Saccharomyces cerevisiae حركية النمو الهائل في الثقافة دفعة تحليل الأيض معفن والجهاز التنفسي

Summary

نقدم هنا بروتوكولا لتقدير الأيض معفن والجهاز التنفسي باحتواء النمو الأسى ل Saccharomyces cerevisiae لمعادلة النمو المتسارع. يسمح حساب المعلمات الحركية لفحص تأثيرات المواد/المركبات على التخمر أو التنفس المتقدرية.

Abstract

الخلايا saccharomyces cerevisiae في المرحلة الأسية مواصلة نموها بإنتاج ATP عن طريق التخمير و/أو التنفس المتقدرية. أن تركيز الكربون تخمر أساسا يحكم كيفية توليد خلايا الخميرة ATP؛ وهكذا، يدفع التباين في مستويات تخمر الكربوهيدرات الأيض نشطة من S. cerevisiae. وتصف هذه الورقة أسلوب الفائق يقوم على نمو الخميرة الأسية لتقدير الآثار المترتبة على التغييرات تركيز وطبيعة مصدر الكربون في الأيض معفن والجهاز التنفسي. نمو S. cerevisiae يقاس صفيحة أو اهتزت المخروطية قارورة بواسطة تحديد الكثافة البصرية (OD) 600 نانومتر. ثم، هو بناها منحنى نمو OD رسم مقابل الوقت، مما يسمح بتحديد واختيار المرحلة الأسية، ومزودة بمعادلة النمو الأسى للحصول على معلمات الحركية. عموما تمثل معدلات نمو منخفضة محددة بإضعاف مضاعفة أعلى نمو الجهاز تنفسي. على العكس من ذلك، تشير معدلات نمو محددة مع انخفاض مرات مضاعفة النمو معفن. تقدر قيم العتبة لمضاعفة الوقت ومعدل نمو محددة باستخدام شروط الجهاز التنفسي أو معفن المعروفة جيدا، مثل مصادر الكربون غير تخمر أو تركيزات أعلى من تخمر السكريات. يتم الحصول على هذه لكل سلالة معينة. أخيرا، تتم مقارنة المعلمات الحركية المحسوبة بقيم العتبة تحديد ما إذا كانت الخميرة يظهر النمو معفن و/أو الجهاز التنفسي. وميزة هذا الأسلوب هو بساطتها النسبية لفهم آثار مادة/مجمع على الأيض معفن أو الجهاز التنفسي. من المهم تسليط الضوء على أن النمو عملية بيولوجية معقدة ومعقدة؛ ولذلك، البيانات الأولية من هذا الأسلوب يجب أن تؤكده التحديد الكمي لاستهلاك الأوكسجين وتراكم مشتقات التخمير. وبالتالي، يمكن استخدام هذا الأسلوب كفرز أولى للمركبات/المواد التي قد تخل أو تعزيز الأيض معفن أو الجهاز التنفسي.

Introduction

النمو saccharomyces cerevisiae بمثابة أداة قيمة تحديد عشرات الآليات الفيزيولوجية والجزيئية. ويقاس النمو أساسا بثلاث طرق: تخفيف المسلسل لاختبار البقعة، ووحدة تشكيل مستعمرة العد، ومنحنيات النمو. يمكن استخدام هذه التقنيات وحدها أو في تركيبة مع مجموعة متنوعة من ركائز والظروف البيئية، وطفرات والمواد الكيميائية للتحقيق في استجابات محددة أو تعمل.

التنفس المتقدرية هو عملية بيولوجية فيها حركية النمو وقد طبقت بنجاح لاكتشاف آليات غير معروفة. وفي هذه الحالة، مصادر مكملات وسائط النمو مع الكربون غير تخمر مثل الجلسرين أو لاكتات الإيثانول (التي يستقلبان حصرا بالتنفس المتقدرية)، كما يسمح للكربون والطاقة هو المصدر الوحيد لتقييم نمو الجهاز التنفسي، هو أمر مهم للكشف عن اضطرابات في الفسفرة النشاط¹. من ناحية أخرى، أنها معقدة استخدام نماذج النمو الحركية كطريقة لفك رموز الآليات وراء التخمير.

