שמר האפייה קינטיקה גידול אקספוננציאלי בתרבות אצווה כדי לנתח את חילוף החומרים הנשימה ואת Fermentative

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את חילוף החומרים בדרכי הנשימה, fermentative על-ידי התאמת הגידול האקספוננציאלי של האפייה למשוואה צמיחה אקספוננציאלית. חישוב הפרמטרים קינטי מאפשר להקרנה של השפעות של חומרים/תרכובות תסיסה או מיטוכונדריאלי נשימה.

Abstract

שמר האפייה תאים בשלב מעריכי לקיים את הצמיחה שלהם על-ידי הפקת ATP באמצעות תסיסה ו/או מיטוכונדריאלי נשימה. ריכוז פחמן בהתססה של מושל בעיקר איך תאי השמרים מייצרים ATP; לפיכך, הוריאציה ברמות פחמימות בהתססה של כוננים חילוף החומרים האנרגטי של cerevisiae ס. מאמר זה מתאר שיטה תפוקה גבוהה המבוססת על צמיחת שמרים מעריכי כדי להעריך את ההשפעות של שינויי ריכוז והטבע של מקור פחמן על חילוף החומרים הנשימה ואת fermentative. הצמיחה של cerevisiae נמדד microplate או מנוער חרוט הבקבוק על-ידי קביעת הצפיפות האופטית (OD)-600 ננומטר. לאחר מכן, עקומת גדילה זה נבנה על ידי OD ההתוויה נגד הזמן, אשר מאפשרת זיהוי ובחירה של שלב מעריכית, והוא מצויד עם המשוואה הגידול האקספוננציאלי לקבל פרמטרים קינטי. שיעורי צמיחה ספציפיים נמוך עם גבוה יותר פעמים ההכפלה בדרך כלל מייצגים גידול בדרכי הנשימה. לעומת זאת, שיעור צמיחה ספציפיים גבוה עם התחתון פעמים ההכפלה מצביעים על צמיחה fermentative. ערכי הסף של הכפלת זמן ושיעור צמיחה ספציפיים מוערך באמצעות מחלות בדרכי הנשימה או fermentative ידועים, כמו פחמן בהתססה של מקורות או ריכוז גבוה של סוכרים בהתססה. זה מתקבל עבור כל זן ספציפי. לבסוף, הפרמטרים קינטי מחושב מושווים עם ערכי סף כדי לקבוע אם השמרים מציגה צמיחה fermentative ו/או בדרכי הנשימה. היתרון של שיטה זו הוא הפשטות היחסית להבנת השפעת תרכובת/חומר על חילוף החומרים fermentative או בדרכי הנשימה. חשוב להדגיש כי הצמיחה היא תהליך ביולוגי מסובכים ומורכבים; לכן, המידע הראשוני של שיטה זו חייבת להיות שחלקית כימות של צריכת החמצן והצטברות תוצרי לוואי תסיסה. ובכך, טכניקה זו יכולה לשמש הקרנה ראשוני של תרכובות/חומרים אשר עשויים להפריע או לשפר את חילוף החומרים fermentative או בדרכי הנשימה.

Introduction

שמר האפייה צמיחה שימש כלי חשוב כדי לזהות עשרות מנגנונים פיזיולוגיים ומולקולרית. צמיחה נמדד בעיקר על ידי שלוש שיטות: טורי דילולים בדיקות ספוט, המושבה יוצרי יחידת ספירה של עקומות גדילה. שיטות אלה ניתן להשתמש לבד או בשילוב עם מגוון רחב של סובסטרטים, תנאים סביבתיים, מוטציות, כימיקלים לחקור תגובות ספציפיות או פנוטיפים.

נשימה מיטוכונדריאלי היא תהליך ביולוגי שבו קינטיקה גידול יושם בהצלחה על גילוי מנגנוני לא ידוע. במקרה זה, תוספת של צמיחה מדיה עם פחמן בהתססה של מקורות כגון גליצרול, לקטאט או אתנול (אשר הם מטבוליזם באופן בלעדי על ידי נשימה מיטוכונדריאלי), כמו המקור פחמן ואנרגיה הבלעדי מאפשר להעריך הצמיחה בדרכי הנשימה, וזה חשוב. לזהות לפליטת זרחון חמצוני פעילות¹. מצד שני, זה מסובך להשתמש גידול קינטית מודלים כשיטה עבור פיענוח המנגנון מאחורי תסיסה.

