Metabolismo de mapeamento: Monitorar a atividade de lactato desidrogenase diretamente no tecido

Resumo

Descreveremos um protocolo para mapear a distribuição espacial da atividade enzimática por enzimas que geram nicotinatmide adenina dinucleótido fosfato (NAD(P)H) + H + diretamente em amostras de tecido.

Resumo

Mapeamento de atividade enzimática no espaço e no tempo é fundamental para o entendimento da base molecular do comportamento celular em tecido normal e doença. Ensaios de atividade metabólica in situ podem fornecer informações sobre a distribuição espacial da atividade metabólica dentro de um tecido. Nós fornecemos aqui um protocolo detalhado para monitorar a atividade da enzima lactato desidrogenase diretamente em amostras de tecido. Lactato desidrogenase é um determinante importante de se glicose consumida será convertido em energia via glicólise aeróbica ou anaeróbica. Uma solução contendo lactato e NAD é fornecida para uma secção de tecido congelado. Células com atividade alta lactato desidrogenase irão converter o fornecido lactato para piruvato, enquanto simultaneamente converter fornecido nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) para NADH e um próton, o que pode ser detectado com base na redução da nitrotetrazolium azul para formazan, que é visualizada como um precipitado azul. Descreveremos um protocolo detalhado para monitorar a atividade da lactato desidrogenase em pele de rato. Aplicação deste protocolo, encontramos que a atividade de lactato desidrogenase é alta em células-tronco a quiescente do folículo de cabelo dentro da pele. Aplicando o protocolo de células-tronco embrionárias cultivadas rato revelou maior coloração em células-tronco embrionárias cultivadas de fibroblastos embrionários de rato. Análise da aorta de rato recém isolado revelou coloração em células musculares lisas perpendicular à aorta. A metodologia fornecida pode ser usada para mapear espacialmente a atividade das enzimas que geram um próton em tecido congelado ou fresco.

Introdução

Compreender os locais dentro de tecidos em que as enzimas têm alta ou baixa atividade é essencial para a fisiologia e desenvolvimento da compreensão. Níveis de transcrição ou proteína são frequentemente utilizados como substitutos para a atividade enzimática. Embora tais estudos podem ser informativos, eles não fornecem informações que podem ser críticas para determinar a atividade de uma enzima, tais como modificações borne-translational, a presença de complexos de proteínas, ou Localização subcellular da enzima. Quando a atividade enzimática é medida diretamente, é frequentemente monitorado em proteína homogeneizada lysates que já não contêm informações sobre células individuais dentro a mistura ou a distribuição espacial das células com alta ou baixa atividade dentro de um tecido.

Nós fornecemos aqui um protocolo detalhado para mapear a distribuição espacial da atividade enzimática dentro de uma amostra de tecido. A metodologia é baseada em estudos anteriores, demonstrando que os sais de tetrazólio podem ser usados para localizar a atividade de desidrogenases, redutases e oxidases em tecido congelado¹. Com esses métodos, um formazan insolúvel em água é formado quando os prótons são transferidos para um tetrazólio sal^2,3. Glicose-6-fosfato desidrogenase gera NADPH e um próton e foi detectada com actividade de tetrazólio. Glicose-6-fosfato desidrogenase tem sido monitorado em hepatócitos linguado Europeu⁴, em células alveolares tipo 2 dos pulmões⁵ e néfrons do rim⁵. Sais de tetrazólio também tem sido usados para monitorar atividade transketolase em tecido congelado⁶. Uma abordagem semelhante foi usada recentemente para monitorar a atividade de desidrogenases múltiplas no mesmo tecido adjacente slides⁷.

Descrevemos aqui um método para usar sais de tetrazólio para monitorar a distribuição espacial da atividade da lactato desidrogenase (Figura 1). Lactato desidrogenase pode converter piruvato gerado pela glicólise de lactato e a reação inversa. Atividade da lactato desidrogenase, consequentemente, é um determinante importante da entrada do piruvato no ciclo do ácido cítrico contra sua secreção como lactato. Níveis de lactato no sangue são frequentemente usados para diagnosticar uma variedade de doenças, incluindo câncer,^8,9,10, porque ele pode sinalizar que doença ou lesão tem células danificadas e a enzima foi liberada.

