מיפוי החומרים: פיקוח על פעילות לקטט דהידרוגנאז ישירות בתוך הרקמה

Summary

אנו מתארים פרוטוקול זמן התגובה. ממפה את התפוצה המרחבית של אנזימטי לפעילות אנזימים המייצרים nicotinatmide אדנין dinucleotide פוספט (NAD(P)H) + H + ישירות בדגימות רקמה.

Abstract

מיפוי פעילות אנזימטי במרחב ובזמן חיוני להבנת הבסיס המולקולרי של התנהגות התא בתוך הרקמות ומחלות. בחיי עיר פעילות חילוף החומרים מבחני יכול לספק מידע על חלוקת מרחבי פעילות חילוף החומרים בתוך רקמה. אנו מספקים כאן פרוטוקול מפורט עבור ניטור פעילות האנזים לקטט דהידרוגנאז ישירות בדגימות רקמה. לקטט דהידרוגנאז הוא דטרמיננטה חשוב של אם נצרך גלוקוז יומרו האנרגיה דרך גליקוליזה אירובי או אנאירובי. פתרון המכיל NAD ו לקטט מסופק על קטע רקמה קפוא. תאים עם פעילות גבוהה לקטט דהידרוגנאז יהיה להמיר את לקטט שסופקו פירובט, בעוד בו-זמנית המרת nicotinamide אדנין dinucleotide (NAD) NADH ו פרוטון, אשר ניתן לאתרם מבוסס על הפחתת nitrotetrazolium כחול formazan, אשר הוא מדמיין כמו התמיסה כחול. אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור ניטור פעילות לקטט דהידרוגנאז בעור העכבר. יישום פרוטוקול זה, מצאנו כי פעילות לקטט דהידרוגנאז גבוה בתאי גזע השבתה הדרגתית זקיק השיער בתוך העור. החלת הפרוטוקול בתאי גזע עובריים בעכבר בתרבית חשף מכתים גבוה יותר ב בתרבית תאי גזע עובריים מאשר fibroblasts עובריים בעכבר. ניתוח של אבי העורקים העכבר טרי מבודד גילה מכתים בתאי השריר החלק בניצב אבי העורקים. המתודולוגיה המסופקים ניתן למפות במרחב הפעילות של אנזימים המייצרים פרוטון ברקמת קפואים או טריים.

Introduction

הבנה של המיקומים בתוך הרקמות שבו אנזימים יש פעילות גבוהה או נמוכה חיוני עבור פיתוח הבנה ופיזיולוגיה. רמות חלבון או תעתיק משמשים כתחליף לפעילות אנזימטיות. בעוד מחקרים כאלה יכולים להיות אינפורמטיבי, הם אינם מספקים מידע יכול להיות קריטי לקביעת הפעילות של אנזים, כגון שינויים post-translational, הנוכחות של חלבון מתחמי או הלוקליזציה של האנזים subcellular. כאשר פעילות אנזימטי נמדד באופן ישיר, הוא לעתים קרובות מנוטר ב lysates חלבון הומוגני יותר המכילים מידע אודות תאים בודדים בתוך התערובת או את התפוצה המרחבית של התאים עם פעילות גבוה או נמוך בתוך רקמה.

אנו מספקים כאן פרוטוקול מפורט עבור מיפוי את התפוצה המרחבית של פעילות אנזימטי בתוך דגימת רקמה. המתודולוגיה מבוססת על מחקרים מוקדמים יותר הוכחת כי מלחי tetrazolium ניתן למקם את הפעילות של dehydrogenases, reductases ו oxidases רקמות קפוא¹. באמצעות שיטות אלה, formazan לא מסיס-מים נוצר כאשר פרוטונים מועברים מלח^2,tetrazolium³. גלוקוז-6-פוספט דהידרוגנאז מחוללת nadph של פרוטון, זוהתה עם פעילות tetrazolium. גלוקוז-6-פוספט דהידרוגנאז נמצא במעקב ב התלבט האירופית hepatocytes⁴, מכתשי מסוג 2 תאים של הריאות⁵ ו nephrons של כליות⁵. מלחי Tetrazolium שימשו גם לעקוב אחר פעילות transketolase רקמות קפואים⁶. בגישה דומה שימש לאחרונה כדי לפקח על הפעילות של dehydrogenases מרובות בתוך הרקמה זהה על שקופיות סמוכים⁷.

