Saccharomyces cerevisiae 호흡과 발효 대사 분석을 배치 문화 지 수 성장 속도 론

요약

여기 선물이 지 수 성장 방정식에 Saccharomyces cerevisiae 의 지 수 성장 피팅 하 여 호흡과 발효 대사를 추정 하는 프로토콜. 운동 매개 변수 계산 발효 또는 미토 콘 드리 아 호흡 물질/화합물의 영향의 심사에 대 한 수 있습니다.

초록

지 수 단계에 saccharomyces cerevisiae 세포 발효 및 미토 콘 드리 아 호흡을 통해 ATP를 생산 하 여 그들의 성장 유지. Fermentable 탄소 농도 주로 효 모 세포에서 ATP;를 생성 하는 방법을 제어합니다 따라서, fermentable 탄수화물 수준에 변화 S. cerevisiae의 에너지 대사를 드라이브. 이 신문은 추정의 농도 변경 효과 호흡과 발효 대사에 탄소 소스의 자연 지 수 효 모 성장에 따라 높은 처리량 방법을 설명 합니다. S. cerevisiae 의 성장 한 microplate에 측정 또는 원뿔 동요 600에서 광학 밀도 (OD)를 결정 하 여 플라스 크 nm. 그런 다음, 성장 곡선 그리기 세 시간, 식별 및 지 수 위상의 선택을 허용 하 고 운동 매개 변수를 지 수 성장 방정식은 장착 대에 의해 만들어집니다. 높은 두 배로 시간 낮은 특정 성장 속도 일반적으로 호흡기 성장을 나타냅니다. 반대로, 낮은 배로 시간 높은 특정 성장 율 일 성장을 나타냅니다. 임계값의 시간과 특정 성장 율을 두 배로 잘 알려진 호흡 또는 발효 조건, 비-fermentable 탄소 소스 등 fermentable 설탕의 높은 농도 사용 하 여 견적 된다. 이 각 특정 스트레인에 대 한 얻을 수 있습니다. 마지막으로, 계산 된 운동 매개 변수 효 모 발효 및/또는 호흡기 성장을 보여줍니다 여부 설정 임계값 값으로 비교 됩니다. 이 방법의 장점은 일 또는 호흡 대사에는 물질 또는 화합물의 효과 이해 하기 위한 상대적 단순입니다. 성장 한 복잡 하 고 복잡 한 생물 학적 과정; 강조 하는 것이 중요 하다 따라서,이 방법에서 예비 데이터 산소 소비량의 정량화와 발효 부산물의 축적에 의해 뒷받침 해야 합니다. 따라서,이 기술은 화합물/방해 하거나 발효 또는 호흡기 신진 대사를 향상 시킬 수 있는 물질의 예비 심사로 사용할 수 있습니다.

서문

Saccharomyces cerevisiae 성장 수십 생리 및 분자 메커니즘을 식별 하는 유용한 도구를 역임 했다. 성장 주로 세 가지 방법에 의해 측정 된다: 자리 테스트, 콜로 니 형성 단위, 및 성장 곡선에 대 한 직렬 희석. 이러한 기술은 특정 응답 또는 고기를 조사 하거나 기질, 환경 조건, 돌연변이, 그리고 화학 물질의 다양 한와 함께 사용할 수 있습니다.

미토 콘 드리 아 호흡 있는 성장 속도 론 성공적으로 적용 된 알 수 없는 메커니즘을 발견에 대 한 생물 학적 과정 이다. 이 경우에, 비 fermentable 탄소와 성장 매체의 보충 소스 글리세롤, 젖 산, 에탄올 (미토 콘 드리 아 호흡에 의해 대사만), 등 평가 대 한 수 있습니다 유일한 탄소 및 에너지 소스는 호흡기 성장, 산화 인 산화 활동¹에 물결을 감지 하는 것이 중요 하다는. 다른 한편으로, 그것은 발효 뒤에 메커니즘을 파악 하기 위한 방법으로 성장 운동 모델을 사용 하 여 복잡 하다입니다.

