JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем протокол для карт пространственного распределения ферментативной активности ферментов, которые генерируют nicotinatmide аденин динуклеотид фосфат (NAD(P)H) + H + непосредственно в образцах тканей.

Аннотация

Картирование ферментативную активность в пространстве и времени имеет решающее значение для понимания молекулярные основы поведения клеток в нормальной ткани и болезней. В situ метаболической активности анализов может предоставить информацию о пространственного распределения метаболической активности в ткани. Здесь мы предоставляем подробный протокол для наблюдения за активностью фермента лактатдегидрогеназы непосредственно в образцах тканей. Лактатдегидрогеназа является важным фактором, определяющим ли потребления глюкозы будут преобразованы в энергии через аэробного и анаэробного гликолиза. Раствор, содержащий лактат и NAD предоставляется замороженные ткани секции. Клетки с высоким лактатдегидрогеназа активности будет конвертировать предоставленного лактат пируват, хотя одновременно преобразования при условии, что Никотинамидадениндинуклеотид (NAD) NADH и протона, которые могут быть обнаружены на основе сокращения nitrotetrazolium синий Формазаны, который визуализируется как синий осадок. Мы описываем подробный протокол для мониторинга активности лактатдегидрогеназы в мыши кожи. Применяя этот протокол, мы обнаружили, что активность лактатдегидрогеназы высок в неработающем волосяного фолликула стволовых клеток в коже. Применение протокола к искусственный мышиных эмбриональных стволовых клеток показали выше окрашивание в культивированный эмбриональных стволовых клеток, чем мыши эмбриональных фибробластов. Анализ свежевыделенных мыши аорты показал, пятнать в клетках гладких мышц перпендикулярно аорты. Представлена методология может использоваться для пространственно карта активность ферментов, которые генерируют протона в замороженные или свежие ткани.

Введение

Понимание места внутри тканей, в которых ферменты обладают высокой или низкой активности имеет важное значение для понимания развития и физиологии. Транскрипт или белка уровнях часто используются в качестве суррогатов для ферментативной активности. Хотя такие исследования могут быть информативным, они не предоставляют информацию, которая может иметь решающее значение для определения активности ферментов, как столб-поступательные изменения, наличие белковых комплексов, или локализации внутриклеточных ферментов. Когда измеряется прямо энзимную активность, он часто контролируется в лизатов гомогенизированные белка, что больше не содержат информацию об отдельных ячеек в смеси или пространственное распределение ячеек с высокой или низкой активности в ткани.

Здесь мы предоставляем подробный протокол для картирования пространственного распределения ферментативной активности в образец ткани. Методология основана на более ранних исследований, демонстрируя, что tetrazolium соли может использоваться для локализации деятельности дегидрогеназ, reductases и оксидазы замороженные ткани1. С помощью этих методов нерастворимого в воде Формазаны образуется, когда протонов передаются в tetrazolium соли2,3. Глюкоза-6-фосфат дегидрогеназа генерирует NADPH и протона и был обнаружен с tetrazolium активностью. Глюкоза-6-фосфат дегидрогеназа осуществлялся в европейской камбалы гепатоцитов4, в альвеолярной типа 2 клетки легких5 и нефронов почек5. Tetrazolium соли также используются для мониторинга активности транскетолазы в замороженные ткани6. Аналогичный подход был недавно использован для наблюдения за активностью нескольких дегидрогеназ же ткани на прилегающих слайды7.

Здесь мы описываем метод использовать tetrazolium соли для мониторинга пространственного распределения активности лактатдегидрогеназы (рис. 1). Лактатдегидрогеназа можно преобразовать пируват, порожденных гликолиза в лактат и обратная реакция. Лактатдегидрогеназа деятельность следовательно является важным фактором, определяющим пирувата в вход в цикл трикарбоновых кислот против его секреции как лактат. Уровень лактата в крови часто используются для диагностики ряда заболеваний, включая рак8,9,10, потому что это может означать, что болезни или травмы поврежденные клетки и фермента был освобожден.