دراسة التخمر والتنفس المتقدرية ضروري لتوضيح الآليات الجزيئية وراء بعض تعمل مثل كرابتري وواربورغ^2،الآثار³. أثر كرابتري يتسم بزيادة قدرها glycolytic التمويه، القمع للتنفس المتقدرية، وإنشاء للتخمير كالمسار الأساسي لتوليد ATP وجود تركيزات عالية من الكربوهيدرات تخمر (> ^4،0.8 ملم)⁵. أثر واربورغ أيضي تمثيلي لأثر كرابتري، مع الفرق أن في خلايا الثدييات، هو المنتج الرئيسي للتخمير لاكتات⁶. وفي الواقع، معروض أثر واربورغ بمجموعة متنوعة من الخلايا السرطانية، تسبب امتصاص الجلوكوز والاستهلاك حتى في وجود الأكسجين⁷. وبالتالي، دراسة الأساس الجزيئي للتبديل من التنفس للتخمير في أثر كرابتري قد آثار التكنولوجيا الحيوية (لإنتاج الإيثانول) والآثار المحتملة في أبحاث السرطان.

قد يكون النمو S. cerevisiae أداة مناسبة لدراسة آثار كرابتري وواربورغ. هذه الفكرة تستند إلى حقيقة أن مرحلة الأسى الخميرة، هي مسارات المركزية المستخدمة لإنتاج ATP التنفس المتقدرية والتخمير، وضرورية للحفاظ على النمو. على سبيل المثال، نمو S. cerevisiae اتصالاً وثيقا بوظيفة سبل توليد ATP. في S. cerevisiae، ATP تنتج قرابة 18 التنفس المتقدرية جزيئات كل جزيء الجلوكوز، بينما يولد التخمير فقط 2 جزيئات ATP، ومن ثم يتوقع أن معدل النمو قد ضيق الروابط مع المسارات الأيضية إنتاج ATP⁸. وفي هذا الصدد، عند التخمير هو الطريق الرئيسي لتوليد ATP، يعوض الخميرة لإنتاج ATP منخفضة عن طريق زيادة معدل امتصاص الجلوكوز. على العكس من ذلك، منخفض استهلاك الجلوكوز خلايا الخميرة التي تستخدم التنفس المتقدرية ATP المصدر الرئيسي. يشير هذا إلى أن من المهم للخميرة إلى توافر الكربوهيدرات الشعور قبل تحديد كيف سيتم إنشاء ATP. ولذلك، توافر الجلوكوز دوراً هاما في التبديل بين التخمير والتنفس المتقدرية في cerevisiae س. وجود كميات كبيرة من السكر، يفضل الخميرة التخمير كالتوجيه المركزي لتوليد ATP. من المثير للاهتمام، عندما يتم تخمر الخميرة، هو الحفاظ على معدل نمو محددة إلى الحد الأقصى. من ناحية أخرى، ضمن مستويات منخفضة من الجلوكوز ينتج S. cerevisiae ATP باستخدام التنفس المتقدرية، الحفاظ على انخفاض معدلات النمو. وبالتالي، التباين في التركيز الجلوكوز واستخدام مصادر الكربون الأخرى تحدث تغييرات في تفضيل للخميرة بين النمو معفن والجهاز التنفسي. تأخذ في الاعتبار هذه الحقيقة مع معادلة النمو الأسى، يمكنك الحصول على معنى البيولوجية لمعلمات الحركية مثل مضاعفة الوقت (Dt) ومعدل النمو المحددة (μ). على سبيل المثال، تم العثور على قيم μ أقل عندما يستخدم الخميرة التنفس المتقدرية كالمسار الأساسي. على العكس من ذلك، عثر على ظروف لصالح التخمير، قيم μ أعلى. يمكن استخدام هذه المنهجية لقياس الآليات المحتملة لأي من المواد الكيميائية التي تؤثر على التخمر والتنفس المتقدرية في cerevisiae س.

والهدف من هذه الورقة أن يقترح أسلوب يقوم على حركية النمو لفحص آثار مادة/مركب معين على التنفس المتقدرية أو التخمير.

Protocol

1-وسائل الإعلام الثقافة وإعداد العدوى

1. تحضير 100 مل من استخراج-ببتون-سكر العنب (YPD) الخميرة 2% المتوسطة السائل (إضافة 1 غ خميرة استخراج، ز 2 من ببتون الكازين، و 2 غ السكر إلى 100 مل من الماء المقطر). الاستغناء عن 3 مل من وسائط الإعلام إلى 15 مل أنابيب مخروطية تعقيمها. اﻷوتوكﻻف وسائط الإعلام لمدة 15 دقيقة في 121 درجة مئوية و 1.5 رطل/بوصة مربعة.
   ملاحظة: يمكن تخزين وسائط الإعلام لمدة تصل إلى شهر واحد في 4 – 8 درجة مئوية.
2. تطعيم أنبوب مخروطي مليئة 3 مل من بارد مرق YPD 2% العقيمة مع 250 ميكروليتر من الخلايا S. cerevisiae الاحتفاظ في الجلسرين في-20 درجة مئوية. تبني بين عشية وضحاها في شاكر مداري عند 30 درجة مئوية مع الانفعالات 200 لفة في الدقيقة.
3. الانتصارات طبق بتري (60 × 15 مم²) مليئة معقم أجار YPD 2% (إضافة 10 جرام خميرة استخراج، 20 غراما ببتون الكازين، 20 غراما السكر، و 20 غراما أجار البكتريولوجية إلى 1,000 مل من الماء المقطر) مع الخلايا نمت في أنبوب مخروطي باستخدام حلقة عقيمة. احتضان طبق بيتري في 30 درجة مئوية حتى تظهر المستعمرات المعزولة النمو.
4. تعد العدوى قبل حلول تطعيم مستعمرة معزولة وحيدة في أنبوب مخروطي مليئة 10 مل من بارد مرق YPD 2% العقيمة واحتضان ذلك بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع التحريك المستمر 200 لفة في الدقيقة.

2-وسائل الإعلام الثقافة ومنحنيات النمو في ميكروسكوبية

1. إعداد 10 مل مرق YPD 1% (إضافة استخراج 0.1 غرام خميرة، 0.2 جم ببتون، و 0.1 غرام السكر إلى 10 مل من الماء المقطر)، 10 مل مرق YPD 2% (إضافة استخراج 0.1 غرام خميرة، 0.2 جم ببتون، و 0.2 جم جلوكوز إلى 10 مل من الماء المقطر) ، و 10 مل مرق YPD 10% (إضافة استخراج 0.1 غرام خميرة، 0.2 جم ببتون، و 1 غرام السكر إلى 10 مل من الماء المقطر). اﻷوتوكﻻف هذه الوسائط النمو لمدة 15 دقيقة في 121 درجة مئوية و 1.5 رطل/بوصة مربعة.
   ملاحظة: وسائط الإعلام الثقافة بمثابة عنصر تحكم النمو معفن.
2. إعداد 10 مل مرق ([يب]) استخراج-ببتون-الإيثانول الخميرة 2% و 10 مل من مرق (يبج) استخراج-ببتون-والغليسيرول الخميرة 2%. 2% [يب]: إضافة استخراج 0.1 غرام خميرة، 0.2 جم ببتون، و 0.2 مل إيثانول إلى 10 مل من الماء المقطر. % 2 يبج: إضافة استخراج 0.1 غرام خميرة، 0.2 جم ببتون، و 0.2 مل الجلسرين إلى 10 مل من الماء المقطر. اﻷوتوكﻻف هذه الوسائط النمو لمدة 15 دقيقة في 121 درجة مئوية و 1.5 رطل/بوصة مربعة.
   ملاحظة: يتم والغليسيرول والايثانول مصادر الكربون غير تخمر يستقلبان حصرا بالتنفس المتقدرية. لهذا السبب، فإنها تستخدم كعناصر نمو الجهاز تنفسي. في هذه الخطوة، قد يتغير نوع وتركيز الكربون المصدر في وسائط الثقافة لاختبار تأثيرات على نمو النمط الظاهري باستخدام الخميرة استخراج-ببتون (يب) مرق (10 جرام من الخميرة استخراج و 20 غراما من ببتون الكازين في 1,000 مل ماء المقطر) كقاعدة. ويكمل الاصطناعية المتوسطة (SC) كاملة لاختبار آثار المواد المغذية الأخرى إلى جانب الكربون، وفقا للهدف من هذه التجربة. القاعدة لاتفاقية استكهولم متوسطة 1.8 غرام من الخميرة النيتروجين قاعدة دون الأحماض الأمينية، 5 غ كبريتات الأمونيوم [(NH₄)₂هكذا₄], 1.4 غرام فوسفات أحادية الصوديوم (نة₂ص₄)، ومزيج ز 2 من التسرب في 1,000 مل ماء المقطر. تكملة وسائط الإعلام مع مصدر الكربون ومصدر النيتروجين إضافية في التركيزات المطلوبة.
3. إضافة ميكروليتر 145 من وسائط الثقافة مناسبة للتصميم التجريبي لكل بئر من الميكروسكوبية العقيمة (10 × 10-جيد) مع غطاء وتطعيم لهم مع 5 ميكروليتر من العدوى قبل.
   ملاحظة: إذا كان الهدف هو الشاشة تأثير المواد/المركبات على عملية الأيض نشطة من الخميرة، ينبغي إضافة المادة/المجمع السكني أثناء هذه الخطوة. أيضا، ينبغي أن يكون أي نوع من صفيحة مع غطاء مفيدة.
4. احتضان لوحة متعددة جيدا في قارئ ميكروسكوبية في 30 درجة مئوية مع إثارة مستمرة 200 لفة في الدقيقة ل h. 48 قياس الكثافة البصرية (OD) 600 نانومتر كل 30 أو 60 دقيقة.
   ملاحظة: إذا لم يكن لدى القارئ الميكروسكوبية الخيار لاحتضانها الصفيحة، قد المحتضنة في شاكر مدارية في نفس الظروف بين كل قياس التطوير التنظيمي.

3-نمو منحنيات في قوارير المخروطية اهتزت

1. إضافة مل 4.8 من وسائل الإعلام ثقافة مناسبة لقوارير مخروطية 20 مل والاوتوكلاف. تطعيم كل قارورة مع 200 ميكروليتر ثقافة العدوى قبل في OD_600nm ~ 2 في مرق YPD 2% بارد، وعقيمة. احتضان لهم عند 30 درجة مئوية مع إثارة مستمرة 250 لفة في الدقيقة ح 24.
   ملاحظة: إذا كانت فترة الحضانة أعلى من ح 24، إضافة 12 مل وسائط الثقافة مناسبة إلى 50 مل قوارير المخروطية والاوتوكلاف. تطعيم لهم مع 500 ميكروليتر من العدوى قبل. من المهم أيضا النظر في عناصر النمو معفن (يب وسائل الإعلام مع الجلوكوز 1%، 2%، أو 10%) وعناصر نمو الجهاز التنفسي (يب وسائل الإعلام مع والغليسيرول 2% أو الإيثانول).
2. تأخذ 100 ميكروليتر من ثقافة هز قارورة مخروطية وتمييع في ميكروليتر 900 من الماء المقطر في ومبومو جهاز المطياف الضوئي 1 مل المزيج بلطف بيبيتينج. قياس OD 600 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي كل ح 2. للحصول على التوجيه التشغيلي الحقيقي، اضرب النتيجة عشرة.

4-تجهيز البيانات وحساب معلمات الحركية

1. قم بإنشاء ملف مشروع جديد في برنامج الحزمة الإحصائية. في المقطع "جديد من الجدولوالرسم البياني"، اختر الخيار "س" .
   1. حدد الخيار: "تبدأ باستخدام جدول بيانات فارغ" في المقطع "نموذج البيانات" .
   2. حدد نوع الرسم البياني "النقاط وخط الربط" . اترك المقطع "X" غير محددة في هذا الجزء من "سوبكولومنس replicates أو القيم الخطأ"، وفي "Y" المقطع اختر الخيار: "قم بإدخال قيم تكرار (10) في سوبكولومنس جنبا إلى جنب وارسم يعني و SD خطأ". انقر فوق الزر إنشاء.
      ملاحظة: تنسيق الجدول على عمود X واحد والعديد من أعمدة Y، كل منها سوبكولومنس 10 المختار سابقا.
2. كتابة الوقت في التطوير التنظيمي الذي أخذ القياسات في العمود العاشر (مثلاً 0، 30، 60، 90 دقيقة أو 0، 1، 1-5، ح 2). في الأعمدة Y، كتابة OD القيم التي تم الحصول عليها من الثقافات.
3. تحديد مرحلة النمو الأسى تحويل بيانات العمود Y إلى اللوغاريتمات. انقر فوق الزر "تحليل" ، اختر "تحويل" التحليل، حدد قيم Y باستخدام Y = Log(Y). انتقل إلى "معرض للنتائج"، حدد جدول البيانات "تحويل" ، انقر فوق الزر "تحليل" ، واختر تحليل ": انحدار خطي" . استبعاد القيم OD التي لا تتبع خطي وسلوك. لاستبعاد القيم، قم بتحديدها في جدول البيانات، ثم اكتب "Ctrl + E".
   ملاحظة: من المهم استبعاد القيم التي لا تتبع المرحلة الأسية منذ معادلة النمو الأسى تناسبها تماما مع المرحلة الأسية.
4. في "معرض جداول البيانات"، حدد جدول البيانات "بيانات 1". انقر فوق الزر "تحليل" واختر تحليل "الانحدار غير الخطية (تناسب منحنى)" بين "التحليلات XY".
5. حدد مجموعات البيانات تحليلها وانقر فوق الزر "موافق" . في علامة التبويب "احتواء" اختر القسم "المعادلة الأسية" وحدد "معادلة النمو الأسى" (حيث X تركيز الخلية، X₀ تركيز خلية صفر الوقت، μ معدل نمو محددة، وهو t الوقت). استخدام "صالح لمجموع المربعات" كوسيلة ملائمة وترك غير محدد المقطع إينتيربولاتي. انقر فوق الزر "موافق" .
   ملاحظة: علامة التبويب مع نتائج تناسب غير الخطية في "معرض للنتائج". البرنامج يحسب مضاعفة الوقت (Dt) والخاصة بمعدل النمو (μ). ويبين البرنامج μ كفى علامة التبويب نتائج.
6. افتح ملف مشروع جديد، وفي المقطع "جديد من الجدول والرسم البياني" ، حدد الخيار العمود. اختر الخيار "بدء باستخدام جدول بيانات فارغ" ، وحدد الرسم البياني المطلوب. اختر الرسم في الوسط مع التنمية المستدامة. اختر الزر "إنشاء" .
7. نسخ قيم Dt أو μ من علامة التبويب نتائج تناسب غير الخطية التي في "معرض للنتائج" ولصقها في عمود. وأخيراً، حدد الزر "تحليل" واختيار التحليل المطلوب في المقطع "تحليلات العمود" لمقارنة المعلمات الحركية لمختلف الظروف نوتريمينتال.
   ملاحظة: معلمات الحركية التي تم الحصول عليها من عناصر النمو معفن (يب وسائل الإعلام مع الجلوكوز 1%، 2%، أو 10%)، وعناصر نمو الجهاز التنفسي (يب وسائل الإعلام مع والغليسيرول 2% أو الإيثانول) يساعد على وضع عتبة التنفس معفن والميتوكوندريا، على التوالي. مقارنة الحركية المعلمات من الحالة التغذوية والجوهر/مجمع جزيئي مع نمو الجهاز التنفسي ومعفن يساعد على تحديد الأثر الممكن على الأيض الجهاز التنفسي أو معفن.

النتائج

يمكن استخدام منحنيات النمو للتمييز مبدئياً بين تعمل معفن والجهاز التنفسي في الخميرة S. cerevisiae . ولذلك، أجرينا الثقافات دفعة من س. سيريفيسيا (BY4742) بتركيزات مختلفة الجلوكوز التي أبلغ عنها لحفز النمو معفن: 1% و 2% و 10% (w/v)⁹. الثقافات التي تظهر النمط الظاهري م...

Discussion

لقد مر وقت طويل J. مونو¹⁰ وأعرب عن أن دراسة نمو الثقافات البكتيرية هي الطريقة الأساسية لعلم الأحياء المجهرية. تأخير ظهور الأدوات الجزيئية في الاستخدام ودراسة النمو كأسلوب. وعلى الرغم من الطابع المعقد للنمو الذي ينطوي على العديد من العمليات المترابطة، يمكن وصف آلياتها الأساسية...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orbital Shaker	Thermo Scientific	4353	For inoculum incubation or conical fask cultures
Bioscreen	Growth curves	C MBR	For batch cultures in microplates
Glucose	Sigma	G7021	For YPD broth preparation
Peptone from casein, enzymatic digest	Sigma	82303	For YPD broth preparation
Yeast extract	Sigma	09182-1KG-F	For YPD broth preparation
Bacteriological Agar	Sigma	A5306	For YPD agar preparation
NaH2PO4	Sigma	S8282	For SC broth preparation
(NH4)2SO4	Sigma	A4418	For SC broth preparation
Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate	Sigma	Y1251	For SC broth preparation
Yeast synthetic drop-Out medium supplements	Sigma	Y1501	For SC broth preparation
Ammonium sulfate granular	J.T. Baker	0792-R	For medium supplementation example
Resveratrol	Sigma	R5010	For medium supplementation example
Galactose	Sigma	G8270	For medium supplementation example
Sucrose	Sigma	S7903	For medium supplementation example
Absolut ethanol	Merck	107017	For medium supplementation example
Glycerol	J.T. Baker	2136-01	For medium supplementation example
GraphPad Prism	GraphPad Software		For data analysis
Honeycomb microplates	Thermo Scientific	9502550	For microplate cultures