Mapping-Stoffwechsel: Laktat-Dehydrogenase Überwachungstätigkeit direkt im Gewebe

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll für die Zuordnung der räumlichen Verteilung der enzymatische Aktivität von Enzymen, die generieren Nicotinatmide Adenin Dinucleotide Phosphat (NAD(P)H) + H + direkt in Gewebeproben.

Zusammenfassung

Mapping enzymatische Aktivität in Raum und Zeit ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der molekularen Grundlagen der Zelle Verhalten im normalgewebe und Krankheit. In Situ Stoffwechselaktivität Tests liefern Informationen über die räumliche Verteilung der metabolischen Aktivität innerhalb eines Gewebes. Wir bieten hier ein detailliertes Protokoll zur Überwachung der Aktivität des Enzyms Lactat Dehydrogenase direkt in Gewebeproben. Laktat-Dehydrogenase ist eine wichtige Determinante für ob konsumierten Glukose in Energie durch aerobe oder anaerobe Glykolyse umgewandelt wird. Eine Lösung mit Laktat und NAD ist ein gefrorenes Gewebe Abschnitt zur Verfügung gestellt. Zellen mit hoher Laktat-Dehydrogenase-Aktivität konvertiert die bereitgestellten Laktat in Pyruvat, während gleichzeitig konvertieren, vorausgesetzt, Nicotinamid-adenin-Dinucleotide (NAD), NADH und ein Proton, die erkannt werden können auf die Reduzierung der Basis Nitrotetrazolium blau, Formazan, die als ein blauer Niederschlag visualisiert wird. Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll zur Überwachung der Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in der Maus Haut. Die Anwendung dieses Protokolls, fanden wir, dass Laktat-Dehydrogenase-Aktivität hoch in den ruhenden Haarfollikel Stammzellen in der Haut ist. Umsetzung des Protokolls zu embryonalen Stammzellen gezüchteten Maus zeigte höhere Färbung in kultivierten Stammzellen als Maus embryonalen Fibroblasten. Analyse der frisch isolierte Maus Aorta ergab Färbung in glatten Muskelzellen senkrecht zu der Aorta. Die Methodik zur Verfügung gestellt lässt sich räumlich zugeordnet werden die Aktivität von Enzymen, die ein Proton im gefrorenen oder frischen Gewebe erzeugen.

Einleitung

Die Standorte in den Geweben, in denen Enzyme hohe oder Niedrige Aktivität haben, zu verstehen ist wichtig für Verständnis Entwicklung und Physiologie. Abschrift oder Protein Ebenen dienen oft als Surrogate für enzymatische Aktivität. Während solche Studien informativ sein können, bieten sie keine Informationen, die entscheidend für die Bestimmung einer Enzym-Aktivität, wie Post-translationalen Modifikationen, die Anwesenheit von Protein-komplexe oder das Enzym subzelluläre Lokalisation sein können. Wenn die enzymatische Aktivität direkt gemessen wird, wird es oft in homogenisierte Protein Lysates überwacht, die nicht mehr Informationen über einzelne Zellen innerhalb der Mischung oder die räumliche Verteilung der Zellen mit hoher oder niedriger Aktivität innerhalb eines Gewebes enthalten.

Wir bieten hier ein detailliertes Protokoll für die Zuordnung der räumlichen Verteilung der enzymatischen Aktivität innerhalb einer Gewebeprobe. Die Methodik basiert auf früheren Studien, die zeigen, dass tetrazoliumsalz Salze verwendet werden können, um die Aktivität der Dehydrogenases, Reduktasen und oxidasen in tiefgefrorenem Gewebe¹zu lokalisieren. Mit diesen Methoden wird ein wasserunlösliches Formazan gebildet, wenn eine Tetrazolium Salz^2,3Protonen übertragen werden. Glukose-6-phosphat Dehydrogenase NADPH und ein Proton generiert und mit tetrazoliumsalz Aktivität erkannt wurde. Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase ist in Flunder Hepatozyten⁴, im alveolären Typ-2-Zellen der Lunge⁵ und Nephrone der Niere⁵überwacht worden. Tetrazoliumsalz Salze wurden auch zur Transketolase-Aktivität in tiefgefrorenem Gewebe⁶zu überwachen. Ein ähnlicher Ansatz wurde kürzlich verwendet, um die Aktivität von mehreren Dehydrogenases im gleichen Gewebe auf angrenzenden Folien⁷überwachen.

