Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Biz nicotinatmide adenin dinükleotit fosfat (NAD(P)H) + H + doğrudan doku örnekleri '. oluşturmak enzimler için enzimatik aktivite kayma dağıtım eşleştirmek için bir protokol tarif

Özet

Uzay ve zamanın enzimatik aktivite haritalama normal doku ve hastalık hücre davranışı moleküler temeli anlamak için önemlidir. Situ metabolik aktivite deneyleri bir doku içinde metabolik aktivite kayma dağıtımı hakkında bilgi sağlar. Biz burada enzim laktat dehidrogenaz doku örnekleri içinde doğrudan etkinliğini izlemeye yönelik detaylı bir protokol sağlar. Laktat dehidrogenaz olup tüketilen glikoz enerji aerobik veya anaerobik glikoliz yoluyla dönüştürülür önemli bir belirleyici olduğunu. Laktat ve NAD içeren bir çözüm bir donmuş doku bölümüne sağlanır. Nikotinamid adenin dinükleotit (NAD) NADH ve tespit edilebilir bir proton azaltılmasına dayanan sağlanan aynı anda dönüştürme sırasında hücreleri yüksek laktat dehidrogenaz aktivitesi pyruvate için sağlanan laktat dönüştürme nitrotetrazolium mavi formazan, mavi bir çökelti görüntülenir. Biz fare cilt laktat dehidrogenaz etkinliğini izleme için detaylı bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı uygulamak, laktat dehidrogenaz aktivitesi yüksek deneniyor saç kökü kök hücreleri cilt içinde olduğunu fark ettik. Protokol kültür fare embriyonik kök hücre için uygulama daha yüksek kültürlü embriyonik kök hücre boyama fare embriyonik fibroblastlar ortaya koydu. Çözümleme taze izole fare aort düz kas hücrelerinde aort için dikey boyama ortaya. Sağlanan metodoloji dağınık şekilde bir proton dondurulmuş ya da taze doku oluşturmak enzim aktivitesinin eşlemek için kullanılabilir.

Giriş

Mekanlar enzimleri yüksek veya düşük aktivite olan dokularda anlamak anlayış geliştirme ve Fizyoloji için esastır. Transkript veya protein düzeyleri kez enzimatik aktivite için vekilleri olarak kullanılır. Bu tür çalışmalar bilgilendirici olabilir, onlar translasyonel modifikasyon, protein kompleksleri veya enzim hücre altı yerelleştirme varlığı gibi bir enzim aktivite belirlemek için kritik olabilir bilgi vermeyin. Enzimatik etkinliğini doğrudan ölçülen zaman, artık bir doku içinde yüksek veya düşük aktivite ile karışım veya kayma dağıtım hücrelerin içindeki tek tek hücreler hakkında bilgi içeren homojenize protein lysates içinde sık sık izlenir.

Biz burada bir doku örneği içinde enzimatik aktivite kayma dağılımını eşlemek için detaylı bir protokol sağlar. Metodoloji önceki çalışmalar tetrazolium tuzları dehydrogenases, redüktaz ve oxidases dondurulmuş doku1aktivite yerelleştirmek için kullanılabileceğini gösteren temel alır. Proton bir tetrazolium tuz2,3' e transfer edildiğinde bu yöntemler ile bir su çözünmez formazan oluşur. Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz NADPH ve bir proton oluşturur ve tetrazolium aktivite ile tespit edilmiştir. Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz içinde Avrupa dere pisisi tetkikine4, alveoler tip 2 hücrelerinde5 akciğer ve böbrek5ın takip. Tetrazolium tuzları da donmuş doku6transketolase etkinliğini izlemek için kullanılmaktadır. Benzer bir yaklaşım son zamanlarda bitişik slayt7aynı doku içinde birden çok dehydrogenases etkinliğini izlemek için kullanıldı.