발효와 미토 콘 드리 아 호흡의 연구 크랩 트리 및 바르 부르 크 효과^2,3같은 특정 고기 뒤에 분자 메커니즘을 명료 하 게 필수적 이다. 크랩 트리 효과 glycolytic 플럭스의 증가, 미토 콘 드리 아 호흡의 억압과 fermentable 탄수화물의 높은 농도의 ATP를 생성 하는 기본 통로로 발효의 설립에 의해 특징입니다 (> 0.8 m m)^4,5. 바르 부르 크 효과 되는 포유류 세포에 발효의 주요 제품 젖⁶metabolically 크랩 트리 효과 차이와 아날로그. 실제로, 바르 부르 크 효과 다양 한 트리거링 포도 당 통풍 관 및 산소⁷존재도 소비 하는 암 세포에 의해 전시 된다. 따라서, 크랩 트리 효과에 발효 호흡에서 스위치의 분자 기초 공부에 (에탄올 생산)에 대 한 바이오 영향 및 잠재적인 영향 암 연구 합니다.

S. cerevisiae 성장 크랩 트리 및 바르 부르 크 효과 공부 하는 적합 한 도구 있을 수 있습니다. 이 아이디어는 효 모 지 수 단계에서 ATP를 생산 하는 데 사용 하는 중앙 통로 미토 콘 드리 아 호흡과 발효, 성장을 유지 하기 위해 필수적인 사실에 기반. 예를 들어, S. cerevisiae 의 성장 ATP 생성 통로의 기능을 밀접 하 게 관련 되어 있습니다. 포도 당 분자 당 S. cerevisiae, 미토 콘 드리 아 호흡 생산 약 18 ATP 분자, 발효만 2 ATP 분자를 생성 하는 반면 따라서 그것 전망 이다 성장 율 변화 통로와 꽉 링크는 ATP⁸생산. 이와 관련, 발효 ATP를 생성 하는 주요 경로 이면 누 룩 낮은 ATP 생산 함으로써 보완 포도 당 통풍 관의 속도 증가 합니다. 그와 반대로, 미토 콘 드리 아 호흡 주요 ATP 소스로 사용 하는 효 모 세포에 의해 포도 당 소비는 낮다. 이 ATP 생성 되는 방법을 결정 하기 전에 이해 탄수화물을 효 모에 대 한 중요 한는 것을 나타냅니다. 포도 당 가용성 발효와 미토 콘 드리 아 호흡에서의 전환에 중요 한 역할을 담당 하는 따라서, S. cerevisiae. 높은 양의 포도 당의 누 룩 발효를 ATP를 생성 하는 중앙 노선으로 좋아한다. 흥미롭게도, 누 룩을 발효 하면 특정 성장 율 최대 유지 됩니다. 다른 한편으로, 포도의 낮은 수준에서 S. cerevisiae 생성 ATP 미토 콘 드리 아 호흡을 사용 하 여 낮은 성장 율을 유지 합니다. 따라서, 포도 당 및 다른 탄소 원의 사용의 농도에 변화 일 및 호흡기 성장 사이 누 룩의 기본 설정에서 변경 유도. 이 사실을 지 수 성장 방정식을 고려 하 여 한 시간 (Dt)와 특정 성장 율 (μ)를 배로 운동 매개의 생물학적 의미를 얻을 수 있습니다. 예를 들어 μ 값 효 모 미토 콘 드리 아 호흡을 사용 하 여 기본 경로로 발견 되었다. 그와 반대로, 발효를 선호 하는 조건 하에서 높은 μ 값이 발견 되었다. 이 방법론 발효 및 미토 콘 드리 아 호흡에 영향을 미치는 화학 물질의 가능한 메커니즘을 측정 하는 데 사용할 수 있습니다 S. cerevisiae.

이 문서의 목적은 심사 미토 콘 드리 아 호흡 또는 발효에 주어진된 물질/화합물의 효과 대 한 성장 속도에 따라 방법 제안.