Existem quatro genes de lactato desidrogenase: LDHA, LDHB, LDHC e LDHD¹¹. LDHA e LDHB são pensados para ter surgido de duplicação de um início de gene LDHA¹². LDH é ativo como um tetrâmero e LDHA e LDHB podem formar homotetramers e heterotetramers uns com os outros. LDHA é relatado para ter maior afinidade para o piruvato, enquanto LDHB é relatado para ter maior afinidade para lactato e preferencialmente converter lactato para piruvato¹³. O promotor LDHA contém sítios de ligação para o HIF1α, cMYC e FOXM1 fatores transcrição¹¹. Além disso, como muitas outras enzimas glicolíticas^14,15, LDH pode ser modificado por modificações borne-translational. Receptor 1 do fator de crescimento fibroblástico pode fosforilar LDHA em Y10, que promove a formação do tetrâmero, ou Y83, que promove o NADH substrato ligação¹⁶. LDHA também pode ser acetilado¹⁷. Por estas razões, uma compreensão completa da atividade LDH requer monitoramento não só os níveis de proteína LDH, mas atividade de enzima também.

O método que apresentamos aqui, além de outras abordagens têm sido utilizadas para monitorar a atividade da lactato desidrogenase. Atividade da lactato desidrogenase pode ser monitorada por espectrometria no lisado homogeneizada proteína. A geração de NADH como o lactato é convertido em piruvato pode ser medida com base na absorbância em 340 nm, enquanto o desaparecimento do NADH pode ser monitorado como o piruvato é convertido em lactato¹⁸. Atividade de lactato desidrogenase também tem sido monitorada com ressonância magnética (MRI). ¹³ C-piruvato pode ser administrada e a conversão de piruvato para lactato pode ser monitorizada como a razão de [1 -¹³C] lactato / [1 -¹³C] piruvato. Elevados índices de [1 -¹³C] lactato / [1 -¹³C] piruvato têm sido observadas no câncer de tecido¹⁹. Enquanto abordagens baseadas em MRI podem fornecer informações sobre a atividade da lactato desidrogenase no normal e doença os tecidos, as metodologias não têm a resolução necessária para determinar o nível de atividade em células específicas. A metodologia fornecida aqui pode fornecer informações sobre a atividade da lactato desidrogenase em áreas de tecido e até mesmo em células únicas.

Usando em situ ensaios de atividade, encontramos que a atividade da lactato desidrogenase é rica em células-tronco o folículo piloso da pele de rato²⁰. Nós também usamos o método para monitorar a atividade da lactato desidrogenase em células-tronco embrionárias cultivadas e encontrou que a atividade é superior nas células-tronco da camada do alimentador. Finalmente, monitorado a atividade da lactato desidrogenase em aorta de rato fresco e observado a coloração em células musculares lisas. Descrevemos aqui um protocolo detalhado para monitorar a atividade da lactato desidrogenase em pele de rato congelado.

Protocolo

Todos os experimentos descritos foram aprovados pelo Comitê de cuidado Animal a Universidade da Califórnia, Los Angeles.

1. gerar Slides de pele de rato congelado

1. Eutanásia em ratos, em conformidade com a política da instituição.
   Nota: Siga a política institucional para vestuário de protecção. Todos os protocolos que envolvam animais devem ser aprovados pelo Comitê institucional Animal conta.
2. Remova o cabelo do rato com um aparador de pelos de animais.
3. Faça incisões na pele com uma tesoura. Usando fórceps, levante a pele longe do mouse. Usando a tesoura, corte a seção da pele.
4. Preencha o cryomold com o congelamento reagente composto (ver Tabela de materiais).
5. Coloque a pinça de seções em cryomolds preenchido usando bico de pele. Oriente a pele para que fatias de tecido irão gerar uma secção transversal da pele da epiderme para a derme, hipoderme e músculo (Figura 2).
   Nota: se possível, montar experimental e controlar ratos juntos no mesmo cryomold para que possam ser seccionados a mesma lâmina e processados juntos. Tome cuidado para não criar bolhas.
6. Coloque cryomold na superfície plana de um bloco de gelo seco em um balde de gelo e deixe congelar. Continue a observar a orientação da pele. Ajuste se necessário.
   Nota: Use criogênicas luvas ao manusear o gelo seco.
7. Transferi o cryomolds em um freezer-80 ° C para armazenamento. As amostras podem ser mantidas no congelador por aproximadamente 3 meses sem perda significativa de atividade enzimática. Não deixe as seções congeladas dessecar.
8. Usando um criostato a-20 ° C, pedaço de tecido para criar seções 7-10 µm de espessura para a melhor pele morfologia²¹.

2. Preparar lâminas para coloração

1. Estabelece o conjunto de slides para ser testado. Incluem um slide de controle no qual NAD vai ser retido e outro controle slide no qual o substrato, lactato, vai ser retido. Incluem uma lâmina de controlo positivo de um bloco de tecido congelado anteriormente investigado.
2. Brevemente corrigi slides contendo seções de pele com formol a 4% por 5 min por pipetagem 1 mL de formol a 4% para o slide, ou durante o processamento de vários slides, mergulhando de slides em um recipiente que contém formol a 4%.
   Nota: A fixação irá garantir que a pele não descasque fora das lâminas de durante os seguintes procedimentos e preservar a morfologia da pele.
   Cuidado: Formol é uma substância cancerígena e perigosos; usar luvas, não deixe que ele toque sua pele e execute esta etapa em uma coifa de química.
3. Lave slides pelo menos 1 fosfato mL tampão salino, pH 7,4, por slide por pipetagem ou mergulhando.