Biz burada tetrazolium tuzları laktat dehidrogenaz aktivitesi (Şekil 1) kayma dağılımını izlemek için kullanılacak bir yöntem açıklanmaktadır. Laktat dehidrogenaz glikoliz laktat ve ters tepki tarafından oluşturulan pyruvate dönüştürebilirsiniz. Laktat dehidrogenaz sonuç olarak pyruvate'nın giriş tricarboxylic asit çevrimi laktat onun salgısı karşı önemli bir belirleyici bir faaliyettir. Kan laktat seviyeleri kez hastalıklar, hastalık veya yaralanma hücreler zarar vermişse ve enzim piyasaya sinyal çünkü kanser8,9,10, dahil olmak üzere bir dizi teşhis etmek için kullanılır.

Dört laktat dehidrogenaz genler vardır: LDHA, LDHB, LDHC ve LDHD11. LDHA ve LDHB bir erken LDHA gen12tekrarını ortaya çıktığı düşünülmektedir. Karaciğer bir tetramer etkindir ve LDHA ve LDHB homotetramers ve heterotetramers birbirleri ile oluşabilir. LDHA LDHB daha yüksek laktat benzeşim ve tercihen laktat pyruvate13için dönüştürmek için rapor ederken pyruvate için daha yüksek ilgi var bildirilmektedir. LDHA organizatörü bağlayıcı siteleri HIF1α, cMYC ve FOXM1 transkripsiyon faktörleri11içerir. Buna ek olarak, birçok diğer glycolytic enzimler14,15gibi karaciğer post-translational modifications tarafından değiştirilebilir. Fibroblast büyüme faktörü reseptörü 1 LDHA tetramer oluşumu teşvik, Y10 veya NADH substrat bağlama16teşvik Y83 fazdan. LDHA-ebilmek da var olmak acetylated17. Bu nedenlerden dolayı sadece karaciğer protein düzeyleri, ama enzim aktivitesi de izleme karaciğer etkinlik tam bir anlayış gerektirir.

Burada mevcut yöntemi yanı sıra diğer yaklaşımlar laktat dehidrogenaz etkinliğini izlemek için kullanılmaktadır. Laktat dehidrogenaz aktivitesi spectrophotometrically homojenize protein lysate izlenebilir. Gibi laktat pyruvate için dönüştürülür NADH nesil 340 absorbans temel alarak ölçülebilir nm, süre gibi pyruvate laktat18için dönüştürülür NADH kaybolması izlenebilir. Laktat dehidrogenaz aktivitesi manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ile de izlenir. 13 C-pyruvate idare ve laktat pyruvate dönüşüm oranı olarak izlenebilir [1 -13C] laktat / [1 -13C] pyruvate. Yüksek oranları [1 -13C] laktat / [1 -13C] pyruvate kanser dokusu19' gözlemlenmiştir. MRI tabanlı yaklaşımlar laktat dehidrogenaz aktivitesi normal ve hastalık doku üzerinde bilgi sağlayabilir iken, metodolojiler belirli hücrelerdeki faaliyet düzeyi belirlemek için gereken çözünürlük var mı. Burada sağlanan metodoloji laktat dehidrogenaz aktivitesi tek hücre doku alanları ve hatta ilgili bilgi sağlar.

Situ etkinlik testleri kullanarak, laktat dehidrogenaz aktivitesinin fare cilt20saç kökü kök hücrelerde yüksek olduğunu fark ettik. Biz de laktat dehidrogenaz kültürlü embriyonik kök hücre içinde etkinliğini izlemek ve faaliyetin besleyici katman kök hücre içinde daha yüksek olması kurmak için kullanılan yöntem. Son olarak, taze fare aort laktat dehidrogenaz aktivitesinin izlenmeli ve düz kas hücrelerinde boyama görülmektedir. Biz burada donmuş fare cilt laktat dehidrogenaz etkinliğini izleme için detaylı bir protokol tanımlamak.

Protokol

Açıklanan tüm deneylerin hayvan bakımı Komitesi Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles tarafından kabul edildi.