프로토콜

1. 문화 미디어와 Inoculum 준비

1. 준비 2% 효 모 추출-펩-포도 당 (YPD) 액체 매체의 100 mL (1 g의 효 모 추출 물, 카 세 인 펩의 2 세대 및 2 세대 포도의 100 ml의 증류수를 추가). 15 mL 원뿔 튜브를 sterilizable으로 미디어의 3 mL을 분배. 고압 121 ° C와 1.5 psi에서 15 분에 대 한 미디어.
   참고: 미디어는 4-8 ° c.에 최대 한 달 동안 저장 될 수 있다
2. 가득-20 ° c.에 글리세롤에 보존 하는 S. cerevisiae 세포의 250 μ와 멋진 살 균 2 %YPD 국물의 3 mL 원뿔 튜브를 예방 200 rpm 동요와 30 ° C에서 궤도 통에서 밤새 품 어.
3. 페 트리 접시 (60 x 15 m m²) 살 균 2% YPD agar 가득 행진 (10 g의 효 모 추출 물, 카 세 인 펩의 20 g 포도 당의 20 g 그리고 증류수 1000 ml의 세균 agar의 20 g 추가) 메 마른 루프를 사용 하 여 원뿔 튜브에 성장 하는 세포. 고립 된 식민지 성장을 표시 될 때까지 30 ° C에서 배양 접시를 품 어.
4. 하나의 고립 된 식민지 가득한 멋진 살 균 2 %YPD 국물의 10 mL 원뿔 튜브에 접종 하 여 사전 inoculum을 준비 하 고 200 rpm에서 지속적인 동요와 30 ° C에서 밤새 품 어.

2. 문화 미디어와 Microplate에 성장 곡선

1. 1 %YPD 국물의 10 mL를 준비 (0.1 g의 효 모 추출 물, 펩, 0.2 g과 포도의 10 ml의 0.1 g에 증류수를 추가), 2 %YPD 국물의 10 mL (0.1 g의 효 모 추출 물, 펩, 0.2 g 그리고 증류수 10 mL에 포도의 0.2 g 추가) 그리고 10 %YPD 국물의 10 mL (0.1 g의 효 모 추출 물, 펩, 0.2 g을 증류수 10 mL에 포도의 1 g 추가). 압력솥이 성장 매체 1.5 psi 121 ° C에서 15 분.
   참고: 문화 미디어 일 성장의 컨트롤 역할을 합니다.
2. 2% 효 모 추출 물 펩 에탄올 (형식) 국물의 10 mL와 10 mL 2% 효 모 추출 물 펩 글리세롤 (YPG) 국물을 준비 합니다. 2%에 대 한 형식: 0.1 g의 효 모 추출 물, 펩, 0.2 g을 증류수 10 mL에 에탄올의 0.2 mL를 추가. 2 %YPG: 0.1 g의 효 모 추출 물, 펩, 0.2 g 그리고 증류수 10 mL에 글리세롤의 0.2 mL를 추가. 압력솥이 성장 매체 1.5 psi 121 ° C에서 15 분.
   참고: 글리세롤과 에탄올은 독점적으로 미토 콘 드리 아 호흡에 의해 물질 대사로 변화 비 fermentable 탄소 소스. 이러한 이유로, 호흡기 성장 컨트롤로 사용 됩니다. 이 단계에서 효 모 추출 물 펩 (YP) 국물 (10 g의 효 모 추출 물 및 증류수 1000 mL에 카 세 인 펩의 20 g)를 기본으로 하 여 성장 표현 형에 영향을 테스트 유형과 문화 미디어에서 탄소 소스의 농도 변경할 수 있습니다. 탄소 이외의 다른 영양소의 효과 테스트 하려면 합성 완료 (SC) 매체 실험의 목표에 따라 보충 된다. 사우스 캐롤라이나 매체에 대 한 자료는 아미노산, 황산 암모늄 5 g 없이 기본 효 질소의 1.8 g [(NH₄)₂등₄], 1.4 g의 글루타민 인산 염 (NaH₂포₄), 드롭 아웃의 2 세대 1000 mL의 증류수에 혼합. 탄소 소스와 필요한 농도에서 추가 질소 소스 미디어를 보충.
3. 실험 설계에 대 한 적합 한 문화 미디어의 145 μ 뚜껑 살 균 미 판 (10 x 10-잘)의 각 음을 추가 하 고 사전 inoculum의 5 μ와 예방.
   참고: 지금까지 목표는 화면에 누 룩의 에너지 대사 물질/화합물의 영향, 경우에 그 물질/화합물이이 단계 동안 추가 되어야 합니다. 또한, 모든 유형의 뚜껑 microplate 유용 해야 한다.
4. 다 잘 접시 200 rpm에서 48 h. 측정 600에서 광학 밀도 (OD)에 대 한 지속적인 동요와 30 ° C에서 microplate 리더에 품 어 nm 매 30 또는 60 분.
   참고: microplate 리더에는 미 판 품 어 하는 옵션이 없는 경우 그것은 수 있습니다 알을 품는 OD의 모든 측정 사이 동일한 조건에서 궤도 통에.