Есть четыре лактатдегидрогеназа генов: LDHA, LDHB, LDHC и LDHD11. Подуманы, что возникли от дублирования раннего гена LDHA12LDHA и LDHB. LDH активен как Тетрамер и LDHA и LDHB могут образовывать homotetramers и heterotetramers друг с другом. LDHA, как сообщается, имеют более высокие сродство для пируват, в то время как LDHB сообщается выше сродство для молочной кислоты и преобразуемый преференциально лактат пируват13. Промоутер LDHA содержит привязки сайтов для факторов11транскрипции HIF1α, cMYC и FOXM1. Кроме того как многие другие гликолитических ферментов14,15, ЛДГ может быть изменен на столб-поступательные изменения. Фактор роста фибробластов рецептор 1 можно фосфорилировать LDHA на Y10, который способствует формированию Тетрамер, или Y83, который способствует NADH субстрата привязки16. LDHA также может быть ацетилированный17. По этим причинам полное понимание активности ЛДГ требует мониторинга не только уровня ЛДГ белка, но также активность фермента.

В дополнение к метод, который мы представляем здесь другие подходы используются для мониторинга активности лактатдегидрогеназы. Лактатдегидрогеназа активность может контролироваться спектрофотометрически гомогенизированные белка lysate. Поколение NADH как лактат преобразуется пируват может быть измерена по оптической плотности на 340 Нм, в то время как исчезновение НАДН может контролироваться как пируват превращается в лактат18. Лактатдегидрогеназа деятельности также ведется с магнитно-резонансная томография (МРТ). 13 C-пируват может управляться и преобразование пируват лактата может контролироваться как отношение [1 -13C] лактата / [1 -13C] пируват. Повышенные показатели [1 -13C] лактата / [1 -13C] пируват наблюдаются в раковых тканей19. Хотя подходы, основанные на МРТ может предоставить информацию о активности лактатдегидрогеназы в нормальных и болезней тканей, методологии не имеют резолюции, необходимые для определения уровня активности в определенных ячейках. Методологии, здесь может предоставить информацию о лактатдегидрогеназа деятельности в областях, ткани и даже в одиночных клетках.

Использование в situ анализов деятельности, мы обнаружили, что активность лактатдегидрогеназы высока в волосяной фолликул стволовых клеток мыши кожи20. Мы также использовали этот метод для отслеживания активности лактатдегидрогеназы в культивированный эмбриональных стволовых клеток и обнаружил, что активность в стволовых клеток выше, чем уровень подачи. Наконец мы мониторинг активности лактатдегидрогеназы в свежих мыши аорты и наблюдается окрашивание в клетках гладких мышц. Здесь мы описываем подробный протокол для мониторинга активности лактатдегидрогеназы в замороженных мыши кожи.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты описал были утверждены Комитетом животное уход в Калифорнийском университете, Лос-Анджелес.

1. создать слайды замороженных мыши кожи

  1. Усыпить мышей в соответствии с политикой Организации.
    Примечание: Следуйте институциональной политики для защитной одежды. Все протоколы с участием животных должны быть одобрены организационного комитета уход животных.
  2. Удаление волос мыши Триммер волос животных.
  3. Сделайте разрезы в коже с помощью ножниц. С помощью щипцов, снять кожу от мыши. С помощью ножниц, срезаем кожу секции.
  4. Заполнить cryomold с замораживанием реагент соединения (см. Таблицу материалы).
  5. Место разделы кожи в заполненных cryomolds с помощью иглы носом щипцами. Ориент кожи, таким образом, чтобы кусочки ткани будет генерировать сечения кожи от эпидермиса дермы и гиподермы мышцы (рис. 2).
    Примечание: если возможно, подключить экспериментальные и контроль мышей вместе в том же cryomold, поэтому они могут быть секционного на тот же слайд и обрабатываются вместе. Будьте осторожны, чтобы не создавать пузыри.
  6. Место cryomold на плоской поверхности блока сухого льда в ведёрке со льдом и пусть заморозить. Продолжать соблюдать ориентации кожи. При необходимости отрегулируйте.
    Примечание: Перчатках криогенной обработки сухим льдом.
  7. Передача cryomolds в морозильной камере-80 ° C для хранения. Образцы можно сохранить в холодильнике около 3 месяцев без значительной потери ферментативной активности. Не позволяйте Замороженные разделы высохнуть.
  8. С помощью криостата при-20 ° C, кусочек ткани для создания секций толщиной для лучших кожи морфология217-10 мкм.

2. Подготовка слайды для окрашивания

  1. Создать набор слайдов для проверки. Включить контроль слайд, на котором будут удержаны NAD и другого элемента управления слайд на котором субстрата, лактат, будет отказано. Включать положительный контроль слайд из блока замороженные ткани ранее расследование.
  2. Кратко исправьте слайды, содержащий разделы кожи с формалином 4% за 5 мин либо дозирования 1 мл 4% формалина на слайд, или при обработке нескольких слайдов, окунания слайды в контейнер, содержащие формалин 4%.
    Примечание: Фиксация обеспечит, что кожа не отслаиваются от слайды во время следующих процедур и заповедник морфологию кожи.
    Предупреждение: Формалин является канцерогеном и опасных; Надевайте перчатки, не позволяйте ему прикоснуться к вашей коже и выполнить этот шаг в химической зонта.
  3. Мыть слайды с по крайней мере 1 мл фосфат буфер солевой раствор, рН 7,4, каждого слайда закупорить или погружением.

3. Подготовка окрашивание раствора

  1. Вихревой вместе реагенты для окрашивания активности лактатдегидрогеназы (50 мм трис рН 7,4, 750 мкм NADP, 80 мкм мембранотропного порфириновых (PMS), 600 мкм nitrotetrazolium синий хлорида и лактат 30 мм) в соответствующего размера трубки в зависимости от количества пятнать требуется решение.
    Примечание: 1 мл достаточно, чтобы полностью покрыть один слайд.
  2. Подготовьте второе решение, в котором присутствуют все реагенты за исключением NAD. Подготовьте третье решение, в котором присутствуют все реагенты за исключением лактата.

4. Инкубируйте слайды в окрашивание раствора

  1. Аккуратно накапайте окрашивание решения или решения управления на подготовленные слайды, охватывающих секции в полном объеме (1 мл достаточно для одного слайда). Если несколько слайдов обрабатываются вместе, окунуть все слайды в окрашивание раствора в то же время (убедитесь, что контейнер имеет достаточно решение полностью покрыть в разделе ткани).
  2. Инкубируйте слайды в увлажненной среде при 37 ° C в темноте. Если окрашивание раствора поверх слайда, место слайда в увлажненной среде для предотвращения испарения.

5. монитор слайды

  1. Мониторинг преобразования окрашивание раствора от прозрачного голубого путем визуального осмотра. Когда образцы достигли желаемого уровня голубизны, остановите реакции, удалив окрашивание раствора.
    Примечание: Для кожи, 10 минут вполне достаточно. Время будет зависеть от органа и ферментативную активность.
  2. Промойте слайды с фосфатный буфер, дозирование (1 мл достаточно для каждого слайда) или погружением.
    Примечание: Любые образцы, которые будут сравниваться друг с другом должны поддерживаться в окрашивание раствора для одинаковое количество времени.

6. изображение и смонтировать

  1. Накапайте изображение на слайды когда слайды достигли соответствующего уровня голубизны.
    Примечание: Counterstains, которые превращают ядер красных или зеленых обеспечит хороший контраст с синим, созданные Формазаны осадителя.
  2. Крепление с водных и неводных монтажа средних22. Один-три капли (40-50 мкл) монтажа среды достаточно в зависимости от размера крышки выскальзования.

7. изображения слайдов и количественно

  1. Слайды изображений под микроскопом света. Возьмите фотографии экспериментальных и контрольных образцов и все отрицательные элементы управления в 10 X 20 X и 40 кратном.
  2. Определите интенсивность синего пятна в различных регионах с программного обеспечения для анализа изображений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мы уже ранее сообщали результаты в situ анализов деятельности в мыши кожи20. Как показано на рисунке 3, мы наблюдали, что высокий уровень активности лактатдегидрогеназы в волосяной фолликул стволовых клеток на базе волосяного фолликула, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Метод, описанный здесь может использоваться для мониторинга активности лактатдегидрогеназы и другие метаболические ферменты, которые генерируют NADH или NADPH, в различных типов клеток внутри ткани или внутри различных частей ткани с течением времени. Лактатдегидрогеназа является ферме?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы имеют не конкурирующие интересы раскрыть.