המחקר של תסיסה ונשימה מיטוכונדריאלי חיונית כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים מאחורי פנוטיפים מסוימים כגון קרבטרי, ורבורג אפקטים^2,3. האפקט קרבטרי מאופיין על ידי גידול של שטף glycolytic, דיכוי של הנשימה מיטוכונדריאלי, ואת הקמתה של תסיסה כנתיב העיקרי ליצירת ATP בנוכחות ריכוזים גבוהים של בהתססה של פחמימות (> ^4,0.8 מ מ)⁵. ורבורג הוא אנלוגי סמויה על אפקט קרבטרי, כאשר ההבדל בכך בתרבית של תאים, המוצר העיקרי של תסיסה הוא לקטט⁶. אכן, ורבורג מוצגת על ידי מגוון של תאים סרטניים, מפעילה ספיגת הגלוקוז וצריכת אפילו בנוכחות חמצן⁷. ובכך, ללמוד את הבסיס המולקולרי של המתג של נשימה כדי תסיסה האפקט קרבטרי יש גם השלכות ביוטכנולוגי (לייצור אתנול) וגם השפעות אפשריות בחקר הסרטן.

Cerevisiae ס הצמיחה עשויה להיות כלי מתאים כדי לחקור את ההשפעות קרבטרי, ורבורג. הרעיון זה מבוסס על העובדה כי בשלב מעריכי שמרים, משעולים המרכזי שימוש להפקת ATP הם נשימה מיטוכונדריאלי, תסיסה, המהווה מרכיב חיוני כדי לקיים את הצמיחה. למשל, הצמיחה של cerevisiae בצורה אינטימית קשורה הפונקציה של מסלולים ליצירת ATP. במולקולות cerevisiae ס, מ- ATP מייצרת כ 18 מיטוכונדריאלי נשימה לכל מולקולת גלוקוז, ואילו תסיסה יחולל רק 2 מולקולות ATP, ומכאן הוא צפוי כי קצב הגידול יש קישורים הדוקים עם משעולים חילוף החומרים הפקת ATP⁸. בהקשר זה, כאשר המסלול העיקרי ליצירת ATP תסיסה, השמרים מפצה על ייצור ATP נמוכה על-ידי הגברת קצב ספיגת הגלוקוז. להפך, צריכת הסוכר על ידי תאי שמרים להשתמש נשימה מיטוכונדריאלי כמקור ATP העיקרי הוא נמוך. אפשרות זו מציינת כי חשוב עבור השמרים ל הגיוני פחמימות זמינות לפני קביעת איך ייווצר ATP. לכן, זמינות גלוקוז ממלא תפקיד חשוב ב הבורר בין תסיסה ונשימה מיטוכונדריאלי ב cerevisiae ס. בנוכחות כמויות גבוהות של גלוקוז, מעדיף השמרים תסיסה כמו הנתיב המרכזי ליצירת ATP. מעניין, השמרים הוא החימוץ, קצב הגידול הספציפי נשמר מקסימום שלה. מצד שני, תחת רמות נמוכות של גלוקוז, cerevisiae ס מייצרת ATP באמצעות נשימה מיטוכונדריאלי, שמירה על שיעורי הצמיחה נמוכה. ובכך, וריאציה בריכוז של גלוקוז ושימוש של מקורות פחמן אחרים לגרום שינויים בהעדפות של השמרים בין צמיחה fermentative, מערכת הנשימה. מאת לוקח בחשבון את העובדה הזו עם המשוואה גידול אקספוננציאלי, הוא יכול להשיג את המשמעות הביולוגית של קינטי פרמטרים כגון הכפלת זמן (Dt) ושיעור צמיחה ספציפיים (ממוצע). לדוגמה, ערכים נמוכים יותר ממוצע נמצאו כאשר השמרים משתמש נשימה מיטוכונדריאלי כנתיב העיקרי. להפך, בתנאים טובה תסיסה, נמצאו ערכים ממוצע גבוהים יותר. מתודולוגיה זו עשוי לשמש כדי למדוד את המנגנונים סביר של כל כימיקלים המשפיעים על תסיסה ונשימה מיטוכונדריאלי ב cerevisiae ס.