1. dondurulmuş fare deri slaytlar oluşturmak

  1. Fareler kurum politikası doğrultusunda ötenazi.
    Not: koruyucu giysiler için kurumsal ilke uygulayın. Tüm iletişim kuralları hayvanları içeren kurumsal hayvan bakımı Komitesi tarafından onaylanmış olması gerekir.
  2. Fare ile bir hayvan kılı düzeltici tüylerden.
  3. İnsizyon deri makas kullanarak olun. Forseps kullanarak, uzak fare cilt kaldırın. Makas kullanarak, cilt Bölüm Kes gitsin.
  4. Cryomold reaktif bileşik dondurma ile doldurun ( Tablo malzemelerigörmek).
  5. Cilt iğne burunlu bölümlere dolu cryomolds kullanarak forseps yerleştirin. Cilt dokusu dilimlerin bir kesit derinin epidermis dermis, hypodermis ve kas (Şekil 2) oluşturur gelecek şekilde yönlendirin.
    Not: Eğer mümkünse, deneysel bağlayabilir ve böylece aynı slayt kesitli ve birlikte işlenen fareler birlikte aynı cryomold kontrol. Kabarcıklar oluşturmak değil için dikkat ediniz.
  6. Cryomold bir buz kovası Kuru buz kalıbı düz yüzeye yerleştirin ve dondurma izin. Cilt yönünü izlemeye devam edin. Gerekirse ayarlayın.
    Not: Kuru buz işlerken kriyojenik eldiven giymek.
  7. Cryomolds-80 ° C dondurucu depolama içine aktarın. Örnekleri dondurucuda yaklaşık 3 ay enzimatik aktivite, önemli kaybı olmadan sürdürülebilir. Donmuş bölümleri kurumasına izin vermeyin.
  8. -20 ° c, 7-10 µm en iyi cilt morfoloji21için kalın bölümler oluşturmak için dilim doku bir cryostat kullanarak.

2. slayt boyama için hazırlanması

  1. Test edilmesi için slaytlar kümesi oluşturun. Bir denetim slayt üzerinde NAD tevkif içerir ve başka bir denetime slayt üzerinde belgili tanımlık substrate, laktat, tevkif edilecektir. Daha önce soruşturma bir donmuş doku blok olumlu denetim slayttan içerir.
  2. Kısaca 5 min için % 4 formalin ile cilt bölümü içeren slaytlar ya pipetting 1 mL % 4 formalin bir slayda veya birden çok slayt, slayt %4 formalin içeren bir konteyner içine daldırma tarafından işlenmesi sırasında düzelt.
    Not: Cilt slaytlardan aşağıdaki yordamlar ve korunağı cilt morfoloji sırasında soyulmak değil fiksasyonun sağlayacaktır.
    Dikkat: Formalin kanserojen ve tehlikeli olduğunu; eldiven giymek, senin cilde temas ve kimyasal duman mahallede bu adımı gerçekleştirin izin vermeyin.
  3. En az 1 mL fosfat ile yıkama slaytlar arabelleğe alınmış serum, pH 7.4, slayt pipetting veya daldırma.

3. çözüm boyama hazırlanması

  1. Laktat dehidrogenaz aktivitesi boyama için girdap birlikte reaktifler (50 mM Tris pH 7.4, 750 µM NADP, 80 µM phenazine methosulfate (PMS), 600 µM nitrotetrazolium mavi klorür ve 30 mM laktat) boyama miktarına bağlı olarak uygun ölçekli bir tüp Çözüm gerekli.
    Not: 1 mL tamamen bir slayt karşılamak için yeterli olur.
  2. Tüm reaktifler NAD dışında mevcut olan ikinci bir çözüm hazırlamak. Tüm reaktifler laktat dışında mevcut olan üçüncü bir çözüm hazırlamak.