Благодарности

HAC был Милтон E. Cassel ученый Аллен фонда Рита (http://www.ritaallenfoundation.org). Эта работа финансировалась грантов для HAC от национальных общих медицинских наук R01 GM081686, R01 AR070245, Национальный институт общих медицинских наук R01 GM0866465 Эли Edythe Широкое центр восстановительной медицины &, исследования стволовых клеток ( Роуз холмы и Hal ГАМК награды), центр здоровья/UCLA CTSI низ Грант UL1TR000124, лейкемии лимфомы общества, влияния женщин Iris Кантор награды от Йонссон всеобъемлющем онкологический центр WEL и ВАК. Исследования в этой публикации было поддержано национального института рака национальных институтов здоровья под награду номер P50CA092131. Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи. ВАК является членом Эли Edythe Широкое центр восстановительной медицины и исследования стволовых клеток, Институт молекулярной биологии Калифорнийского университета, и UCLA биоинформатики межведомственной программы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Surgical instrumentsFor collecting skin from euthanized mice
Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mmFisher ScientificNC9511236For freezing mouse skin
Tissue-Tek O.C.T. compoundFisher ScientificNC9638938For mounting cryomolds
Ice bucketFisher Scientific07-210-106
Dry Ice
Polysine Adhesion SlideFisher Scientific12-545-78
4% formalinFisher Scientific23-245-684Dilluted in water
phosphate buffered saline, pH 7.4
vortex
Tris baseFisher Scientific23-245-684
NADSigma-AldrichN7004
Phenazine methosulfateSigma-AldrichP9625
Nitrotetrazolium blue chlorideSigma-AldrichN6876
Lithium L-lactateSigma-AldrichL2250Substrate
37°C incubator (or tissue culture incubator)
Braziliant! Counter stainAnatech861Counter stain
Mounting mediumVector LaboratoriesH-5000 
Cover slips for slidesFisher Scientific12-544D
Light microscope

Ссылки

  1. Boonacker, E., Van Noorden, C. J. Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis. J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).
  2. Seidler, E. The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry. Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).
  3. Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual of Current Methods. , Bios. (1992).
  4. Winzer, K., Van Noorden, C. J., Kohler, A. Quantitative cytochemical analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in living isolated hepatocytes of European flounder for rapid analysis of xenobiotic effects. J Histochem Cytochem. 49, 1025-1032 (2001).
  5. Negi, D. S., Stephens, R. J. An improved method for the histochemical localization of glucose-6-phoshate dehydrogenase in animal and plant tissues. J Histochem Cytochem. 25, 149-154 (1977).
  6. Boren, J., et al. In situ localization of transketolase activity in epithelial cells of different rat tissues and subcellularly in liver parenchymal cells. J Histochem Cytochem. 54, 191-199 (2006).
  7. Miller, A., et al. Exploring metabolic configurations of single cells within complex tissue microenvironments. Cell Metab. , (2017).
  8. Shen, J., et al. Prognostic value of serum lactate dehydrogenase in renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis. PLoS One. 11, e0166482(2016).
  9. Zhang, X., et al. Prognostic significance of serum LDH in small cell lung cancer: A systematic review with meta-analysis. Cancer Biomark. 16, 415-423 (2016).
  10. Petrelli, F., et al. Prognostic role of lactate dehydrogenase in solid tumors: a systematic review and meta-analysis of 76 studies. Acta Oncol. 54, 961-970 (2015).
  11. Valvona, C. J., Fillmore, H. L., Nunn, P. B., Pilkington, G. J. The regulation and function of lactate dehydrogenase A: Therapeutic potential in brain tumor. Brain Pathol. 26, 3-17 (2016).
  12. Markert, C. L., Shaklee, J. B., Whitt, G. S. Evolution of a gene: Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure, function and regulation. Science. 189, 102-114 (1975).
  13. Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L. Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase. Proteins. 43, 175-185 (2001).
  14. Holness, M. J., Sugden, M. C. Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation. Biochem Soc Trans. 31, 1143-1151 (2003).
  15. Yi, W., et al. Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism. Science. 337, 975-980 (2012).
  16. Fan, J., et al. Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells. Mol Cell Biol. 31, 4938-4950 (2011).
  17. Zhao, D., et al. Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer. Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).
  18. Vanderlinde, R. E. Measurement of total lactate dehydrogenase activity. Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).
  19. Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate. Sci Transl Med. 5, 198ra108(2013).
  20. Flores, A., et al. Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation. Nat Cell Biol. , (2017).
  21. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb prot4991 (2008).
  22. Espada, J., et al. Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy. Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).
  23. Hisada, R., Yagi, T. 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors. J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

136

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены