Métabolisme de cartographie : Surveiller l’activité de la Lactate déshydrogénase directement dans le tissu

Résumé

Les auteurs décrivent un protocole pour cartographier la distribution spatiale de l’activité enzymatique d’une enzyme qui génèrent nicotinatmide adénine dinucléotide phosphate (NAD(P)H) + H + directement dans les échantillons de tissus.

Résumé

Cartographie de l’activité enzymatique dans le temps et l’espace est essentiel pour comprendre les bases moléculaires du comportement de cellules dans les tissus normaux et la maladie. Essais in situ de l’activité métabolique peuvent fournir des informations sur la distribution spatiale de l’activité métabolique dans un mouchoir en papier. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour surveiller l’activité de l’enzyme lactate déshydrogénase directement dans les échantillons de tissus. Déshydrogénase de lactate est un déterminant important de la question de savoir si glucose consommé sera converti en énergie par la glycolyse aérobie ou anaérobie. Une solution contenant du lactate et NAD est fournie pour une section de tissus congelés. Cellules avec haute lactate déshydrogénases convertira le lactate fourni en pyruvate, tandis que simultanément conversion fourni nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) à NADH et un proton, qui peut être détecté, basée sur la réduction des nitrotetrazolium bleu en formazan, qui est visualisé comme un précipité bleu. Les auteurs décrivent un protocole détaillé pour surveiller l’activité de la lactate déshydrogénase dans la peau de souris. Application de ce protocole, nous avons constaté que l’activité de la lactate déshydrogénase est riche en cellules souches quiescentes follicule pileux dans la peau. Elle applique le protocole aux cellules souches embryonnaires de souris cultivées ont révélé une coloration plus élevée dans les cellules souches embryonnaires cultivées que les fibroblastes embryonnaires de souris. Analyse d’aorte fraîchement isolés de souris a révélé une coloration dans les cellules musculaires lisses perpendiculaire à l’aorte. La méthodologie fournie peut être utilisée pour mapper spatialement l’activité des enzymes qui génèrent un proton dans le tissu congelé ou fraîche.

Introduction

Comprendre les emplacements au sein des tissus dans lesquels enzymes ont une activité élevée ou faible est indispensable pour la physiologie et le développement de la compréhension. Niveaux de transcription ou de la protéine sont souvent utilisés comme substituts à l’activité enzymatique. Alors que ces études peuvent être informatifs, ils ne fournissent pas d’informations qui peuvent être essentielles pour la détermination de l’activité de l’enzyme, comme les modifications post-traductionnelles, la présence de complexes protéiques, ou la localisation subcellulaire de l’enzyme. Lorsque l’activité enzymatique est mesurée directement, il est souvent contrôlé dans les lysats de protéines homogénéisé qui n’est plus contiennent des informations sur des cellules individuelles dans le mélange ou la distribution spatiale des cellules ayant une activité au sein d’un tissu haute ou basse.

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour cartographier la distribution spatiale de l’activité enzymatique dans un échantillon de tissu. La méthodologie est basée sur des études antérieures montrant que les sels de tétrazolium peuvent être utilisés pour localiser l’activité des déshydrogénases, réductases et oxydases en tissus congelés¹. Avec ces méthodes, un formazan insolubles dans l’eau se forme lorsque les protons sont transférés à un tétrazolium sel^2,3. Glucose-6-phosphate déshydrogénase génère NADPH et un proton et a été détecté avec activité de tétrazolium. Glucose-6-phosphate déshydrogénase a été contrôlé dans les hépatocytes flet européen⁴, dans les poumons de⁵ des cellules alvéolaires de type 2 et les néphrons du rein⁵. Sels de tétrazolium ont également été utilisés pour surveiller l’activité de la transcétolase en tissus congelés⁶. Une approche similaire a été récemment utilisée pour surveiller l’activité des déshydrogénases multiples dans le même tissu sur diapositives adjacentes⁷.

Nous décrivons ici une méthode pour utiliser les sels de tétrazolium pour surveiller la distribution spatiale de l’activité de la lactate déshydrogénase (Figure 1). Lactate déshydrogénase peut convertir pyruvate généré par la glycolyse de lactate et la réaction inverse. Activité de la lactate déshydrogénase est par conséquent un facteur déterminant de l’entrée du pyruvate dans le cycle des acides tricarboxyliques contre sa sécrétion comme le lactate. Les taux de lactate dans le sang sont souvent utilisés pour diagnostiquer un éventail de maladies, y compris le cancer^8,9,10, car il peut indiquer que la maladie ou blessure a des cellules endommagées et l’enzyme a été libéré.

Il existe quatre gènes de lactate déshydrogénase : LDHA, LDHB, LDHC et LDHD¹¹. LDHA et LDHB seraient apparus de duplication d’un début de gène LDHA¹². LDH est active comme un tétramère et LDHA et LDHB peuvent former des HOMOTETRAMERES et heterotetramers entre eux. LDHA est rapporté avoir une affinité plus élevée pour le pyruvate, tandis que LDHB est rapporté pour avoir une affinité plus élevée pour le lactate et préférentiellement convertir lactate et pyruvate¹³. Le promoteur LDHA contient des sites de liaison pour la transcription facteurs HIF1α, cMYC et FOXM1¹¹. En outre, comme de nombreuses autres enzymes glycolytiques^14,15, LDH peut être modifié par des modifications post-traductionnelles. Récepteur de facteur de croissance fibroblastique 1 peut phosphoryler LDHA à Y10, qui favorise la formation de tétramère, ou Y83, qui favorise la NADH substrat liaison¹⁶. LDHA peut également être acétylées¹⁷. Pour ces raisons, une compréhension complète de l’activité LDH exige une surveillance non seulement le taux de protéines LDH, mais aussi bien l’activité de l’enzyme.

Outre la méthode que nous présentons ici, les autres approches ont été utilisées pour surveiller l’activité de la lactate déshydrogénase. Activité de la lactate déshydrogénase peut être surveillée par spectrophotométrie en protéines homogénéisé lysat. La génération du NADH lactate est convertie en pyruvate peut être mesurée selon l’absorbance à 340 nm, tandis que la disparition du NADH peut être surveillée comme le pyruvate est converti en lactate¹⁸. Activité de la lactate déshydrogénase a également été suivie avec l’imagerie par résonance magnétique (IRM). ¹³ C-pyruvate peut être administré et la conversion du pyruvate de lactate peut être surveillée comme le ratio de [1 -¹³C] lactate / [1 -¹³C] pyruvate. Élevé des ratios de [1 -¹³C] lactate / [1 -¹³C] pyruvate ont été observés dans le cancer des tissus¹⁹. Alors que les approches axées sur le MRI peuvent fournir des informations sur l’activité de la lactate déshydrogénase dans des conditions normales et les tissus de la maladie, les méthodes n’ont pas la résolution nécessaire pour déterminer le niveau d’activité dans certaines cellules. La méthodologie proposée ici peut fournir des informations sur l’activité de la lactate déshydrogénase dans les zones de tissus et même dans des cellules individuelles.

À l’aide de tests d’activité sur place , nous avons constaté que l’activité de la lactate déshydrogénase est élevée dans les cellules souches de souris peau²⁰le follicule pileux. Nous avons également utilisé la méthode pour surveiller l’activité de la lactate déshydrogénase dans les cellules souches embryonnaires cultivées et trouvé que l’activité est plus élevée dans les cellules souches que la couche de conducteur. Enfin, surveiller l’activité de la lactate déshydrogénase dans les aortes de souris fraîche et observé une coloration dans les cellules musculaires lisses. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour surveiller l’activité de la lactate déshydrogénase dans la peau de souris congelées.

Protocole

Toutes les expériences décrites ont été approuvées par le Comité de protection de l’Animal à l’Université de Californie à Los Angeles.

1. générer des diapositives de peau de souris congelées

1. Euthanasier souris conformément à la politique de l’institution.
   Remarque : Suivez la politique institutionnelle pour vêtements de protection. Tous les protocoles impliquant des animaux doivent être approuvés par le Comité institutionnel de protection Animal.
2. Enlever les poils de la souris avec une tondeuse de poils.
3. Faire des incisions dans la peau à l’aide de ciseaux. À l’aide de pince, soulever la peau de la souris. À l’aide de ciseaux, coupez la section de la peau.
4. Remplir le cryomold avec gel réactif composé (voir Table des matières).
5. Place les sections de peau en cryomolds rempli à l’aide de pinces à bec. Orienter la peau des tranches de tissu vont générer une coupe transversale de la peau de l’épiderme au derme, hypoderme et musculaire (Figure 2).
   Remarque : si possible, montage expérimental et contrôle de la souris ensemble dans la même cryomold afin qu’ils puissent être sectionnés sur la même lame et traitées ensemble. Prendre soin de ne pas pour créer de bulles.
6. Placer des cryomold sur la surface plane d’un bloc de glace carbonique dans un bac à glaçons et laisser geler. Continuer à observer l’orientation de la peau. Ajuster si nécessaire.
   Remarque : Porter des gants cryogéniques lors de la manipulation de glace sèche.
7. Transfert cryomolds dans un congélateur-80 ° C pour le stockage. Les échantillons peuvent être maintenues dans le congélateur pendant environ 3 mois, sans perte significative de l’activité enzymatique. Ne laissez pas les coupes congelées de sécher.
8. À l’aide d’un cryostat à-20 ° C, tranche de tissu pour créer des sections 7-10 µm d’épaisseur pour la meilleure peau morphologie²¹.

2. préparation des diapositives pour la coloration

1. Mettre en place l’ensemble des diapositives à tester. Inclure une diapositive de contrôle sur lesquels NAD sera retenu et contrôle une autre diapositive sur laquelle le substrat, le lactate, seront retenus. Comprend une lame de contrôle positif d’un bloc de tissus congelés précédemment étudié.
2. Brièvement Difficulté diapositives contenant des sections de la peau avec 4 % de formol pendant 5 min par pipetage 1 mL de 4 % de formol dans la diapositive, ou lors du traitement de plusieurs diapositives, en trempant les diapositives dans un récipient contenant 4 % de formol.
   Remarque : La fixation assurera que la peau ne pas décoller de la glisse pendant les suivantes procédures et préserver la morphologie de la peau.
   ATTENTION : Formol est un agent cancérigène et dangereux ; porter des gants, ne le laissez pas toucher votre peau et effectuez cette étape sous une hotte chimique.
3. Lavez-les diapositives au moins 1 phosphate mL tampon saline, pH 7,4, par glissière soit par la pipette ou trempage.

3. préparer la Solution de coloration

1. Réactifs ensemble vortex pour l’activité de la lactate déshydrogénase coloration (50 mM Tris pH 7,4, 750 µM NADP, 80 µM phénazine méthosulfate (PMS), chlorure de nitrotetrazolium bleu 600 µM et 30 mM de lactate) dans un tube de taille appropriée selon la quantité de coloration solution nécessaire.
   Note : 1 mL est suffisante pour recouvrir entièrement une diapositive.
2. Préparer une deuxième solution où tous les réactifs sont présents sauf NAD. Préparer une solution de troisième dans lequel tous les réactifs sont présents sauf lactate.

4. Incuber les lames dans la Solution de coloration

1. Pipette de doucement la solution colorante ou des solutions de contrôle sur les lames préparées couvrant l’article dans son intégralité (1 mL est suffisant pour une diapositive). Si plusieurs diapositives sont traités ensemble, tremper toutes les diapositives dans la solution colorante en même temps (Assurez-vous que le conteneur a suffisamment de solution pour recouvrir entièrement la section de tissu).
2. Incuber les lames dans un environnement humidifié à 37 ° C dans l’obscurité. Si la solution de coloration est sur le dessus de la lame, placez la dans un environnement humidifié pour éviter l’évaporation.

5. surveiller les diapositives

1. Surveiller la conversion de la solution colorante du clair au bleu par inspection visuelle. Lorsque les échantillons ont atteint le niveau souhaité de bleu, arrêter la réaction en enlevant la solution colorante.
   Remarque : Pour les peaux, 10 min est suffisant. Le temps dépendra de l’orgue et l’activité enzymatique.
2. Rincer les lames avec une solution saline tamponnée au phosphate de pipetage (1 mL est suffisant pour chaque diapositive) ou trempage.
   Remarque : Tous les échantillons qui seront comparés les uns aux autres doivent être maintenues dans la solution colorante pour le même laps de temps.

6. contre-coloration et monter

1. Pipette contre-colorant sur les diapositives lorsque les diapositives ont atteint un niveau approprié de bleu.
   Remarque : Les colorants qui transforment les noyaux rouges ou verts fournira bon contraste avec le bleu, créé par le formazan precipitant.
2. Monter avec des solutions aqueuses ou montage moyenne²²non aqueux. Il suffit d’une à trois baisses (40-50 µL) du milieu de montage selon la taille de la lamelle couvre-objet.

7. l’image diapositives et quantifier

1. Image glisse sous un microscope optique. Prendre des photographies d’expérimentales et des échantillons de contrôle et tous les contrôles négatifs à 10 X, 20 X et 40 X grossissement.
2. Déterminer l’intensité des taches bleues dans différentes régions avec analyse d’images.

Résultats

Nous avons déjà rapporté les résultats des tests d’activité sur place dans la peau de souris²⁰. Comme illustré à la Figure 3, nous avons observé des niveaux élevés d’activité de la lactate déshydrogénase dans les cellules souches du follicule pileux à la base du follicule pileux lorsque les procédures décrites ci-dessus ont été suivies. Ces conclusions ont été corroborées par cellule à fluorescence ac...

Discussion

La méthode décrite ici peut être utilisée pour surveiller l’activité de la lactate déshydrogénase ou d’autres enzymes métaboliques qui génèrent le NADH ou le NADPH, dans différents types de cellules dans un tissu ou dans les différentes parties d’un tissu au fil du temps. Lactate déshydrogénase est une enzyme importante pour comprendre la biologie des cellules souches et de tumeurs, et la possibilité de surveiller l’activité de la lactate déshydrogénase dans des cellules individuelles est suscep...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical instruments			For collecting skin from euthanized mice
Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm	Fisher Scientific	NC9511236	For freezing mouse skin
Tissue-Tek O.C.T. compound	Fisher Scientific	NC9638938	For mounting cryomolds
Ice bucket	Fisher Scientific	07-210-106
Dry Ice
Polysine Adhesion Slide	Fisher Scientific	12-545-78
4% formalin	Fisher Scientific	23-245-684	Dilluted in water
phosphate buffered saline, pH 7.4
vortex
Tris base	Fisher Scientific	23-245-684
NAD	Sigma-Aldrich	N7004
Phenazine methosulfate	Sigma-Aldrich	P9625
Nitrotetrazolium blue chloride	Sigma-Aldrich	N6876
Lithium L-lactate	Sigma-Aldrich	L2250	Substrate
37°C incubator (or tissue culture incubator)
Braziliant! Counter stain	Anatech	861	Counter stain
Mounting medium	Vector Laboratories	H-5000
Cover slips for slides	Fisher Scientific	12-544D
Light microscope