3. 성장 곡선 소동된 원뿔 플라스 크에

1. 20 mL 원뿔 플라스 크 및 고압에 적합 한 문화 미디어의 4.8 mL를 추가 합니다. OD_600nm ~ 2 쿨, 무 균 2 %YPD 국물에서에서 사전 inoculum 문화 200 μ와 각 플라스 크 예방 24 h에 대 한 250 rpm에서 일정 한 동요와 30 ° C에서 그들을 품 어.
   참고: 잠복기 24 h 보다 높은 경우에, 50 mL 원뿔형 플라스 크 및 고압에 적합 한 문화 미디어의 12 mL를 추가 합니다. 그들의 사전 inoculum 500 μ와 예방. 그것은 또한 일 성장 컨트롤 (YP 미디어 1%, 2% 또는 10% 포도 당) 및 호흡기 성장 컨트롤 (YP 미디어 2% 글리세롤 또는 에탄올)을 고려 하는 것이 중요.
2. 흔들린된 원뿔 플라스 크 문화 100 μ 걸릴 하 고 900 μ 1 mL 분 광 광도 계 베트에 증류수에 희석 pipetting으로 부드럽게 혼합. 600에서 OD를 측정 nm 마다 2 h 분 광 광도 계를 사용 하 여. 진짜 세를, 10에 의해 결과 곱하면 됩니다.

4. 데이터 처리 및 운동 매개 변수 계산

1. 통계 패키지 소프트웨어에서 새 프로젝트 파일을 만듭니다. "새 테이블및 그래프" 섹션에서 "XY" 옵션을 선택 합니다.
   1. 옵션 선택: "예제 데이터" 섹션에서 "빈 데이터 테이블로 시작" .
   2. "포인트 및 연결선" 그래프 유형을 선택 합니다. "X" 섹션 "복제 또는 오류 값에 대 한 Subcolumns"의 세그먼트에서 선택 하지 않은 상태로 두고 "Y" 섹션 옵션을 선택: "나란히 subcolumns에서 (10) 복제 값을 입력 하 고 작의 의미 및 오류 SD". 만들기를 클릭 합니다.
      참고: 테이블 형식 X 열 및 여러 Y 열, 각각 이전 선택 10 subcolumns 있다.
2. 쓰기는 OD에 측정 X 열에서 찍은 시간 (예를 들어, 0, 30, 60, 90 분 또는 0, 1, 1.5, 2 h). Y 열에서 문화에서 가져온 OD 값을 작성 합니다.
3. 로그 Y 열 데이터를 변환 하는 지 수 성장 단계를 식별 합니다. "분석" 버튼을 클릭, 선택 "변환" 분석, Y를 사용 하 여 Y 값 선택 = Log(Y). "결과의 갤러리", 선택 "변환" 데이터 테이블 "분석" 버튼을 클릭 하 고 "선형 회귀" 분석을 선택 이동 합니다. 선형 동작을 따르지 않는 OD 값을 제외 합니다. 값을 제외 하려면 데이터 테이블에 그들을 선택 하 고 "Ctrl + E"를입력 합니다.
   참고: 그것은 이후 지 수 성장 방정식 잘 지 수 단계에 맞는 지 수 단계를 수행 하지 값을 제외 하는 것이 중요.
4. "데이터 테이블 갤러리"데이터 테이블 선택 "데이터 1". "분석" 버튼을 클릭 하 고 "XY 분석" 가운데 "비선형 회귀 (곡선 적합도)" 분석을 선택 합니다.
5. 분석 하 고 "확인" 버튼을 클릭 하 여 데이터 집합을 선택 합니다. "맞춤" 탭에서 "지 수 방정식" 섹션을 선택 하 고 선택 "지 수 성장 방정식" ( X 는 세포 농도, X₀ 는 0에, μ 셀 농도 특정 성장 속도 이며 t 는 시간). 피팅 방법으로 "최소 제곱 적합" 사용 하 고 보간 섹션 선택 되지 않은 둡니다. "확인" 버튼을 클릭 합니다.
   참고: 비선형 맞는 결과 탭 "결과의 갤러리"입니다. 소프트웨어 두 배로 시간 (Dt)와 특정 계산 성장 율 (μ). 소프트웨어는 결과 탭에 K 로 μ 를 표시합니다.
6. 새 프로젝트 파일을 열고 "새 테이블 및 그래프" 섹션에서 열 선택을 선택 합니다. "빈 데이터 테이블로 시작" 옵션을 선택 하 고 원하는 그래프를 선택 합니다. Sd. "만들기" 버튼을 선택와 의미를 선택 합니다.
7. "결과의 갤러리" 에 있는 비선형 맞는 결과 탭에서 μ 또는 Dt 값을 복사 하는 열에 붙여 넣을. 마지막으로, "분석" 버튼을 선택 하 고 다른 nutrimental 조건의 운동 매개 변수를 비교 하는 "열 분석" 섹션에 원하는 분석을 선택 합니다.
   참고: 운동 매개 변수 일 성장 컨트롤 (YP 미디어 1%, 2% 또는 10% 포도 당)에서 얻은 고 호흡기 성장 컨트롤 (YP 미디어 2% 글리세롤 또는 에탄올) 발효 및 미토 콘 드리 아 호흡의 임계값을 설정 하는 데 도움이 각각. 비교는 운동 영양 상태와 물질/화합물 호흡과 발효 성장 분석에서 매개 변수는 호흡 또는 발효 대사에 가능한 영향을 식별할.

