映射代谢: 直接在组织中监测乳酸脱氢酶活性

摘要

我们描述了一种用于映射酶活性的空间分布的协议, 它能直接在组织样品中生成 nicotinatmide 腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NAD (P) h) + h。

摘要

在空间和时间内绘制酶活性是理解正常组织和疾病细胞行为的分子基础的关键。原位代谢活性测定可以提供有关组织内代谢活动的空间分布的信息。我们提供了一个详细的协议, 以监测乳酸脱氢酶的活性直接在组织样品。乳酸脱氢酶是一种重要的决定因素, 即食用葡萄糖是否会通过有氧或厌氧糖酵解转化为能量。含有乳酸和 NAD 的溶液被提供给冰冻组织切片。乳酸脱氢酶活性高的细胞将提供的乳酸转化为丙酮酸, 同时将所提供的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) 转化为 NADH 和质子, 可根据还原nitrotetrazolium 蓝色到 formazan, 这是可视化为蓝色沉淀。我们描述了一个详细的协议, 以监测乳酸脱氢酶活性的小鼠皮肤。应用该协议, 我们发现乳酸脱氢酶活性是高的静态毛囊干细胞在皮肤内。将该协议应用于培养的小鼠胚胎干细胞, 发现培养的胚胎干细胞比小鼠胚胎成纤维细胞有更高的染色。对刚分离的小鼠主动脉的分析显示, 垂直于主动脉的平滑肌细胞染色。所提供的方法可用于空间地映射在冷冻或新鲜组织中产生质子的酶活性。

引言

了解组织内酶具有高或低活性的部位, 对于理解发育和生理学是必不可少的。转录或蛋白质水平经常被用作酶活性的替代。虽然这类研究可以提供信息, 但它们并不能为确定酶的活性 (如平移后的修饰、蛋白质复合物的存在或酶的亚细胞定位) 的关键。当酶活性被直接测量, 它经常被监测在匀质蛋白裂解物, 不再包含有关单个细胞的信息, 或在组织内的高或低活动细胞的空间分布。

我们提供了一个详细的协议, 用于映射组织样本中酶活性的空间分布。该方法的基础是早期的研究表明, 四氮唑盐可用于本地化的活动, 脱氢酶, 硝酸和氧化酶在冷冻组织¹。利用这些方法, 当质子转移到四氮唑盐^2、3时, 就形成了水不溶 formazan。Glucose-6-phosphate 脱氢酶产生的四氮唑和质子, 并已检测到的活动。Glucose-6-phosphate 脱氢酶已监测在欧洲比目鱼肝细胞⁴, 在肺泡型2细胞的肺⁵和肾单位的肾脏⁵。四氮唑盐也被用来监测冷冻组织⁶中的 transketolase 活性。最近还使用类似的方法来监测相邻幻灯片⁷上同一组织中多个脱氢酶的活动。

这里我们描述了一种使用四氮唑盐监测乳酸脱氢酶活性的空间分布的方法 (图 1)。乳酸脱氢酶可将糖酵解生成的丙酮酸转化为乳酸, 并逆转反应。乳酸脱氢酶活性是丙酮酸盐进入 tricarboxylic 酸循环的重要决定因素, 与乳酸的分泌有关。血液中的乳酸水平经常被用来诊断一系列疾病, 包括癌症^8、9、10, 因为它可以表明疾病或伤害已经损坏的细胞和酶已经释放。

乳酸脱氢酶基因有四: LDHA、LDHB、LDHC 和 LDHD¹¹。LDHA 和 LDHB 被认为是来自早期 LDHA 基因¹²的重复。LDH 是活跃的聚丙烯和 LDHA 和 LDHB 可以形成 homotetramers 和 heterotetramers 彼此。据报道, LDHA 对丙酮酸有较高的亲和力, 而 LDHB 对乳酸有较高的亲和力, 并优先将乳酸转化为丙酮酸¹³。LDHA 启动子包含 HIF1α、cMYC 和 FOXM1 转录因子¹¹的绑定站点。此外, 像许多其他酵酶^14,15, LDH 可以修改后, 翻译修改。成纤维细胞生长因子受体1可以 phosphorylate LDHA 在 Y10, 促进聚丙烯形成, 或 Y83, 促进 NADH 基质结合¹⁶。LDHA 也可以乙酰¹⁷。由于这些原因, 对 ldh 活性的完全了解不仅需要监测 ldh 蛋白水平, 还要监控酶的活性。

