Saccharomyces cerevisiae Exponentielles Wachstum Kinetik in Batch-Kultur, Atem- und fermentativen Stoffwechsel analysieren

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Atemwege und fermentativen Stoffwechsel durch den Einbau des exponentiellen Wachstums von Saccharomyces Cerevisiae exponentielles Wachstum Gleichung zu schätzen. Berechnung der kinetischen Parameter kann für das Screening der Einflüsse der Stoffe/Verbindungen auf Gärung oder mitochondriale Atmung.

Zusammenfassung

Saccharomyces Cerevisiae Zellen in der exponentiellen Phase unterstützen ihr Wachstum durch die Produktion von ATP durch Gärung und/oder mitochondriale Atmung. Der vergärbaren Kohlenstoffgehalt regelt vor allem, wie die Hefezellen ATP erzeugen; so treibt die Variation in vergärbare Kohlenhydrate Ebenen den Energiestoffwechsel von S. Cerevisiae. Dieses Whitepaper beschreibt eine Hochdurchsatz-Methode basiert auf exponentielle Hefe Wachstum, die Auswirkungen von Änderungen der Konzentration und Art der Kohlenstoffquelle auf Atemwege und fermentativen Stoffwechsel zu schätzen. Das Wachstum von S. Cerevisiae ist in einer Mikrotestplatte gemessen oder geschüttelt konischen Kolben durch die Bestimmung der optischen Dichte (OD) bei 600 nm. Dann baut eine Wachstumskurve durch Plotten OD im Vergleich zur Zeit, was ermöglicht die Erkennung und Auswahl der exponentiellen Phase und ist ausgestattet mit der exponentiellen Wachstums-Gleichung, kinetische Parameter zu erhalten. Geringen spezifischen Wachstumsraten mit höheren Verdoppelung Zeit repräsentieren in der Regel eine respiratorische Wachstum. Im Gegensatz dazu zeigen höhere spezifische Wachstumsraten mit niedrigeren Verdoppelung Mal fermentative Wachstum. Grenzwerte der Verdoppelung der Zeit und spezifischen Wachstumsrate sind anhand der bekannteste Atem- oder fermentative Bedingungen wie nicht vergärbaren Kohlenstoffquellen oder höhere Konzentrationen an vergärbaren Zucker geschätzt. Dies ist für jede spezifische Belastung erreicht. Schließlich sind die berechneten kinetischen Parameter gegenüber der Schwellenwerte um festzustellen, ob die Hefe fermentative und/oder Atemwege Wachstum zeigt. Der Vorteil dieser Methode ist die relative Einfachheit für das Verständnis der Auswirkungen einer Substanz/Verbindung auf fermentative oder respiratorischen Stoffwechsel. Es ist wichtig, hervorzuheben, dass das Wachstum eines komplizierten und komplexen biologischen Verfahrens; vorläufige Daten aus dieser Methode müssen daher durch die Quantifizierung der Sauerstoffverbrauch und Akkumulation von Gärreste erhärtet werden. Dabei kann diese Technik als eine Vorauswahl von Verbindungen/Substanzen verwendet werden, die möglicherweise stören oder fermentativer oder respiratorischen Stoffwechsel.

Einleitung

Saccharomyces Cerevisiae Wachstum diente als ein wertvolles Werkzeug, Dutzende von physiologischen und molekularen Mechanismen zu identifizieren. Wachstum wird hauptsächlich durch drei Methoden gemessen: Verdünnungsreihen für Stichproben, koloniebildenden Stückzählen und Wachstumskurven. Diese Techniken können allein oder in Kombination mit einer Vielzahl von Substraten, Umweltbedingungen, Mutanten und Chemikalien verwendet werden, um konkrete Antworten oder Phänotypen zu untersuchen.