4. kuluçkaya slaytlar çözüm boyama

  1. Yavaşça damlalıklı boyama çözüm veya bölümün tamamını kapsayan hazırlanan slaytlar üzerine kontrol çözümleri (1 mL bir slayt için yeterli). Birden çok slayt birlikte işlenen eğer boyama çözüm tüm slaytlara aynı anda daldırma (kapsayıcı tamamen doku bölümü karşılamak için yeterli bir çözüm olduğundan emin olun).
  2. Karanlıkta 37 ° C'de oksijen bir ortamda slaytlar kuluçkaya. Çözüm boyama slayt üstünde ise, slayt buharlaşma önlemek için oksijen bir ortamda yerleştirin.

5. monitör slaytları

  1. Boyama çözüm dönüşümden görsel denetim tarafından mavi için Sil izlemek. Örnekleri mavilik istenen seviyeye ulaşmış, reaksiyon boyama çözüm kaldırarak durdurur.
    Not: cilt için 10 dakika yeterlidir. Zaman organ ve enzimatik aktivite bağlı olacaktır.
  2. Pipetting tarafından slaytlar fosfat tamponlu tuz ile yıkayın (1 mL her slayt için yeterli) veya daldırma.
    Not: birbirine Karşılaştırılacak herhangi bir örnekleri boyama çözümde aynı süre için muhafaza edilmelidir.

6. counterstain ve mount

  1. Damlalıklı slayta slaytları mavilik uygun düzeyine ulaştığında counterstain.
    Not: çekirdeklerin açmak kırmızı veya yeşil Counterstains formazan tarafından precipitant oluşturulan mavi ile iyi kontrast sağlar.
  2. Sulu ya da sulu olmayan orta22montaj ile bağlayın. 1-3 damla (40-50 µL) montaj orta kapak notu boyutuna bağlı olarak yeterli.

7. resim slayt ve ölçmek

  1. Resim slaytları ışık mikroskop altında. Deneysel fotoğraflarını ve kontrol örnekleri ve 10 X, 20 X ve 40 X büyütme, tüm negatif kontrolleri al.
  2. Mavi leke görüntü analiz yazılımı ile farklı bölgelerdeki yoğunluğunu belirlemek.

Sonuçlar

Biz daha önce fare cilt20 in situ faaliyet deneyleri için sonuçlar bildirdin. Şekil 3' te gösterildiği gibi saç kökü kök hücre yukarıdaki yordamları tarif ederken Folliküler temelini laktat dehidrogenaz aktivitesinin yüksek seviyeleri takip edildi gözlenen. Bu bulgular deri saç kökü kök hücre için sıralama ve yüksek laktat dehidrogenaz aktivitesi kök hücre yerde sıralanmış hücreleri üzerinde etki...

Tartışmalar

Burada anlatılan yöntem laktat dehidrogenaz veya NADH ya da NADPH, farklı hücre tipleri bir doku veya bir doku zaman içinde farklı bölümlerini içinde oluşturmak diğer metabolik enzimler etkinliğini izlemek için kullanılabilir. Laktat dehidrogenaz kök hücreler ve tümör biyolojisi anlamak için önemli bir enzimdir ve tek tek hücreler laktat dehidrogenaz etkinliğini izlemek için yeteneği önemli anlayışlar bu enzim fonksiyonu sağlamak olasıdır.

Bir önemli avantaj bu p...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa etmek rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip.

Teşekkürler

HAC Milton E. Cassel bilgin Rita Allen Vakfı (http://www.ritaallenfoundation.org) yapıldı. Bu eser HAC için Ulusal Enstitüsü, genel tıbbi Bilimler R01 GM081686, R01 AR070245, Ulusal Enstitüsü () genel tıbbi Bilimler R01 GM0866465, Eli ve Edythe rejeneratif tıp geniş merkezi ve kök hücre araştırma hibe tarafından finanse edildi Rose Hills ve Hal Gaba Ödülleri), Iris Cantor kadın Sağlık Merkezi/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, lösemi lenfoma Derneği etkisi Jonsson kapsamlı kanser Merkezi'nden ödül WEL ve HAC için. Bu yayında bildirilen araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası P50CA092131 altında Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu. HAC Eli & Edythe rejeneratif tıp geniş merkezi & kök hücre araştırmaları, UCLA Moleküler Biyoloji Enstitüsü ve UCLA Biyoinformatik bölümler arası Programı üyesidir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Surgical instrumentsFor collecting skin from euthanized mice
Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mmFisher ScientificNC9511236For freezing mouse skin
Tissue-Tek O.C.T. compoundFisher ScientificNC9638938For mounting cryomolds
Ice bucketFisher Scientific07-210-106
Dry Ice
Polysine Adhesion SlideFisher Scientific12-545-78
4% formalinFisher Scientific23-245-684Dilluted in water
phosphate buffered saline, pH 7.4
vortex
Tris baseFisher Scientific23-245-684
NADSigma-AldrichN7004
Phenazine methosulfateSigma-AldrichP9625
Nitrotetrazolium blue chlorideSigma-AldrichN6876
Lithium L-lactateSigma-AldrichL2250Substrate
37°C incubator (or tissue culture incubator)
Braziliant! Counter stainAnatech861Counter stain
Mounting mediumVector LaboratoriesH-5000 
Cover slips for slidesFisher Scientific12-544D
Light microscope

Referanslar

  1. Boonacker, E., Van Noorden, C. J. Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis. J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).
  2. Seidler, E. The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry. Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).
  3. Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. . Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual of Current Methods. , (1992).
  4. Winzer, K., Van Noorden, C. J., Kohler, A. Quantitative cytochemical analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in living isolated hepatocytes of European flounder for rapid analysis of xenobiotic effects. J Histochem Cytochem. 49, 1025-1032 (2001).
  5. Negi, D. S., Stephens, R. J. An improved method for the histochemical localization of glucose-6-phoshate dehydrogenase in animal and plant tissues. J Histochem Cytochem. 25, 149-154 (1977).
  6. Boren, J., et al. In situ localization of transketolase activity in epithelial cells of different rat tissues and subcellularly in liver parenchymal cells. J Histochem Cytochem. 54, 191-199 (2006).
  7. Miller, A., et al. Exploring metabolic configurations of single cells within complex tissue microenvironments. Cell Metab. , (2017).
  8. Shen, J., et al. Prognostic value of serum lactate dehydrogenase in renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis. PLoS One. 11, e0166482 (2016).
  9. Zhang, X., et al. Prognostic significance of serum LDH in small cell lung cancer: A systematic review with meta-analysis. Cancer Biomark. 16, 415-423 (2016).
  10. Petrelli, F., et al. Prognostic role of lactate dehydrogenase in solid tumors: a systematic review and meta-analysis of 76 studies. Acta Oncol. 54, 961-970 (2015).
  11. Valvona, C. J., Fillmore, H. L., Nunn, P. B., Pilkington, G. J. The regulation and function of lactate dehydrogenase A: Therapeutic potential in brain tumor. Brain Pathol. 26, 3-17 (2016).
  12. Markert, C. L., Shaklee, J. B., Whitt, G. S. Evolution of a gene: Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure, function and regulation. Science. 189, 102-114 (1975).
  13. Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L. Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase. Proteins. 43, 175-185 (2001).
  14. Holness, M. J., Sugden, M. C. Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation. Biochem Soc Trans. 31, 1143-1151 (2003).
  15. Yi, W., et al. Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism. Science. 337, 975-980 (2012).
  16. Fan, J., et al. Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells. Mol Cell Biol. 31, 4938-4950 (2011).
  17. Zhao, D., et al. Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer. Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).
  18. Vanderlinde, R. E. Measurement of total lactate dehydrogenase activity. Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).
  19. Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate. Sci Transl Med. 5, 198ra108 (2013).
  20. Flores, A., et al. Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation. Nat Cell Biol. , (2017).
  21. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, (2008).
  22. Espada, J., et al. Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy. Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).
  23. Hisada, R., Yagi, T. 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors. J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyokimyasay 136laktat dehidrogenazin situenzimatik aktivitefare ciltmetabolizmametabolik harita

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır