Saccharomyces cerevisiae Üstel büyüme kinetik solunum ve fermantatif metabolizma analiz etmek için toplu iş kültüründe

Özet

Burada solunum ve fermantatif metabolizma Saccharomyces cerevisiae üstel büyüme üstel büyüme Denklem için yaklaştırarak tahmin etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Kinetik parametrelerin hesaplanması maddeler/bileşikler etkileri fermantasyon veya mitokondrial solunum testi ile taranması için izin verir.

Özet

Saccharomyces cerevisiae hücreleri veya üssel faz olarak onların büyüme fermantasyon ve/veya mitokondrial solunum ATP üreten sürdürmek. Fermente karbon konsantrasyonu esas olarak Maya hücreleri ATP oluşturmak nasıl yönetir; Böylece, fermente karbonhidrat düzeyleri varyasyon S. cerevisiaeenerjik metabolizma kullanıyor. Bu kağıt toplama değişikliklerin etkisini ve solunum ve fermantatif metabolizmasına karbon kaynağı niteliği tahmin etmek için üstel Maya büyüme dayalı yüksek üretilen iş yöntemi açıklanır. S. cerevisiae büyüme bir Mikroplaka ölçülen veya konik sarsıldı 600 optik yoğunluk (OD) malzemelerini şişesi nm. Sonra bir büyüme eğrisi zaman, hangi kimlik ve üssel faz yelpazesi sağlar ve üstel büyüme denklemle kinetik parametrelerin elde etmek için monte karşı çizdirme OD tarafından inşa edilmiştir. Düşük belirli büyüme oranları daha yüksek katlama süreler genellikle solunum büyüme temsil eder. Buna karşılık, daha yüksek belirli büyüme oranları daha düşük katlama kez fermantatif büyüme gösterir. Zaman ve belirli büyüme oranı iki katına eşik değerleri fermente karbon kaynakları veya daha yüksek konsantrasyonlarda fermente şekerler gibi iyi bilinen solunum veya fermantatif koşullar kullanarak tahmin edilir. Bunun için belirli her zor elde edilir. Son olarak, hesaplanan kinetik parametrelerin Maya fermantatif ve/veya solunum büyüme gösterip göstermediğini kurmak için eşik değerleri ile karşılaştırılır. Bu yöntemin avantajı fermantatif veya solunum metabolizma bir madde/bileşik etkilerini anlamak için göreli basitliğidir. Büyüme karışık ve karmaşık bir biyolojik süreç olduğunu vurgulamak önemlidir; Bu nedenle, bu yöntem ilk veri oksijen tüketim miktar ve fermantasyon yan birikimi tarafından corroborated gerekir. Böylece, bu teknik bileşikler/maddeler rahatsız ya da fermantatif veya solunum metabolizma artırmak bir ön elemeyi olarak kullanılabilir.

Giriş

Saccharomyces cerevisiae büyüme fizyolojik ve moleküler mekanizmaları onlarca tanımlamak için değerli bir araç hizmet vermiştir. Büyüme öncelikle üç yöntemlerle ölçülen: spot test, koloni oluşturan birim sayma ve büyüme eğrileri seri dilutions. Bu teknikler belirli yanıtlar veya fenotipleri araştırmak için tek başına veya birlikte çeşitli yüzeyler, çevre koşulları, mutantlar ve kimyasallar ile kullanılabilir.

Mitokondrial solunum içinde büyüme kinetik başarıyla bilinmeyen mekanizmaları keşfetmek için uygulanmış olan biyolojik bir süreçtir. Bu durumda, tek karbon ve enerji kaynağı değerlendirmek için izin verdiğinden takviyesi ile fermente karbon büyüme ortamının gliserol, laktat veya (ki sadece mitokondrial solunum tarafından metabolize) etanol gibi kaynakları Solunum büyüme, tedirginlikler Oksidatif fosforilasyon faaliyet¹' algılamak önemlidir. Diğer taraftan, fermantasyon arkasında mekanizmaları deşifre bir yöntem olarak büyüme kinetik modelleri kullanmak karmaşıktır.

Fermantasyon ve mitokondrial solunum Crabtree ve Warburg etkileri^2,3gibi belirli fenotipleri arkasında moleküler mekanizmaları aydınlatmak için esastır. Crabtree etkisi ile karakterize bir artış glycolytic akı, baskı mitokondrial solunum ve fermantasyon ATP fermente karbonhidrat yüksek konsantrasyonda huzurunda oluşturmak için birincil yolu olarak kurulması (> 0.8 mM)^4,5. Memeli hücrelerinde, ana, fermantasyon laktat⁶ürünü Warburg etkisi metabolik olarak Crabtree etkisi farkı ile analog bu olmak. Gerçekten de, kanser hücrelerinin, Glikoz alımı ve tüketimi bile oksijen⁷huzurunda uyarının harekete geçirilmesine karşılık çeşitli tarafından Warburg etkisi sergilenmektedir. Böylece, solunum geçiş Crabtree etkisi fermantasyon için moleküler temeli eğitim biyoteknolojik yankıları (etanol üretimi için) hem de olası etkileri kanser araştırma vardır.

S. cerevisiae büyüme Crabtree ve Warburg etkileri çalışmaya uygun bir araç olabilir. Maya üssel faz mitokondrial solunum ve fermantasyon, büyüme sürdürmek için gerekli olan ATP üretmek için kullanılan merkezi yolları vardır gerçeğine dayanarak bu fikir. Örneğin, S. cerevisiae gelişimini yakından ATP üretme yolları fonksiyonuyla ilişkilidir. Fermantasyon sadece 2 ATP molekülleri, üretir, ancak glukoz molekülü başına S. cerevisiae ' mitokondrial solunum üretir yaklaşık 18 ATP molekülleri, bu nedenle bu büyüme hızı metabolik yollar ile sıkı bağlantıları bulunmaktadır bekleniyor üreten ATP⁸. Fermantasyon ATP üretmek için ana yolu olduğunda, bu bağlamda, Maya düşük ATP üretimi için Glikoz alımı hızını artırarak dengeler. Aksine, mitokondrial solunum ana ATP kaynağı olarak kullanmak Maya hücreleri glikoz tüketiminden düşüktür. Bu ATP nasıl oluşturulacaklarını belirleme önce Maya duyu karbonhidrat durumu için önemli olduğunu gösterir. Bu nedenle, glikoz kullanılabilirlik fermantasyon ve mitokondrial solunum arasında geçiş içinde önemli bir rol oynar S. cerevisiae. Huzurunda yüksek miktarda glikoz Maya fermantasyon ATP üretmek için orta yol olarak tercih ediyor. İlginçtir, Maya fermantasyon belirli büyüme oranı, en yüksek seviyede korunur. Öte yandan, glikoz seviyesinin düşük altında S. cerevisiae düşük büyüme oranları koruyarak mitokondrial solunum, kullanarak ATP üretir. Böylece, toplama varyasyon glikoz ve diğer karbon kaynaklarının Maya'nın tercihi fermantatif ve solunum büyüme arasında değişimler ikna etmek. Üstel büyüme denklem bu gerçeği dikkate alarak, bir saat (Dt) ve belirli büyüme hızı (µ) iki katına gibi kinetik parametrelerin biyolojik anlamını elde edebilirsiniz. Örneğin, Maya birincil yolu mitokondrial solunum kullandığında alt µ değerleri bulunmuştur. Aksine, fermantasyon lehine koşullar altında yüksek µ değerleri bulunmuştur. Bu metodoloji fermantasyon ve mitokondrial Solunum etkileyen herhangi bir kimyasal muhtemel mekanizmaları ölçmek için kullanılabilir S. cerevisiae.

Bu kağıt amacı belirli bir madde/bileşik etkilerini mitokondrial solunum veya fermantasyon süzmek için büyüme kinetik esas alarak bir yöntemini teklif etmektir.