Mitochondriale Atmung ist ein biologischer Prozess, in dem Wachstum Kinetik erfolgreich angewendet wurde für die Entdeckung unbekannter Mechanismen. In diesem Fall die Supplementierung von Wachstumsmedien mit nicht vergärbaren Carbon Quellen wie z. B. Glycerin, Lactat oder Ethanol (die ausschließlich durch die mitochondriale Atmung metabolisiert werden), denn die einzige Quelle für Kohlenstoff und Energie ermöglicht eine Bewertung der Atemwege Wachstum, das ist wichtig, um Störungen in Oxidative Phosphorylierung Aktivität¹zu erkennen. Auf der anderen Seite ist es kompliziert, kinetische Wachstumsmodelle als eine Methode für die Entschlüsselung der Mechanismen hinter Gärung zu verwenden.

Das Studium der Gärung und die mitochondriale Atmung ist wichtig, die molekularen Mechanismen hinter bestimmten Phänotypen wie der Crabtree und Warburg Effekte^2,3aufzuklären. Die Crabtree-Effekt zeichnet sich durch eine Steigerung der glykolytischen Flussmittel, Unterdrückung der mitochondrialen Atmung und Einrichtung der Gärung als der primäre Weg zum ATP in Gegenwart von hohen Konzentrationen von vergärbare Kohlenhydrate generieren (> 0,8 mM)^4,5. Die Warburg-Effekt ist metabolisch analog zu der Crabtree-Effekt, mit dem Unterschied, dass in Säugerzellen, das Hauptprodukt der Gärung Laktat⁶ist. In der Tat ist der Warburg-Effekt durch eine Vielzahl von Krebszellen auslösen Glukoseaufnahme und Verbrauch auch in Gegenwart von Sauerstoff⁷ausgestellt. Dabei hat untersuchen die Molekulare Grundlagen der die Umstellung von Atmung auf Gärung in der Crabtree-Effekt biotechnologische folgen (für Ethanol-Produktion) und mögliche Auswirkungen in der Krebsforschung.

S. Cerevisiae Wachstum möglicherweise ein geeignetes Instrument zur Untersuchung der Auswirkungen von Crabtree und Warburg. Diese Idee ist, dass in der Hefe exponentielle Phase, die zentrale Wege verwendet, um ATP zu produzieren sind mitochondriale Atmung und Gärung, die wesentlich für nachhaltiges Wachstum. Zum Beispiel ist das Wachstum von S. Cerevisiae die Funktion der ATP-Erzeugung Bahnen eng verwandt. In S. Cerevisiae, die mitochondriale Atmung produziert ca. 18 ATP-Moleküle pro Glucose-Molekül während der Gärung nur 2 ATP-Moleküle erzeugt wird daher erwartet, dass die Wachstumsrate enge Verbindungen mit der Stoffwechselwege hat Herstellung von ATP⁸. In diesem Zusammenhang bei der Gärung ist der Hauptweg, ATP zu generieren, kompensiert die Hefe die geringe ATP-Produktion durch Erhöhung der Glukoseaufnahme. Im Gegenteil, ist der Glukose-Verbrauch von Hefezellen, die mitochondriale Atmung als die Hauptquelle der ATP zu verwenden gering. Dies bedeutet, dass es wichtig für die Hefe zu Sinn Kohlenhydrat Verfügbarkeit vor der Entscheidung, wie ATP generiert wird. Daher Glukose Verfügbarkeit spielt eine wichtige Rolle in der Wechsel zwischen Gärung und die mitochondriale Atmung in S. Cerevisiae. In Anwesenheit von hohen Mengen an Glukose bevorzugt die Hefe Gärung als die zentrale Route um ATP zu erzeugen. Interessant ist, wenn die Hefe Gärung ist, bleibt der spezifischen Wachstumsrate maximal. Auf der anderen Seite unter den niedrigen Niveaus von Glukose produziert S. Cerevisiae ATP mitochondriale Atmung mit geringere Wachstumsraten beibehalten. Dabei Unterschiede in der Konzentration von Glukose und die Verwendung von anderen Kohlenstoffquellen induzieren Veränderungen in der Hefe Präferenz zwischen fermentative und Atemwege Wachstum. Unter Berücksichtigung dieser Tatsache mit der exponentiellen Wachstums-Gleichung kann man die biologische Bedeutung der kinetischen Parameter wie die Verdoppelung der Zeit (Dt) und spezifischen Wachstumsrate (µ) erhalten. Zum Beispiel wurden niedrigere µ -Werte gefunden, wenn die Hefe mitochondriale Atmung als primäre Pfad verwendet. Im Gegenteil, fanden sich unter Bedingungen, die Gärung zu begünstigen, höhere µ -Werte. Diese Methode kann verwendet werden, um die wahrscheinlichen Mechanismen von Chemikalien die Gärung und mitochondriale Atmung in Messen S. Cerevisiae.

Das Ziel dieses Papiers ist es, eine Methode basierend auf Wachstum Kinetik für das screening der Auswirkungen einer bestimmten Substanz/Verbindung auf mitochondriale Atmung oder Gärung.

Protokoll

(1) Kultur, Medien und Inokulum Vorbereitung

1. 100 mL 2 % Hefe-Extrakt-Pepton-Traubenzucker (YPD) flüssigen Medium vorbereiten (1 g Hefe-Extrakt, Kasein Pepton, 2 g und 2 g Glucose in 100 mL destilliertem Wasser hinzufügen). 3 mL der Medien in 15 mL sterilisierbare konische Rohre zu verzichten. Autoklaven der Medien für 15 min bei 121 ° C und 1,5 Psi.
   Hinweis: Der Datenträger kann bis zu einem Monat bei 4 – 8 ° c aufbewahrt werden
2. Impfen Sie eine konische Rohr gefüllt mit 3 mL cool steril 2 % YPD Brühe mit 250 μL von S. Cerevisiae Zellen erhalten in Glycerin bei-20 ° C. Über Nacht in einem Orbitalschüttler bei 30 ° C unter Rühren bei 200 u/min inkubieren.
3. Streifen einer Petrischale (60 x 15 mm²) mit sterilen 2 % YPD Agar gefüllt (10 g Hefe-Extrakt, 20 g Casein Pepton, 20 g Glukose, und 20 g bakteriologische Agar auf 1.000 mL destilliertem Wasser hinzufügen) mit den Zellen in das konische Rohr mit einer sterilen Schleife angebaut. Inkubieren Sie die Petrischale bei 30 ° C, bis die isolierte Kolonien Wachstum zeigen.
4. Bereiten Sie das Pre-Inokulum durch impfen eine einzelne isolierte Kolonie in einem konischen Rohr gefüllt mit 10 mL cool steril 2 % YPD Brühe und inkubieren Sie es über Nacht bei 30 ° C mit kontinuierliche Agitation bei 200 u/min.