除了我们在这里提出的方法外, 还使用了其他方法来监测乳酸脱氢酶的活性。乳酸脱氢酶活性可以监测 spectrophotometrically 在匀质蛋白裂解。NADH 乳酸转化为丙酮酸的世代可以根据 340 nm 的吸光度来测定, 而 NADH 的消失可以监测, 因为丙酮酸转化为乳酸¹⁸。乳酸脱氢酶活性也受到磁共振成像 (MRI) 监测。¹³丙酮酸盐可以被管理, 丙酮酸转化为乳酸可以被监测为 [1-¹³c] 乳酸/[1-¹³c] 丙酮酸的比例。1-¹³c] 乳酸/[1-¹³c] 丙酮酸盐的高比在癌症组织¹⁹被观察了。虽然 MRI 的方法可以提供关于正常和疾病组织中乳酸脱氢酶活性的信息, 但方法没有确定特定细胞活动水平所需的分辨率。这里提供的方法可以提供关于在组织区域甚至在单个细胞中乳酸脱氢酶活性的信息。

应用原位活性测定法, 发现在小鼠皮肤毛囊干细胞中乳酸脱氢酶活性高²⁰。我们还利用该方法对培养的胚胎干细胞中乳酸脱氢酶的活性进行了监测, 发现干细胞的活性高于饲养层。最后, 对新鲜小鼠主动脉中乳酸脱氢酶的活性进行了监测, 观察了平滑肌细胞的染色。这里我们描述了一个详细的协议, 以监测冷冻小鼠皮肤乳酸脱氢酶活性。

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研究方案

所描述的所有实验都是由洛杉矶加利福尼亚大学动物保育委员会批准的。

1. 生成冷冻鼠标皮肤的幻灯片

1. 弄死小鼠按照制度政策。
   注意: 遵循保护服装的制度政策。所有涉及动物的议定书都必须得到机构动物保育委员会的批准。
2. 用动物发型剪掉老鼠的头发。
3. 用剪刀在皮肤上做切口。使用镊子, 把皮肤从老鼠身上抬开。用剪刀剪掉皮肤部分。
4. 用冷冻试剂化合物填充 cryomold (见材料表)。
5. 使用针鼻钳将皮肤部分放入填充 cryomolds。东方皮肤, 使组织切片将产生一个横断面的皮肤从表皮到真皮, 皮下组织和肌肉 (图 2)。
   注意: 如果可能的话, 将实验和控制鼠标放在同一 cryomold 中, 这样它们就可以被切片到同一张幻灯片上并一起处理。注意不要制造气泡。
6. 把 cryomold 放在冰桶里一块干冰的平坦表面上, 让它结冰。继续观察皮肤的方向。必要时进行调整。
   注: 处理干冰时应佩戴低温手套。
7. 将 cryomolds 转移到-80 摄氏度冷藏库中存放。样品可以在冷冻库中保存约3月, 而不会造成大量的酶活性损失。不要让冰冻切片干燥。
8. 使用恒温器在-20 °c, 切片组织创建 7-10 µm 厚为最佳皮肤形态学²¹。

2. 准备用于染色的幻灯片

1. 建立要测试的幻灯片集。包括一个控制滑块, 它将被扣留, 另一张控制滑块将被扣留, 乳酸基。包括先前调查过的冰冻组织块中的阳性对照滑动。
2. 在幻灯片上, 或者在处理多张幻灯片时, 通过将幻灯片浸入包含4% 福尔马林的容器中, 将包含4% 福尔马林的皮肤部分的幻灯片简单地固定为5分钟. 吹打1毫升4% 福尔马林。
   注意: 该固定将确保皮肤不会剥离从幻灯片在下列过程中, 保持皮肤形态学。
   注意: 福尔马林是一种致癌物, 具有危险性;戴上手套, 不要让它接触你的皮肤, 并在化学油烟机上执行这一步骤。
3. 用至少1毫升磷酸盐缓冲盐水, pH 值为 7.4, 每张幻灯片用吹打或浸洗的幻灯片。

3. 准备染色液

1. 漩涡联合试剂的乳酸脱氢酶活性染色 (50 毫米三 pH 值 7.4, 750 µM NADP, 80 µM 吩 methosulfate (PMS), 600 µM nitrotetrazolium 蓝氯, 30 毫米乳酸) 在适当大小的管取决于染色量解决方案要求。
   注: 1 毫升足以完全覆盖一张幻灯片。
2. 准备第二个解决方案, 其中所有试剂都存在, 除了 NAD。准备第三个溶液, 除乳酸外, 所有试剂都存在。

4. 在染色液中孵化幻灯片

1. 将染色液或控制溶液轻轻地吸管覆盖整个切片的准备好的幻灯片上 (1 毫升足以用于一张幻灯片)。如果将多个幻灯片一起处理, 请同时将所有幻灯片浸入染色液中 (确保容器有足够的解决方案来完全覆盖组织部分)。
2. 在一个湿润的环境中孵化的幻灯片在37摄氏度在黑暗中。如果染色液位于幻灯片的顶端, 请将幻灯片放在加湿的环境中以防止蒸发。

5. 监控幻灯片

1. 通过目视检查, 监测染色液从透明到蓝色的转换。当样品达到所需的蓝色水平时, 通过去除染色溶液来停止反应。
   注意: 对于皮肤, 10 分钟是足够的。时间将取决于器官和酶的活动。
2. 用磷酸盐缓冲盐水冲洗吹打 (每张幻灯片都足够1毫升) 或浸泡。
   注: 任何将被比较的样品必须在染色溶液中保持相同的时间。

6. Counterstain 和芒特

1. 当幻灯片达到适当的蓝色水平时, 吸管 counterstain 到幻灯片上。
   注: Counterstains, 使核红色或绿色将提供良好的对比, 蓝色创建的 formazan 沉淀。
2. 安装有水或非水安装介质²²。一个到三滴 (40-50 µL) 的安装介质是足够的, 取决于大小的封面滑动。

7. 图像幻灯片和量化

1. 在光显微镜下的图像幻灯片。在10X、20X 和40X 放大倍数上拍摄实验和控制样本以及所有负控制的照片。
2. 用图像分析软件确定不同区域的蓝斑强度。

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结果

我们以前报告的结果,在现场活性测定在老鼠皮肤²⁰。如图 3所示, 我们观察到当上述程序被遵循时, 在毛囊底部毛囊干细胞中乳酸脱氢酶活性较高。这些发现通过荧光活化细胞分选皮肤的毛囊干细胞和确认高乳酸脱氢酶活性的干细胞室与活性检测的排序细胞。

根据我们的发现, 毛囊...

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讨论

这里描述的方法可以用来监测乳酸脱氢酶或其他代谢酶的活性, 产生 NADH 或, 在不同的细胞类型组织内或组织内的不同部分, 随着时间的推移。乳酸脱氢酶是了解干细胞和肿瘤生物学的重要酶, 在单个细胞内监测乳酸脱氢酶活性的能力很可能对这种酶的功能有重要的洞察力。

与其他方法相比, 本议定书的一个重要优点是, 监测酶活性的能力, 而不仅仅是蛋白质丰度, 可以导致更确?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical instruments			For collecting skin from euthanized mice
Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm	Fisher Scientific	NC9511236	For freezing mouse skin
Tissue-Tek O.C.T. compound	Fisher Scientific	NC9638938	For mounting cryomolds
Ice bucket	Fisher Scientific	07-210-106
Dry Ice
Polysine Adhesion Slide	Fisher Scientific	12-545-78
4% formalin	Fisher Scientific	23-245-684	Dilluted in water
phosphate buffered saline, pH 7.4
vortex
Tris base	Fisher Scientific	23-245-684
NAD	Sigma-Aldrich	N7004
Phenazine methosulfate	Sigma-Aldrich	P9625
Nitrotetrazolium blue chloride	Sigma-Aldrich	N6876
Lithium L-lactate	Sigma-Aldrich	L2250	Substrate
37°C incubator (or tissue culture incubator)
Braziliant! Counter stain	Anatech	861	Counter stain
Mounting medium	Vector Laboratories	H-5000
Cover slips for slides	Fisher Scientific	12-544D
Light microscope