Wir beschreiben hier eine Methode um tetrazoliumsalz Salze verwenden, um die räumliche Verteilung der Laktat-Dehydrogenase-Aktivität (Abbildung 1) zu überwachen. Laktat-Dehydrogenase wandelt Pyruvat durch Glykolyse, Laktat und die umgekehrte Reaktion erzeugt. Laktat-Dehydrogenase-Aktivität ist daher eine wichtige Determinante der Pyruvat Eingang in der Tricarboxylic Säure Zyklus gegen seine Sekretion wie Laktat. Laktat-Spiegel im Blut werden oft zur diagnose einer Reihe von Krankheiten, einschließlich Krebs^8,9,10, denn es signalisieren kann, dass Krankheit oder Verletzung Zellen beschädigte hat und das Enzym freigegeben wurde.

Es gibt vier Laktat-Dehydrogenase Gene: LDHA, LDHB, LDHC und LDHD¹¹. LDHA und LDHB werden gedacht, um aus der Duplizierung von einer frühen LDHA Gen¹²entstanden sind. LDH ist als ein Tetramer aktiv und LDHA und LDHB bilden Homotetramers und Heterotetramers mit einander. LDHA wird berichtet, haben höheren Affinität für Pyruvat, während LDHB haben höheren Affinität für Laktat und bevorzugt Laktat in Pyruvat¹³konvertieren berichtet wird. Der Projektträger LDHA enthält verbindliche Aufstellungsorte für die HIF1α, cMYC FOXM1 Transkription Faktoren¹¹. Darüber hinaus kann wie viele andere glykolytischen Enzyme^14,15, LDH durch Post-translationalen Modifikationen verändert werden. Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 1 phosphorylieren kann LDHA Y10, das Tetramer Bildung fördert, oder Y83, die NADH Substrat Bindung¹⁶fördert. LDHA kann auch schimmelpilzschäden¹⁷. Aus diesen Gründen erfordert ein umfassendes Verständnis der LDH-Aktivität nicht nur LDH-Protein-Ebene, sondern auch die Enzym-Aktivität sowie Überwachung.

Neben der Methode, die wir hier präsentieren, wurden andere Ansätze zur Laktat-Dehydrogenase-Aktivität zu überwachen. Laktat-Dehydrogenase-Aktivität kann spektralphotometrisch lysate homogenisierte Protein überwacht werden. Die Erzeugung von NADH wie Laktat in Pyruvat umgewandelt gemessen werden basierend auf Absorption bei 340 nm, während das Verschwinden von NADH überwacht werden kann, wie Pyruvat in Laktat¹⁸umgewandelt. Laktat-Dehydrogenase-Aktivität ist auch mit Magnetresonanz-Bildgebung (MRI) überwacht worden. ¹³ C-Pyruvat kann verabreicht werden, und die Umwandlung von Pyruvat zu Laktat kann überwacht werden, als das Verhältnis von [1 -¹³C] Laktat / [1 -¹³C] Pyruvat. Erhöhte Verhältnisse von [1 -¹³C] Laktat / [1 -¹³C] Pyruvat in Krebs Gewebe¹⁹eingehalten worden. Während MRT-basierte Ansätze über Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in Normal und Krankheit Gewebe informieren können, haben die Methoden nicht die Auflösung benötigt, um die Aktivität in bestimmten Zellen zu bestimmen. Die Methodik, die hier zur Verfügung gestellten kann Informationen über Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in den Bereichen Gewebe und sogar in einzelnen Zellen.

Verwendung von in Situ Aktivität Assays, fanden wir, dass die Laktat-Dehydrogenase-Aktivität hoch in den Haarfollikel Stammzellen der Maus Haut²⁰ist. Wir nutzten auch die Methode zu überwachen die Aktivitäten der Laktat-Dehydrogenase in kultivierten Stammzellen und fand, dass die Aktivität in den Stammzellen über die Feeder-Schicht liegt. Schließlich überwacht die Tätigkeit der Laktat-Dehydrogenase in frischen Maus Aorta und Färbung in glatten Muskelzellen beobachtet. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Überwachung der Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in gefrorenen Maus Haut.

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Protokoll

Alle beschriebenen Experimente stimmten die Animal Care Committee an der University of California, Los Angeles.

1. erzeugen Sie Dias von gefrorenen Maus Haut

1. Mäuse im Einklang mit Institution Politik einschläfern.
   Hinweis: Führen Sie institutionelle Politik für Schutzkleidung. Alle Protokolle, bei denen Tiere müssen durch die institutionelle Animal Care Committee genehmigt werden.
2. Entfernen Sie die Maus Haare mit einem Tier Haarschneider.
3. Stellen Sie Einschnitte in der Haut mit einer Schere. Mit Pinzette, heben Sie die Haut von der Maus. Mit Schere, Abschnitt Haut wegschneiden.
4. Füllen Sie die Cryomold mit dem Reagenz zusammengesetzte Einfrieren (siehe Tabelle der Materialien).
5. Ort Hautpartien in gefüllten Cryomolds mit Nadelzange Pinzette. Haut zu orientieren, so dass Gewebe Scheiben werden einen Querschnitt durch die Haut aus der Epidermis, Lederhaut, Unterhaut und Muskulatur (Abbildung 2) zu generieren.
   Hinweis: Wenn möglich, montieren Sie experimentell zu und Steuern Sie Mäuse zusammen in der gleichen Cryomold, so dass sie auf derselben Folie geschnitten und zusammen verarbeitet werden können. Achten Sie darauf, keine um Luftblasen zu erstellen.
6. Legen Sie Cryomold auf die flache Oberfläche aus einem Block von Trockeneis in einem Eiskübel und Einfrieren zu lassen. Weiterhin die Ausrichtung der Haut zu beobachten. Passen Sie bei Bedarf.
   Hinweis: Kryogene Handschuhe beim Umgang mit Trockeneis.
7. Cryomolds in einem-80 ° C Gefrierschrank für die Lagerung zu übertragen. Proben können in den Gefrierschrank für ca. 3 Monate ohne erheblichen Verlust der Enzymaktivität gepflegt werden. Lassen Sie sich nicht Gefrierschnitte austrocknen.
8. Verwenden einen Kryostaten bei-20 ° C, Stück Gewebe Abschnitte 7 bis 10 µm Dicke für die beste Haut Morphologie²¹erstellen.

2. Vorbereitung Folien zum Beizen

1. Den Satz von Folien zu prüfenden zu etablieren. Gehören ein Steuerschieber auf dem NAD einbehalten und schieben Sie ein anderes Steuerelement auf dem Substrat, Laktat, einbehalten. Gehören Sie einer Positivkontrolle Folie aus einem gefrorenen Gewebe vorher untersucht.
2. Kurz fix Folien mit Hautpartien mit 4 % Formalin für 5 min entweder durch pipettieren 1 mL 4 % Formalin auf der Folie oder, wenn mehrere Folien Verarbeitung durch Eintauchen in ein Behälter, 4 % Formalin schiebt.
   Hinweis: Die Fixierung wird sichergestellt, dass die Haut nicht von den Folien während der folgenden Verfahren und bewahren die Haut Morphologie abziehen.
   Achtung: Formalin ist ein Karzinogen und gefährlich; tragen Sie Handschuhe, lassen Sie es Ihre Haut berühren und führen Sie diesen Schritt in einem chemischen Abzug nicht.
3. Waschen Folien mit mindestens 1 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4, pro Folie entweder durch pipettieren oder eintauchen.

3. Vorbereitung der Färbelösung

1. Wirbel zusammen Reagenzien für Laktat-Dehydrogenase Aktivität Färbung (50 mM Tris pH 7.4, 750 µM NADP, 80 µM phenazinderivat Methosulfate (PMS), 600 µM Nitrotetrazolium blaue Chlorid und 30 mM Laktat) in einem entsprechend großen Rohr abhängig von der Menge der Färbung Lösung benötigt.
   Hinweis: 1 mL ist ausreichend um eine Folie vollständig zu bedecken.
2. Bereiten Sie eine zweite Lösung, in der alle Reagenzien außer NAD vorhanden sind. Bereiten Sie eine dritte Lösung, in der alle Reagenzien außer Laktat vorhanden sind.

(4) inkubieren Sie Folien in Färbelösung

1. Sanft die Färbelösung pipettieren oder Control-Lösungen auf die vorbereiteten Folien, die im Abschnitt in seiner Gesamtheit (1 mL ist ausreichend für eine Folie). Wenn mehrere Folien zusammen verarbeitet werden, Tauchen alle Folien in der Färbelösung gleichzeitig (stellen Sie sicher, der Container hat genug Lösung Abschnitt Gewebe vollständig bedecken).
2. Inkubieren Sie die Folien in eine feuchte Umgebung bei 37 ° C im Dunkeln. Wenn Färbelösung oben auf der Folie ist, legen Sie die Folie in eine feuchte Umgebung, um Verdunstung zu verhindern.

5. Monitor Folien

1. Die Umwandlung von der Färbelösung von klar bis blau durch Sichtkontrolle zu überwachen. Wenn die Proben das gewünschte Maß an Bläue erreicht haben, stoppen Sie die Reaktion durch das Entfernen der Färbelösung.
   Hinweis: Für die Haut ist 10 Minuten ausreichend. Die Zeit hängt von der Orgel und die enzymatische Aktivität.
2. Spülen Sie Folien mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung durch pipettieren (1 mL ist ausreichend für jede Folie) oder Tauchen.
   Hinweis: Alle Beispiele, die mit einander verglichen werden in Färbelösung für die gleiche Menge an Zeit einzuhalten.

6. gegenfärbung und montieren

1. Pipettieren eine gegenfärbung auf den Objektträger, wenn die Folien ein angemessenes Maß an Bläue erreicht haben.
   Hinweis: Counterstains, die die Kerne rot oder Grün verwandeln bieten guten Kontrast mit dem Blau durch die Formazan Fällungsmittel erstellt.
2. Mit wässrigen und nichtwässrigen Montage mittlerer²²montieren. Ein bis drei Tropfen (40-50 µL) Eindeckmedium reicht je nach Größe des Deckglases.

7. Bild Folien und quantifizieren

1. Bildfolien unter einem Lichtmikroskop. Nehmen Sie Fotos von experimentellen und Kontrollproben und alle negativen Kontrollen an 10 X, 20 X und 40 X Vergrößerung.
2. Bestimmen Sie die Intensität der Bläue in verschiedenen Regionen mit Bildanalyse-Software.

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Ergebnisse

Wir haben bereits Ergebnisse für in Situ Aktivität Assays in Maus Haut²⁰berichtet. Wie in Abbildung 3dargestellt, haben wir beobachtet, dass hoher Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in den Haarfollikel Stammzellen an der Basis des Haarfollikels, wenn die Verfahren oben beschrieben befolgt wurden. Diese Ergebnisse wurden durch Fluoreszenz aktiviert Zelle Sortierung der Haut für Stammzellen Haarfollikel und bestätigt hohe Lakta...

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Diskussion

Die hier beschriebene Methode kann verwendet werden, zur Überwachung der Tätigkeit des Laktat-Dehydrogenase oder andere metabolische Enzyme, die NADH oder NADPH, in verschiedenen Zelltypen innerhalb eines Gewebes oder verschiedene Teile eines Gewebes im Laufe der Zeit zu generieren. Laktat-Dehydrogenase ist ein wichtiges Enzym für das Verständnis der Biologie der Stammzellen und Tumoren, und die Fähigkeit, Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in einzelnen Zellen überwachen wird voraussichtlich wichtige Einblicke in die ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical instruments			For collecting skin from euthanized mice
Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm	Fisher Scientific	NC9511236	For freezing mouse skin
Tissue-Tek O.C.T. compound	Fisher Scientific	NC9638938	For mounting cryomolds
Ice bucket	Fisher Scientific	07-210-106
Dry Ice
Polysine Adhesion Slide	Fisher Scientific	12-545-78
4% formalin	Fisher Scientific	23-245-684	Dilluted in water
phosphate buffered saline, pH 7.4
vortex
Tris base	Fisher Scientific	23-245-684
NAD	Sigma-Aldrich	N7004
Phenazine methosulfate	Sigma-Aldrich	P9625
Nitrotetrazolium blue chloride	Sigma-Aldrich	N6876
Lithium L-lactate	Sigma-Aldrich	L2250	Substrate
37°C incubator (or tissue culture incubator)
Braziliant! Counter stain	Anatech	861	Counter stain
Mounting medium	Vector Laboratories	H-5000
Cover slips for slides	Fisher Scientific	12-544D
Light microscope