(2) Kultur, Medien und Wachstumskurven in Mikrotestplatte

1. 10 mL von 1 % YPD Brühe vorbereiten (0,1 g Hefe-Extrakt, 0,2 g Pepton, und 0,1 g Glukose auf 10 mL destilliertem Wasser hinzufügen), 10 mL 2 % YPD Brühe (0,1 g Hefe-Extrakt, 0,2 g Pepton, und 0,2 g Glukose auf 10 mL destilliertem Wasser hinzufügen) , und 10 mL 10 % YPD Brühe (0,1 g Hefe-Extrakt, 0,2 g Pepton, und 1 g Glukose zu 10 mL destilliertem Wasser hinzufügen). Autoklaven diese Wachstum Medien für 15 min bei 121 ° C und 1,5 Psi.
   Hinweis: Die Nährmedien dient zur Kontrolle der fermentativen Wachstum.
2. 2 % Hefe-Extrakt-Pepton-Ethanol (YP) Brühe 10 mL und 10 mL 2 % Hefe-Extrakt-Pepton-Glycerin (YPG) Brühe vorbereiten. 2 % YPE: 0,1 g Hefe-Extrakt, 0,2 g Pepton, und 0,2 mL Ethanol, 10 mL destilliertem Wasser hinzufügen. 2 % YPG: 0,1 g Hefe-Extrakt, 0,2 g Pepton, und 0,2 mL Glycerin zu 10 mL destilliertem Wasser hinzufügen. Autoklaven diese Wachstum Medien für 15 min bei 121 ° C und 1,5 Psi.
   Hinweis: Glycerin und Ethanol sind nicht vergärbaren Kohlenstoffquellen, die ausschließlich durch die mitochondriale Atmung metabolisiert werden. Aus diesem Grund werden sie als eine respiratorische Wachstum-Steuerelemente verwendet. In diesem Schritt können die Art und Konzentration der Kohlenstoffquelle in den Kulturmedien geändert werden, um die Auswirkungen auf Wachstum Phänotyp mit Hefe-Extrakt-Pepton (YP) Brühe (10 g Hefeextrakt und 20 g Casein Pepton in 1.000 mL destilliertem Wasser) als Basis zu testen. Um die Effekte von anderen Nährstoffen neben Kohlenstoff zu testen, wird synthetisches komplettes (SC) Medium nach dem Ziel des Experiments ergänzt. Die Basis für SC-Medium ist 1,8 g Hefe Stickstoff Basis ohne Aminosäuren, 5 g Ammoniumsulfat [(NH₄)₂SO₄], Mononatrium-Phosphat (NaH₂PO₄) 1,4 g und 2 g Drop-Out in 1.000 mL destilliertem Wasser mischen. Die Medien mit einer Kohlenstoffquelle und zusätzliche Stickstoffquelle in den erforderlichen Konzentrationen zu ergänzen.
3. Fügen Sie 145 μL der geeignete Kulturmedien für experimentelles Design in jede Vertiefung eine sterile Mikrotestplatte (10 x 10-Well) mit Deckel und mit 5 μL des Inokulums Pre zu impfen.
   Hinweis: Wenn das Ziel ist den Einfluss der Stoffe/Verbindungen auf den Energiestoffwechsel der Hefe auf den Bildschirm, sollte diese Substanz/Verbindung während dieses Schritts hinzugefügt werden. Darüber hinaus sollte jede Art von Mikrotestplatte mit Deckel nützlich sein.
4. Inkubieren Sie die Multi-well-Platte in einem Mikrotestplatte Reader bei 30 ° C mit ständiger Bewegung bei 200 u/min für 48 h Maßnahme die optische Dichte (OD) bei 600 nm alle 30 oder 60 Minuten.
   Hinweis: Die Mikrotestplatte Leser die Möglichkeit, die Mikrotestplatte inkubieren nicht kennt, kann in einem Orbitalschüttler zu den gleichen Konditionen zwischen jeder Messung der OD inkubiert werden.

(3) Wachstumskurven in erschüttert konische Flaschen

1. 20 mL konische Flaschen und Autoklaven 4,8 mL geeignete Kulturmedien hinzufügen. Jede Flasche mit 200 μL der Pre-Inokulum Kultur an OD_600nm ~ 2 in kühlen, sterile 2 % YPD Brühe zu impfen. Inkubieren sie bei 30 ° C mit ständiger Bewegung bei 250 u/min für 24 h.
   Hinweis: Ist die Inkubationszeit höher als 24 h, fügen Sie 12 mL geeignete Kulturmedien zu 50 mL konische Flaschen und Autoklaven hinzu. Mit 500 μL des Inokulums Pre zu impfen. Es ist auch wichtig, die fermentative Wachstum (YP-Medien mit 1 %, 2 % oder 10 % Glukose) und Atemwege Wachstum (YP-Medien mit 2 % Glycerin oder Ethanol) zu berücksichtigen.
2. Nehmen Sie 100 μL der erschüttert konischen Kolben Kultur in 900 μl destilliertes Wasser in einem Spektrophotometer Küvette 1 mL verdünnen und vorsichtig mischen durch pipettieren. Messen Sie die OD bei 600 nm mit einem Spektralphotometer alle 2 h. Um die echte OD zu erhalten, Multiplizieren Sie das Ergebnis durch 10.

(4) die Verarbeitung der Daten und Berechnung der kinetischen Parameter

1. Erstellen Sie eine neue Projektdatei in der Statistik-Paket-Software. Im Abschnitt "neue Tabelleund Diagramm" die Option "XY" .
   1. Wählen Sie die Option: "Beginnen Sie mit einer leeren Tabelle" im Abschnitt "Sample-Daten" .
   2. Wählen Sie den Diagrammtyp "Punkte und Verbindungsleitung" . Abschnitt "X" im Segment "Abschnittshäufigkeit für Replikate oder Fehlerwerte" deaktiviert lassen, und in der "Y" Abschnitt wählen Sie die Option: "Geben Sie (10) replizieren Werte in nebeneinander abschnittshäufigkeit und des Grundstückes bedeuten und Fehler SD". Klicken Sie auf die Schaltfläche "erstellen".
      Hinweis: Das Tabellenformat hat eine X-Spalte und mehrere Y-Spalten, jeweils mit 10 abschnittshäufigkeit, die zuvor ausgewählt.
2. Schreiben Sie das Mal auf welche OD Messungen in der X-Spalte durchgeführt wurden (z. B. 0, 30, 60, 90 min. oder 0, 1, 1,5, 2 h). Schreiben Sie in den Spalten Y die OD-Werte aus den Kulturen gewonnen.
3. Identifizieren der exponentiellen Wachstumsphase Y Spaltendaten in Logarithmen zu verwandeln. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Analysieren" , wählen die "Transform" Analyse, Y-Werte mit Y = Log(Y). Gehen Sie in die "Galerie der Ergebnisse", wählen Sie "Transform" Datentabelle, klicken Sie auf die Schaltfläche "Analysieren" , und wählen Sie "lineare Regressionsanalyse". Schließen Sie die OD-Werte, die kein lineares Verhalten folgen. Um Werte auszuschließen, wählen sie in der Datentabelle und geben Sie "STRG + E".
   Hinweis: Es ist wichtig, um Werte auszuschließen, die nicht die exponentielle Phase folgen, da die exponentielle Wachstum Gleichung gut zu der exponentiellen Phase passt.
4. In der "Galerie Datentabellen"wählen Sie die Datentabelle "Data 1". Klicken Sie auf die Schaltfläche "Analysieren" und wählen Sie die "Nicht-lineare (Fit Kurve)" Regressionsanalyse unter "XY-Analysen".
5. Wählen Sie die Datensätze zu analysieren, und klicken Sie auf die Schaltfläche "OK" . Wählen Sie im Register "Fit" Abschnitt "Exponentielle Gleichung" und dann "exponentielles Wachstum Gleichung" (, wo X Zellkonzentration, X₀ ist Zellkonzentration Zeitpunkt Null μ ist der spezifischen Wachstumsrate, und t ist Zeit). Verwenden Sie der "kleinsten Quadrate passen" , als eine passende Methode und lassen Sie nicht ausgewählten Abschnitt "interpolieren". Klicken Sie auf die Schaltfläche "OK" .
   Hinweis: Die Registerkarte mit den nicht-linearen Fit Ergebnissen ist in der "Galerie der Ergebnisse". Die Software berechnet die doppelte Zeit (Dt) und spezifische Wachstumsrate (μ). Die Software zeigt μ als K in der Registerkarte "Ergebnisse".
6. Öffnen Sie eine neue Projektdatei enthält, und wählen Sie im Abschnitt "neue Tabelle und Diagramm" die Spalte Auswahl. Wählen Sie die Option "Beginnen Sie mit einer leeren Tabelle" und wählen Sie die gewünschte Grafik. Wählen Sie den Mittelwert mit der SD. Wählen Sie die Schaltfläche "Erstellen" Plotten.
7. Kopieren Sie μ oder Dt -Werte aus der Registerkarte nichtlineare Fit Ergebnisse, die in der "Galerie der Ergebnisse" ist und fügen Sie sie in einer Spalte. Schließlich wählen Sie die Schaltfläche "Analysieren" und wählen Sie die gewünschte Analyse im Abschnitt "Spalte Analysen" , die kinetischen Parameter der verschiedenen nutrimental Bedingungen zu vergleichen.
   Hinweis: Die kinetischen Parameter aus der fermentativen Wachstum Steuerelemente (YP-Medien mit 1 %, 2 % oder 10 % Glukose) und Atemwege Wachstum Steuerelemente (YP-Medien mit 2 % Glycerin oder Ethanol) hilft die Schwelle der fermentativen und mitochondriale Atmung zu etablieren, bzw.. Vergleich der kinetischen Parameter vom Ernährungszustand und Substanz/Verbindung mit dem Atmungs- und fermentative Wachstum untersucht identifizieren die möglichen Auswirkungen auf die Atemwege oder fermentativer Stoffwechsel.

Ergebnisse

Wachstumskurven lässt sich vorläufig zwischen Atem- und fermentative Phänotypen in der Hefe S. Cerevisiae zu unterscheiden. Daher führten wir Batch Kulturen von S. Cerevisiae (BY4742) mit verschiedenen Glukosekonzentration, die fermentative Wachstum induzieren gemeldet wurden: 1 %, 2 % und 10 % (w/V)⁹. Zeigt einen fermentativen Phänotyp Kulturen haben eine kleine Verzögerung und eine exponentielle Phase mit einer hohen Wachstumsrate (

Diskussion

Eine lange Zeit ist vergangen, seit J. Monod¹⁰ zum Ausdruck gebracht, dass die Untersuchung des Wachstums von Bakterienkulturen die grundlegende Methode der Mikrobiologie. Das Aufkommen der Molekulare Werkzeuge verzögert die Nutzung und das Studium des Wachstums als eine Technik. Trotz der Komplexität des Wachstums die zahlreichen miteinander verbundenen Prozesse umfasst, können die zugrunde liegenden Mechanismen mithilfe mathematischer Modelle¹¹beschrieben werden. Dies ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orbital Shaker	Thermo Scientific	4353	For inoculum incubation or conical fask cultures
Bioscreen	Growth curves	C MBR	For batch cultures in microplates
Glucose	Sigma	G7021	For YPD broth preparation
Peptone from casein, enzymatic digest	Sigma	82303	For YPD broth preparation
Yeast extract	Sigma	09182-1KG-F	For YPD broth preparation
Bacteriological Agar	Sigma	A5306	For YPD agar preparation
NaH2PO4	Sigma	S8282	For SC broth preparation
(NH4)2SO4	Sigma	A4418	For SC broth preparation
Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate	Sigma	Y1251	For SC broth preparation
Yeast synthetic drop-Out medium supplements	Sigma	Y1501	For SC broth preparation
Ammonium sulfate granular	J.T. Baker	0792-R	For medium supplementation example
Resveratrol	Sigma	R5010	For medium supplementation example
Galactose	Sigma	G8270	For medium supplementation example
Sucrose	Sigma	S7903	For medium supplementation example
Absolut ethanol	Merck	107017	For medium supplementation example
Glycerol	J.T. Baker	2136-01	For medium supplementation example
GraphPad Prism	GraphPad Software		For data analysis
Honeycomb microplates	Thermo Scientific	9502550	For microplate cultures