pyruvate. 상승의 비율 [1-¹³C] 젖이 나올 / [1-¹³C] pyruvate 암 조직¹⁹에서 관찰 되었습니다. MRI-기반 접근 정상에 젖 산 효소 활동과 질병 조직에 정보를 제공할 수 있습니다, 하는 동안 방법론 특정 셀에 활동 수준을 결정 하는 데 필요한 해상도 있지 않습니다. 여기에 제공 된 방법론은 조직 영역에서 단일 셀에도 젖 산 효소 활동에 정보를 제공할 수 있습니다.

현장에서 활동 분석 실험을 사용 하 여, 우리는 젖 산 효소의 활동은 마우스 피부²⁰의 머리카락 뿌리 줄기 세포에서 높은 발견. 우리 또한 사용 방법이 경작된 한 배아 줄기 세포에서 젖 산 효소의 활동을 모니터링 하 고 활동은 피더 계층 보다는 줄기 세포에서 발견. 마지막으로, 우리는 신선한 마우스 대동맥에서 젖 산 효소의 활동을 모니터링 하 고 부드러운 근육 세포에 얼룩이 관찰. 우리 여기 냉동된 마우스 피부에서 젖 산 효소 활동을 모니터링 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다.

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프로토콜

설명 하는 모든 실험 동물 관리 위원회, 로스 앤젤레스가 주 대학에 의해 승인 되었다.

1. 냉동된 마우스 스킨의 슬라이드 생성

1. 기관 정책에 따라 마우스를 안락사
   참고: 보호에 대 한 제도적 정책을 따릅니다. 동물 관련 된 모든 프로토콜 기관 동물 관리 위원회에 의해 승인을 받아야 한다.
2. 동물 털 트리머 사용 마우스의 머리를 제거 합니다.
3. 가 위를 사용 하 여 피부에 절 개를 확인 합니다. 집게를 사용 하 여 마우스에서 피부를 들어올립니다. 멀리 피부 섹션을 잘라가 위를 사용 하 여.
4. cryomold 복합 시 약 동결을 채우십시오 ( 재료의 표참조).
5. 바늘 코 집게를 사용 하 여 채워진된 cryomolds에 장소 피부 섹션입니다. 동양 피부 있도록 조직 조각 표 피에서 진 피, hypodermis와 근육 (그림 2)에 피부의 횡단면을 생성 합니다.
   참고: 가능 하면 실험 탑재 하 고 동일한 슬라이드에 구분 하 고 함께 처리 수 있도록 동일한 cryomold에서 함께 마우스 제어. 거품을 만드는 것이 아니라는 것을 주의.
6. 드라이 아이스는 얼음 양동이에 블록의 평평한 표면에 cryomold를 배치 하 고 고정 하자. 스킨의 방향을 관찰을 계속 합니다. 필요한 경우 조정 합니다.
   참고: 드라이 아이스를 처리할 때 극저온 장갑 착용.
7. Cryomolds 스토리지-80 ° C 냉동 고로 전송 합니다. 샘플 효소 활동의 상당한 손실 없이 약 3 달 동안 냉장고에서 유지할 수 있습니다. 냉동된 섹션을을 건조 하지 마십시오.
8. -20 ° C, 7-10 µ m 두께 최고의 피부 형태학²¹에 대 한 섹션을 만들을 슬라이스 조직 한 cryostat 사용 하.

2. 얼룩에 대 한 슬라이드 준비

1. 시험 될 슬라이드 집합을 설정 합니다. 나드 보류 될 것입니다 어떤 컨트롤 슬라이드를 포함 하 고 다른 컨트롤에 슬라이드 기판, 젖이 나올, 보류 될 것 이다. 냉동된 조직 블록 이전 조사에서 긍정적인 제어 슬라이드를 포함 합니다.
2. 짧게 수정 피부 4% 포 르 말린 5 분에 대 한 섹션을 포함 하는 슬라이드 슬라이드, 또는 4% 포 르 말린의 pipetting 1 mL로 슬라이드 4% 포 르 말린을 포함 하는 컨테이너를 찍기 하 여 여러 슬라이드를 처리할 때.
   참고: 고정 피부 않습니다 하지 껍질을 슬라이드에서 다음 절차와 보존 피부 형태학 동안 지킬 것 이다.
   주의: 포 르 말린은 발암 물질과 유해; 장갑을 착용, 그것은 당신의 피부 및 화학 증기 두건에서이 단계를 수행 하지 마십시오.
3. 적어도 1 mL의 인산 염으로 세척 슬라이드 버퍼링 염 분, pH 7.4, 슬라이드 당 pipetting 또는 수영.

3. 준비 솔루션 얼룩

1. 젖 산 효소 활동 얼룩에 대 한 소용돌이 함께 시 약 (50 mM Tris pH 7.4, 750 µ M NADP, 80 µ M phenazine methosulfate (PMS), 600 µ M 블루 nitrotetrazolium 염화 물, 그리고 30mm 젖) 얼룩의 크기에 따라 적절 한 크기의 튜브에 필요한 솔루션입니다.
   참고: 1 mL는 완전히 하나의 슬라이드를 커버 하기에 충분.
2. 있는 모든 시 약은 나드 제외 하 고 존재 하는 두 번째 솔루션을 준비 합니다. 모든 시 약은 젖 산을 제외 하 고 존재 하는 세 번째 솔루션을 준비 합니다.

4. 슬라이드 솔루션 얼룩에 알을 품으십시오

1. 부드럽게 피펫으로 얼룩 솔루션 또는 전체에서 섹션을 다루는 준비 슬라이드에 제어 솔루션 (1 mL입니다 한 슬라이드에 대 한 충분 한). 여러 슬라이드를 함께 처리 되는 경우 동시에 얼룩 솔루션으로 모든 슬라이드를 찍어 (컨테이너는 완전히 조직 단면도 커버에 충분 한 해결책 확인).
2. 어둠 속에서 37 ° C에서 습도 환경에서 슬라이드를 품 어. 슬라이드 위에 솔루션 얼룩 경우 증발을 방지 하기 위해 습도 환경에서 슬라이드를 놓습니다.

5입니다. 모니터 슬라이드

1. 모니터링 검사에 의해 파랑 클리어에서 얼룩 솔루션의 변환 합니다. 샘플 blueness의 원하는 수준에 도달, 얼룩 솔루션을 제거 하 여 반응을 중지 합니다.
   참고: 피부를 위한 10 분은 충분 합니다. 에 오르간과 효소 활동에 따라 달라 집니다.
2. Pipetting으로 인산 염 버퍼 식 염 수와 슬라이드를 린스 (1 mL는 각 슬라이드에 대 한 충분 한) 또는 찍기.
   참고: 서로 게 비교 될 것입니다 모든 샘플 유지 되어야 합니다 얼룩 솔루션에서 동일한 양의 시간에 대 한.

6. counterstain 및 마운트

1. 피펫으로 슬라이드 슬라이드 blueness의 적절 한 수준에 도달 하는 때에 counterstain.
   참고: 빨간색 또는 녹색 핵을 설정 하는 Counterstains precipitant는 formazan에 의해 만들어진 블루와 좋은 대조를 제공 합니다.
2. 수성 또는 비-수성 매체²²장착 탑재. 설치 매체의 1 ~ 3 방울 (40-50 µ L)은 커버 슬립의 크기에 따라 충분 합니다.

7. 이미지 슬라이드 및 계량

1. 가벼운 현미경 슬라이드 이미지. 실험의 사진 및 제어 샘플 및 10 배, 20 X 40 X 확대에 부정적인 모든 컨트롤을 가져가 라.
2. 이미지 분석 소프트웨어는 서로 다른 영역에서 푸른 얼룩의 강도 결정 합니다.

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결과

우리는 이전 제자리에 활동 분석 실험 마우스 피부²⁰에 대 한 결과 보고 있다. 그림 3에서 같이, 우리는 절차는 위에서 설명한 때 머리 여 포의 기지에서 머리카락 뿌리 줄기 세포에서 젖 산 효소 활동의 높은 수준을 다음 관찰. 이러한 결과 형광 활성화 된 세포 피부의 머리 여 포 줄기 세포에 대 한 정렬 및 정렬된 셀에 활동 ?...

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토론

여기 설명 하는 방법은 젖 산 효소 또는 다른 세포 유형 조직 내에서 또는 시간이 지남에 따라 조직의 다른 부분에서에서 NADH 또는 NADPH를 생성 하는 다른 대사 효소의 활동을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 젖 산 효소, 종양 줄기 세포의 생물학을 이해 하기 위한 중요 한 효소 이며 개별 셀에서 젖 산 효소 활동을 모니터 하는 능력이이 효소의 기능에 중요 한 통찰력을 제공할 것입니다.

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical instruments			For collecting skin from euthanized mice
Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm	Fisher Scientific	NC9511236	For freezing mouse skin
Tissue-Tek O.C.T. compound	Fisher Scientific	NC9638938	For mounting cryomolds
Ice bucket	Fisher Scientific	07-210-106
Dry Ice
Polysine Adhesion Slide	Fisher Scientific	12-545-78
4% formalin	Fisher Scientific	23-245-684	Dilluted in water
phosphate buffered saline, pH 7.4
vortex
Tris base	Fisher Scientific	23-245-684
NAD	Sigma-Aldrich	N7004
Phenazine methosulfate	Sigma-Aldrich	P9625
Nitrotetrazolium blue chloride	Sigma-Aldrich	N6876
Lithium L-lactate	Sigma-Aldrich	L2250	Substrate
37°C incubator (or tissue culture incubator)
Braziliant! Counter stain	Anatech	861	Counter stain
Mounting medium	Vector Laboratories	H-5000
Cover slips for slides	Fisher Scientific	12-544D
Light microscope