3. preparar a solução de coloração

1. Reagentes juntos de vórtice para coloração de atividade de lactato desidrogenase (pH de Tris 50mm 7.4, 750 µM NADP, 80 µM Fenazina methosulfate (PMS), cloreto de nitrotetrazolium azul 600 µM e lactato de 30 mM) em um tubo de tamanho apropriado dependendo da quantidade de coloração solução necessária.
   Nota: 1 mL é suficiente para cobrir completamente um slide.
2. Prepare uma solução de segunda em que todos os reagentes estão presentes exceto NAD. Prepare uma solução de terceiros, em que todos os reagentes estão presentes exceto lactato.

4. Incubar em solução de coloração

1. Suavemente a pipeta a coloração da solução ou soluções de controle sobre as guias preparadas cobrindo a seção em sua totalidade (1ml é suficiente para um slide). Se vários slides estão sendo processados juntos, mergulhar todos os slides na solução de coloração ao mesmo tempo (verifique se o recipiente tem a solução suficiente para cobrir completamente a secção de tecido).
2. A incubar em um ambiente umidificado a 37 ° C, no escuro. Se a solução de coloração é em cima do slide, coloque o slide em um ambiente umidificado para evitar a evaporação.

5. monitorar os Slides

1. Monitore a conversão da solução de coloração de clear para azul por inspeção visual. Quando as amostras atingiram o nível desejado de cor azul, pare a reação, removendo a coloração da solução.
   Nota: Para a pele, 10 minutos é suficiente. O tempo depende do órgão e a atividade enzimática.
2. Enxágue slides com solução salina tamponada fosfato pipetando (1ml é suficiente para cada slide) ou mergulhando.
   Nota: a colheita de amostras que será comparada entre si deve ser mantida na coloração da solução para a mesma quantidade de tempo.

6. counterstain e montar

1. Pipetar um corante de contraste para os slides quando as lâminas atingem um nível adequado de cor azul.
   Nota: Counterstains que por sua vez os núcleos vermelho ou verde fornecerá bom contraste com o azul criado pelo formazan precipitant.
2. Montar com aquosa ou aquosos médio²²de montagem. Uma a três gotas (40-50 µ l) de meio de montagem é suficiente, dependendo do tamanho da lamínula.

7. imagem slides e quantificar

1. Slides de imagem sob um microscópio de luz. Tire fotografias de experimental e amostras de controle e todos os controles negativos em 10x, 20x e ampliação de 40 X.
2. Determine a intensidade da mancha azul em diferentes regiões com software de análise de imagem.

Resultados

Nós já relatado resultados para ensaios em situ de atividade em pele de rato²⁰. Como mostrado na Figura 3, observou-se altos níveis de atividade da lactato desidrogenase em células-tronco no folículo piloso na base do folículo de cabelo quando os procedimentos descritos acima foram seguidos. Estas conclusões foram corroboradas pela célula de fluorescência ativada triagem de pele para pilhas de haste do folículo pilos...

Discussão

O método descrito aqui pode ser usado para monitorar a atividade da lactato desidrogenase ou outras enzimas metabólicas que geram NADH ou NADPH, em diferentes tipos de células em um tecido ou dentro de diferentes partes de um tecido ao longo do tempo. Lactato desidrogenase é uma enzima importante para a compreensão da biologia das células-tronco e tumores, e a capacidade de monitorar a atividade da lactato desidrogenase em células individuais é susceptível de fornecer importantes insights sobre a função desta ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical instruments			For collecting skin from euthanized mice
Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm	Fisher Scientific	NC9511236	For freezing mouse skin
Tissue-Tek O.C.T. compound	Fisher Scientific	NC9638938	For mounting cryomolds
Ice bucket	Fisher Scientific	07-210-106
Dry Ice
Polysine Adhesion Slide	Fisher Scientific	12-545-78
4% formalin	Fisher Scientific	23-245-684	Dilluted in water
phosphate buffered saline, pH 7.4
vortex
Tris base	Fisher Scientific	23-245-684
NAD	Sigma-Aldrich	N7004
Phenazine methosulfate	Sigma-Aldrich	P9625
Nitrotetrazolium blue chloride	Sigma-Aldrich	N6876
Lithium L-lactate	Sigma-Aldrich	L2250	Substrate
37°C incubator (or tissue culture incubator)
Braziliant! Counter stain	Anatech	861	Counter stain
Mounting medium	Vector Laboratories	H-5000
Cover slips for slides	Fisher Scientific	12-544D
Light microscope