Protokol

1. Kültür Medya ve Inoculum hazırlık

1. 100 mL % 2 maya özü-pepton-Dekstroz (YPD) sıvı orta hazırlamak (1 gr maya ekstresi, kazein pepton, 2 g ve 2 g glikoz için 100 mL distile su ekleyin). Medya 3 mL 15 mL edilemezler konik tüpler içine dağıtmak. Basınçlı kap 15dk 121 ° C ve 1,5 psi için medya.
   Not: Medya bir ay 4-8 ° C'de depolanabilir
2. Serin steril % 2 YPD et suyu 3 mL gliserol-20 ° C'de korunmuş S. cerevisiae hücre 250 μL ile dolu bir konik tüp aşılamak Gecede 200 devirde ajitasyon ile bir orbital Shaker-30 ° C'de kuluçkaya.
3. Petri kabına (60 x 15 mm²) steril % 2 YPD agar ile dolu çizgi (10 g maya ekstresi, kazein pepton, 20 g glikoz, 20 g ve 20 g bakteriyolojik agar için 1000 mL distile su ekleyin) bir kısır döngü kullanarak konik tüp içinde yetiştirilen hücreleri ile. İzole kolonilerin gelişim göstermek kadar 30 ° C'de Petri kabına kuluçkaya.
4. 10 mL serin steril % 2 YPD et suyu ile dolu bir konik tüp içine izole bir koloni aşı öncesi inoculum hazırlamak ve bu gecede 200 devirde sürekli ajitasyon ile 30 ° C'de kuluçkaya.

2. Kültür Medya ve Mikroplaka büyüme eğrileri

1. 10 mL % 1'ypd suyu hazırlamak (0,1 g maya ekstresi, pepton, 0.2 g ve 0.1 g glikoz için 10 mL distile su ekleyin), % 2 YPD suyu 10 mL (0,1 g maya ekstresi, pepton, 0.2 g ve 0.2 g glikoz için 10 mL distile su ekleyin) ve 10 mL % 10 YPD suyu (0,1 g maya ekstresi, pepton, 0.2 g ve 1 g glikoz için 10 mL distile su ekleyin). Basınçlı kap 15dk 121 ° C ve 1,5 psi için bu büyüme ortamları.
   Not: Kültür medya fermantatif büyüme bir denetim olarak hizmet vermektedir.
2. 10 mL % 2 maya özü-pepton-etanol (türü) suyu ve 10 mL % 2 maya özü-pepton-gliserol (YPG) suyu hazırlayın. % 2 türü: 0.1 g maya ekstresi, pepton, 0.2 g ve 10 mL etanol 0.2 mL distile su ekleyin. % 2 için YPG: 0.1 g maya ekstresi, pepton, 0.2 g ve gliserol 10 mL için 0.2 mL distile su ekleyin. Basınçlı kap 15dk 121 ° C ve 1,5 psi için bu büyüme ortamları.
   Not: Gliserol ve etanol sadece mitokondrial solunum tarafından metabolize fermente karbon kaynakları vardır. Bu nedenle, onlar bir solunum büyüme denetimleri kullanılır. Bu adımda, maya özü-pepton (YP) suyu (10 g maya özü ve kazein pepton 1000 mL distile su içinde 20 g) bir üs olarak kullanarak büyüme fenotip üzerindeki etkilerini test etmek için karbon kaynağı Kültür medya konsantrasyon ve türünü değiştirilebilir. Karbon yanı sıra diğer besin etkilerini sınamak için sentetik tam (SC) orta denemenin amacı göre desteklenen. Maya azot temel amino asitler, 5 g amonyum sülfat 1.8 g için SC orta noktasıdır [(NH₄)₂SO₄], monosodyum fosfat (NaH₂PO₄), 1.4 g ve 2 g bırakma 1000 mL distile su karışımı. Ek bir karbon kaynağı ve ek azot kaynağı gerekli konsantrasyonlarda ile medya.
3. Deneysel tasarım için uygun kültür ortamının 145 μL her şey bir kapak ile steril Mikroplaka (10 x 10-de) ekleyin ve onları ön inoculum 5 μL ile aşılamak.
   Not: amaç maddeler/bileşikler etkisi Maya enerjik metabolizma ekran için ise, bu madde/bileşik bu adımı sırasında eklenmelidir. Ayrıca, bir kapak ile Mikroplaka her türlü yararlı olmalıdır.
4. 30 ° C'de Mikroplaka Okuyucu 48 h. ölçü 600 optik yoğunluk (OD) için 200 devirde sabit ajitasyon ile çok iyi plaka kuluçkaya nm her 30 veya 60 dak.
   Not: Mikroplaka Okuyucu Mikroplaka kuluçkaya seçeneği varsa, bu bir orbital çalkalayıcı, OD her ölçüm arasında aynı koşulları içinde inkübe.

3. büyüme eğrileri sarsılmış konik şişeler içinde

1. Uygun kültür ortamının 4,8 mL 20 mL konik şişeler ve basınçlı kap ekleyin. Her şişesi 200 μL OD_600nm ~ 2 serin, steril % 2 YPD suyu içinde ön inoculum kültürünün ile aşılamak. Onları 24 h için 250 rpm sabit ajitasyon ile 30 ° C'de kuluçkaya.
   Not: kuluçka süresi 24 saat yüksekse, 50 mL konik şişeler ve basınçlı kap uygun kültür ortamının 12 mL ekleyin. Onları ön inoculum 500 μL ile aşılamak. Fermantatif büyüme denetimleri (YP medya % 1, % 2 veya % 10 glikoz ile) ve solunum büyüme denetimleri (YP % 2 gliserol veya etanol ortamla) dikkate almak önemlidir.
2. Sarsılmış konik şişesi kültürünün 100 μL al ve 900 μL 1 mL spektrofotometre küvet içinde distile su içinde seyreltik ve karışımı yavaşça pipetting tarafından. 600 OD ölçmek bir spektrofotometre her 2 h kullanarak nm. Gerçek OD elde etmek için sonucu on tarafından çarpın.

4. veri işleme ve kinetik parametrelerin hesaplama

1. Yeni bir proje dosyasında istatistik paketi yazılımında oluşturun. "Yeni tablove grafik" bölümünde "XY" seçeneğini seçin.
   1. Seçeneği seçin: "bir boş veri tablosu ile Start" "Örnek veriler" bölümünde.
   2. "Noktaları ve bağlantı hattı" grafik türünü seçin. "X" bölümü "Çoğaltır veya hata değerleri için Subcolumns" kesim içinde seçili bırakın ve içinde "Y" seçeneği seçin: "Yan yana subcolumns (10) Çoğalt değerler girin ve ortalama ve hata SD Arsa". Oluştur düğmesini tıklatın.
      Not: Tablo biçiminde bir X sütun ve birden fazla Y sütun, her biri daha önce seçilen 10 subcolumns var.
2. Yazma hangi aşırı doz ölçümleri X sütununda alınmıştır zaman (Örneğin, 0, 30, 60, 90 dakika veya 0, 1, 1.5, 2 h). Y sütunlarda kültürler elde OD değerleri yazın.
3. Logaritma Y sütun veri dönüştürme ve üstel büyüme aşamasında tanımlayın. "Analiz" düğmesini tıklatın, "Dönüştürmek" analiz, Y kullanarak Y değerlerini seçin Log(Y) =. "Galeri sonuçları", "Dönüştürmek" veri tablo seçin "Analiz" düğmesini tıklatın ve "Doğrusal regresyon" analiz seçin gidin. Doğrusal bir davranış takip etmez OD değerleri almamak. Değerleri almamak için bunları veri tablosunu seçin ve "Ctrl + E"yazın.
   Not: Üstel büyüme denklem de veya üssel faz ile uyuyor beri izleyen veya üssel faz değil değerleri almamak önemlidir.
4. "Veri tabloları Galeri", veri tablosunu seçin "veri 1". "Analiz" düğmesini tıklatın ve "Doğrusal olmayan regresyon (eğri FIT)" Analizi "XY analizleri" arasındaseçin.
5. Analiz ve "Tamam" düğmesini tıklatın veri kümelerini seçin. "Üstel denklemi" bölümüne "Uygun" sekmesini seçin ve "üstel büyüme denklemi" seçin (, nerede hücre konsantrasyonu, X X₀ sıfır zamanda μ hücre konsantrasyon olduğunu belirli büyüme oranı ve t zamanı). "Uyan en az kare sayısını" uygun yöntemi olarak kullanmak ve aradeğerleme bölümü seçili bırakın. "Tamam" düğmesini tıklatın.
   Not: "Galeri sonuçlarının"doğrusal olmayan uygun sonuçlar ile sekmesidir. Katlama zaman (Dt) ve özel yazılım hesaplar büyüme oranı (μ). Yazılım μ K olarak sonuçları sekmesini gösterir.
6. Yeni bir proje dosyasını açın ve "yeni tablo ve grafik" bölümünde, sütun seçim seçin. "Bir boş veri tablosu ile Başlat" seçeneğini seçin ve istediğiniz grafiği seçin. Ortalama SD seçin "Oluştur" düğmesine çizmek seçin.
7. "Galeri sonuçlarının" doğrusal olmayan uygun sonuçlar sekmesini μ veya Dt değerleri kopyalamak ve bir sütunda yapıştırabilirsiniz. Son olarak, "Analiz" düğmesini seçin ve istediğiniz analiz farklı nutrimental koşullardan kinetik parametrelerin karşılaştırmak için "Sütun analizleri" bölümünde seçin.
   Not: Kinetik parametrelerin fermantatif büyüme denetimleri (YP medya % 1, % 2 veya % 10 glikoz ile) elde edilen ve solunum büyüme denetimleri (YP % 2 gliserol veya etanol ortamla) yardımcı olur fermantatif ve mitokondrial solunum eşiği belirlemek, anılan sıraya göre. Kinetik karşılaştırma beslenme durumu ve madde/bileşik ile solunum ve fermantatif büyüme denetlesinler parametreleri tanımlayan olası etkisi solunum veya fermantatif metabolizmasına yardımcı.

Sonuçlar

Büyüme eğrileri birime S. cerevisiae Maya solunum ve fermantatif fenotipleri arasında ayırımcılık için kullanılabilir. Bu nedenle, biz S. cerevisiae (BY4742) toplu iş kültürleri fermantatif büyümesini teşvik bildirilmiştir farklı glikoz konsantrasyonu ile gerçekleştirilen: % 1, % 2 ve % 10 (w/v)⁹. Fermantatif fenotip gösterilen kültürler küçük gecikme faz ve bir yüksek büyüme oranı (resim 1

Tartışmalar

J. Monod¹⁰ bakteriyel kültürlerde büyüme çalışmanın Mikrobiyoloji temel yöntemi olduğunu ifade beri uzun zaman geçti. Moleküler araçları gelişiyle kullanım ve çalışma bir teknik olarak büyüme geciktirir. Çok sayıda birbiriyle ilişkili süreçlerinden büyüme karmaşıklığına rağmen onun temel mekanizmaları matematiksel modeller¹¹kullanarak tanımlanabilir. En karmaşık moleküler mekanizmaları¹²aydınlatmak için tamam...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orbital Shaker	Thermo Scientific	4353	For inoculum incubation or conical fask cultures
Bioscreen	Growth curves	C MBR	For batch cultures in microplates
Glucose	Sigma	G7021	For YPD broth preparation
Peptone from casein, enzymatic digest	Sigma	82303	For YPD broth preparation
Yeast extract	Sigma	09182-1KG-F	For YPD broth preparation
Bacteriological Agar	Sigma	A5306	For YPD agar preparation
NaH2PO4	Sigma	S8282	For SC broth preparation
(NH4)2SO4	Sigma	A4418	For SC broth preparation
Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate	Sigma	Y1251	For SC broth preparation
Yeast synthetic drop-Out medium supplements	Sigma	Y1501	For SC broth preparation
Ammonium sulfate granular	J.T. Baker	0792-R	For medium supplementation example
Resveratrol	Sigma	R5010	For medium supplementation example
Galactose	Sigma	G8270	For medium supplementation example
Sucrose	Sigma	S7903	For medium supplementation example
Absolut ethanol	Merck	107017	For medium supplementation example
Glycerol	J.T. Baker	2136-01	For medium supplementation example
GraphPad Prism	GraphPad Software		For data analysis
Honeycomb microplates	Thermo Scientific	9502550	For microplate cultures