결과

성장 곡선 예비 호흡과 발효 효 모 S. cerevisiae 에서 고기를 구분을 사용할 수 있습니다. 따라서, 우리 일 성장을 유도에 보고 된 다른 포도 당 농도 배치 문화 S. cerevisiae (BY4742)의 수행: 1%, 2% 및 10% (w/v)⁹. 문화 일 형을 보여주는 작은 지연 위상 있고 높은 성장 율 (그림 1)와 지 수 단계. 에탄올, 글리세롤, 및 젖 산 염은 호흡...

토론

오랜 시간 이후 J. Monod¹⁰ 표현 세균성 문화의 성장 연구 미생물학의 기본 메서드는 통과 했다. 분자의 출현 지연 사용 및 연구 기법으로 성장 합니다. 수많은 상호 프로세스를 포함 하는 성장의 복잡성에도 불구 하 고 그것의 근본적인 메커니즘 수학적 모델¹¹을 사용 하 여 설명할 수 있습니다. 이것은 가장 복잡 한 분자 메커니즘¹²명료 하 상호 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orbital Shaker	Thermo Scientific	4353	For inoculum incubation or conical fask cultures
Bioscreen	Growth curves	C MBR	For batch cultures in microplates
Glucose	Sigma	G7021	For YPD broth preparation
Peptone from casein, enzymatic digest	Sigma	82303	For YPD broth preparation
Yeast extract	Sigma	09182-1KG-F	For YPD broth preparation
Bacteriological Agar	Sigma	A5306	For YPD agar preparation
NaH2PO4	Sigma	S8282	For SC broth preparation
(NH4)2SO4	Sigma	A4418	For SC broth preparation
Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate	Sigma	Y1251	For SC broth preparation
Yeast synthetic drop-Out medium supplements	Sigma	Y1501	For SC broth preparation
Ammonium sulfate granular	J.T. Baker	0792-R	For medium supplementation example
Resveratrol	Sigma	R5010	For medium supplementation example
Galactose	Sigma	G8270	For medium supplementation example
Sucrose	Sigma	S7903	For medium supplementation example
Absolut ethanol	Merck	107017	For medium supplementation example
Glycerol	J.T. Baker	2136-01	For medium supplementation example
GraphPad Prism	GraphPad Software		For data analysis
Honeycomb microplates	Thermo Scientific	9502550	For microplate cultures