נתאר כאן שיטה לשימוש tetrazolium מלחי כדי לנטר את התפוצה המרחבית של פעילות לקטט דהידרוגנאז (איור 1). לקטט דהידרוגנאז ניתן להמיר פירובט שנוצרו על-ידי גליקוליזה בלי חולצה, ואת התגובה הפוכה. לקטט דהידרוגנאז פעילות היא אפוא דטרמיננטה חשוב של פירובט הכניסה לתוך מחזור חומצה tricarboxylic לעומת שלה הפרשת כפי לקטט. רמת חומצת החלב בדם משמשים לעתים קרובות כדי לאבחן מגוון של מחלות, כולל סרטן^8,9,10, כי זה יכול לאותת כי מחלה או פציעה יש התאים הפגועים, האנזים שוחררה.

ישנם ארבעה גנים לקטט דהידרוגנאז: LDHA, LDHB, LDHC ו- LDHD¹¹. LDHA ו- LDHB הם חשבו שהתעוררו כתוצאה לכפל ג'ין מוקדם LDHA¹². LDH פעיל כמו tetramer, LDHA, LDHB יכול ליצור homotetramers ו- heterotetramers אחד עם השני. LDHA הוא דיווח יש זיקה גבוהה יותר עבור פירובט, בעוד LDHB הוא דיווח יש זיקה גבוהה יותר עבור לקטט, מעדיפים להמיר לקטט פירובט¹³. האמרגן LDHA מכיל אתרי קישור HIF1α, cMYC ו FOXM1 שעתוק גורמים¹¹. בנוסף, כמו רבים אחרים אנזימים glycolytic^14,15, LDH יכול להיות שונה על-ידי שינויים post-translational. קולטן גורם הצמיחה פיברובלסט 1 יכול phosphorylate LDHA Y10, המקדם גיבוש tetramer, או Y83, אשר מקדם NADH המצע איגוד¹⁶. LDHA יכול להיות גם acetylated¹⁷. מסיבות אלו, הבנה מלאה של פעילות LDH דורש ניטור רמות החלבון LDH אלא גם הפעילות של האנזים.

בנוסף השיטה שאנו מציגים כאן, גישות אחרות שימשו כדי לעקוב אחר פעילות לקטט דהידרוגנאז. ניתן לנטר פעילות לקטט דהידרוגנאז spectrophotometrically הומוגני חלבון lysate. הדור של NADH כפי מומר לקטט פירובט ניתן למדוד בהתבסס על ספיגת-340 nm, בעוד ניתן לנטר את היעלמותו של NADH כפי פירובט מומר לקטט¹⁸. לקטט דהידרוגנאז פעילות גם נמצא במעקב עם תהודה מגנטית (MRI). ¹³ C-פירובט יכול להינתן ו ניתן לנטר את ההמרה של פירובט תניקי כיחס בין [1 -¹³C] לקטט / [1 -¹³C] פירובט. גבוה יחסי של [1 -¹³C] לקטט / [1 -¹³C] פירובט נצפו סרטן רקמות¹⁹. בעוד גישות MRI יכול לספק מידע על פעילות לקטט דהידרוגנאז רגילה ורקמות המחלה, למתודולוגיות אין רזולוציה צריך לקבוע את רמת פעילות תאים מסוימים. המתודולוגיה שסופק כאן יכול לספק מידע על פעילות לקטט דהידרוגנאז באזורים רקמות, אפילו בתאים בודדים.

שימוש בבאתרו פעילות מבחני, מצאנו כי הפעילות של לקטט דהידרוגנאז גבוה בתאי גזע זקיק השיער העכבר העור²⁰. השתמשנו גם השיטה כדי לפקח על הפעילות של לקטט דהידרוגנאז ב בתרבית תאי גזע עובריים ומצא שהפעילות הוא גבוה בתאי גזע יותר בשכבה מזין. לבסוף אנחנו במעקב את הפעילות של לקטט דהידרוגנאז העכבר טרי לאבי העורקים, נצפתה צביעת תאי שריר חלק. נתאר כאן פרוטוקול מפורט עבור ניטור פעילות לקטט דהידרוגנאז בעור העכבר קפוא.

Protocol

כל הניסויים המתוארים אושרו על ידי ועדת אכפת לי חיה ב אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס.

1. ליצור שקופיות של העור העכבר קפוא

1. המתת חסד עכברים בהתאם למדיניות המוסד.
   הערה: בצע את מדיניות מוסדית עבור ביגוד מגן. כל הפרוטוקולים המערבות בעלי חיים תאושר ע י הוועדה המוסדית אכפת לי בעל חיים.
2. להסיר השיער של העכבר עם טרימר שיער בעלי חיים.
3. לעשות חתכים בעור באמצעות מספריים. באמצעות מלקחיים, הרם את העור מן העכבר. בעזרת מספריים, לחתוך את המקטע העור.
4. למלא את cryomold עם מקפיא ריאגנט מורכבים (ראה טבלה של חומרים).
5. במקום סעיפים העור לתוך cryomolds מלא באמצעות מלקחיים שפיץ. אוריינט העור כך רקמות פרוסות יפיק חתך רוחב של העור מכל האפידרמיס הדרמיס, ובהיפודרמיס, שרירים (איור 2).
   הערה: אם הדבר אפשרי, הר ניסיוני ושליטה עכברים יחד ב cryomold אותו אז הם ניתן למחלקה אותן לשקופית באותה ולעבד יחד. לטפל לא כדי ליצור בועות.
6. במקום cryomold על משטח שטוח של גוש קרח יבש ב דלי קרח ואפשר להקפיא. ממשיכים לבחון את הכיוון של העור. התאם במידת הצורך.
   הערה: ללבוש כפפות קריוגני בעת טיפול בקרח יבש.
7. העברת cryomolds בפריזר-80 ° C עבור אחסון. דוגמאות יכול להישמר במקרר כ 3 חודשים ללא אובדן משמעותי של פעילות אנזימטיות. אל תתנו מקטעים קפוא להתייבש.
8. שימוש cryostat ב-20 ° C, פרוסה רקמות כדי ליצור מקטעים 7-10 מיקרומטר עבה מורפולוגיה העור הטוב ביותר²¹.

2. הכנת את שקופיות עבור צביעת

1. להקים את קבוצת שקופיות להיבדק. לכלול שקופית הפקד שעליו יתעכב NAD והחלק פקד אחר שבו המצע, לקטט, תמנע. לכלול שקופית בקרה חיובית של בלוק קפוא רקמות בעבר חקרו.
2. בקצרה לתקן שקופיות המכילה סעיפים העור עם 4% פורמלין במשך 5 דקות או על ידי pipetting 1 מ"ל של 4% פורמלין אותן לשקופית, או בעת עיבוד שקופיות מרובות, בטבילת מגלשות לתוך מיכל המכיל 4% פורמלין.
   הערה: הקיבעון יבטיח שהעור ואינה מתקלפת מהשקופיות במהלך ההליכים הבאים לשמר המורפולוגיה העור.
   זהירות: פורמלין היא גורם מסרטן ו מסוכנים; יש ללבוש כפפות, לא לתת לזה לגעת בעור שלך ולבצע שלב זה בשכונה fume כימי.
3. שקופיות תשטוף לפחות 1 mL פוספט buffered תמיסת מלח, pH 7.4, לכל שקופית על-ידי pipetting או טבילה.

3. הכנת מכתים פתרון

1. מערבולת יחד ריאגנטים עבור צביעת פעילות לקטט דהידרוגנאז (50 מ מ טריס pH 7.4, 750 NADP מיקרומטר, 80 methosulfate phenazine מיקרומטר (PMS), 600 כלוריד nitrotetrazolium כחול מיקרומטר ו לקטט 30 מ מ) בצינור בגודל מתאים בהתאם לכמות מכתים הפתרון הנדרש.
   הערה: 1 מ"ל מספיקה לכסות לגמרי את שקופית אחת.
2. להכין פתרון השני שבו כל ריאגנטים קיימים מלבד NAD. להכין פתרון השלישי שבו כל ריאגנטים קיימים מלבד לקטט.

4. דגירה את השקופיות ב מכתים פתרון

1. בעדינות pipet הפתרון מכתימים או פתרונות בקרה על גבי שקופיות שהוכנו מראש המכסה הסעיף בשלמותו (1 מ"ל הוא מספיק עבור שקופית אחת). אם מספר שקופיות המעובדות יחד, טובלים כל השקופיות בתוך תמיסת מכתימים באותו זמן (ודא המכולה יש מספיק הפתרון לכסות לגמרי את סעיף הרקמה).
2. דגירה השקופיות בסביבה humidified ב 37 מעלות צלזיוס בחושך. אם צביעת פתרון נמצאת מעל לשקופית, למקם את השקופית בסביבה humidified כדי למנוע אידוי.

5. הצג השקופיות

1. לפקח על ההמרה של הפתרון מכתימים שקוף כחול על ידי בדיקה חזותית. כאשר הדגימות הגיעו את הרמה הרצויה של מתפרצים, להפסיק את התגובה על ידי הסרת הפתרון מוכתמים.
   הערה: לעור, 10 דקות היא מספקת. הזמן תלוי האיבר ועל הפעילות האנזימטית מתרחשת.
2. לשטוף שקופיות עם תמיסת מלח פוספט buffered מאת pipetting (1 מ"ל מספיקה עבור כל שקופית) או טבילה.
   הערה: דוגמיות תיערך השוואה בין אחד לשני. זה חייב להישמר בפתרון מכתימים עבור אותה כמות של זמן

6. counterstain והר

1. Pipet counterstain על השקופיות כאשר השקופיות הגיעו רמה מתאימה של מתפרצים.
   הערה: Counterstains שהופכים את הגרעינים אדום או ירוק יעניק קונטרסט טוב הכחול שנוצר formazan precipitant.
2. הר עם מימית או הלא-מימית הרכבה בינונית²². שנה עד שלוש טיפות (40-50 µL) של הרכבה בינונית מספיקה בהתאם לגודל של תגית כיסוי.

7. תמונה שקופיות ולכמת

1. תמונות שקופיות תחת מיקרוסקופ אור. קח תמונות של הניסוי, ודוגמאות שליטה כל הפקדים שלילי-10 X 20 X, 40 X הגדלה.
2. קבע את עוצמת כתם כחול באזורים שונים עם תוכנת ניתוח התמונה.

תוצאות

אנחנו דיווחו בעבר כי תוצאות בחיי עיר פעילות מבחני העור העכבר²⁰. כפי שמוצג באיור3, נצפו רמות גבוהות של לקטט דהידרוגנאז פעילות תאי גזע זקיק השיער בבסיס זקיק השיער כאשר ההליכים המתוארים לעיל עקבו. ממצאים אלה אומתו תא פלורסצנטיות מופעל מיון ש...

Discussion

השיטה המתוארת כאן יכול לשמש כדי לפקח על הפעילות של לקטט דהידרוגנאז או אחרים אנזימים מטבוליים הפקת NADH או nadph ל, סוגי תאים שונים בתוך רקמה או חלקים שונים של רקמה לאורך זמן. לקטט דהידרוגנאז הוא אנזים חשוב להבנת הביולוגיה של תאי גזע, גידולים, היכולת לעקוב אחר פעילות לקטט דהידרוגנאז בתאים בודדים...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical instruments			For collecting skin from euthanized mice
Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm	Fisher Scientific	NC9511236	For freezing mouse skin
Tissue-Tek O.C.T. compound	Fisher Scientific	NC9638938	For mounting cryomolds
Ice bucket	Fisher Scientific	07-210-106
Dry Ice
Polysine Adhesion Slide	Fisher Scientific	12-545-78
4% formalin	Fisher Scientific	23-245-684	Dilluted in water
phosphate buffered saline, pH 7.4
vortex
Tris base	Fisher Scientific	23-245-684
NAD	Sigma-Aldrich	N7004
Phenazine methosulfate	Sigma-Aldrich	P9625
Nitrotetrazolium blue chloride	Sigma-Aldrich	N6876
Lithium L-lactate	Sigma-Aldrich	L2250	Substrate
37°C incubator (or tissue culture incubator)
Braziliant! Counter stain	Anatech	861	Counter stain
Mounting medium	Vector Laboratories	H-5000
Cover slips for slides	Fisher Scientific	12-544D
Light microscope