מטרת מאמר זה היא להציע שיטה המבוססת על צמיחה קינטיקה לסינון את ההשפעות של תרכובת/חומר נתון על נשימה מיטוכונדריאלי או תסיסה.

Protocol

1. תרבות המדיה והכנות Inoculum

1. להכין 100 מ של 2% תמצית-peptone-dextrose (YPD) שמרים בינוני נוזלי (להוסיף תמצית 1 גר' שמרים, 2 גר' קזאין peptone, ו- 2 גר' גלוקוז ל 100 מ של מים מזוקקים). לוותר על 3 מ"ל של המדיה לתוך צינורות חרוט sterilizable 15 mL. אוטוקלב התקשורת למשך 15 דקות ב 121 מעלות צלזיוס ו 1.5 psi.
   הערה: המדיה ניתן לאחסן עד לחודש ב 4 – 8 ° c
2. לחסן צינור חרוטי מלא עם 3 מ ל מרק YPD 2% סטרילי מגניב עם μL 250 תאים cerevisiae ס המשומרים גליצרול ב-20 ° C. דגירה בין לילה שייקר מסלולית ב 30 ° C עם עצבנות-200 סל ד.
3. פס צלחת פטרי (60 x 15 מ מ²) מלא עם אגר YPD 2% סטרילי (להוסיף 10 גרם של שמרים לחלץ, 20 גר' קזאין peptone, 20 גר' גלוקוז, ו- 20 גרם של אגר בקטריולוגית 1,000 מ של מים מזוקקים) עם תאי גדל בצינור חרוט באמצעות לולאה סטרילי. דגירה הפטרי ב 30 ° C עד מושבות המבודד מראים צמיחה.
4. להכין את inoculum מראש על-ידי מזריקים מושבה מבודד יחיד לתוך צינור חרוטי מלא עם 10 מ ל מרק YPD 2% סטרילי מגניב, דגירה אותו בן לילה ב 30 ° C עם עצבנות רציפה ב 200 סל ד.

2. תרבות ומדיה עקומות גדילה ב- Microplate

1. הכינו 10 מ ל מרק YPD 1% (להוסיף תמצית 0.1 גר' שמרים, 0.2 גר' peptone, ו- 0.1 גר' גלוקוז 10 מ של מים מזוקקים), 10 מ ל מרק YPD 2% (להוסיף תמצית 0.1 גר' שמרים, 0.2 גר' peptone, ו- 0.2 גר' גלוקוז 10 מ של מים מזוקקים) , ו- 10 מ ל 10% YPD מרק (להוסיף תמצית 0.1 גר' שמרים, 0.2 גר' peptone, ו 1 גר' גלוקוז 10 מ של מים מזוקקים). אוטוקלב אלה מדיומים צמיחה למשך 15 דקות ב 121 מעלות צלזיוס ו 1.5 psi.
   הערה: המדיה תרבות משמש פקד של צמיחה fermentative.
2. להכין 10 מ ל 2% שמרים תמצית-peptone-אתנול (לסוג) מרק 10 מ ל 2% שמרים תמצית-peptone-גליצרול (YPG) מרק. 2% לסוג: להוסיף 0.1 גר' שמרים לחלץ, 0.2 גר' peptone, ו- 0.2 מ"ל אתנול ל 10 מ ל מים מזוקקים. 2% YPG: להוסיף תמצית 0.1 גר' שמרים, 0.2 גר' peptone, ו- 0.2 מ"ל של גליצרול 10 מ של מים מזוקקים. אוטוקלב אלה מדיומים צמיחה למשך 15 דקות ב 121 מעלות צלזיוס ו 1.5 psi.
   הערה: גליצרול ואתנול הם מקורות פחמן בהתססה של זה הן מטבוליזם באופן בלעדי על ידי נשימה מיטוכונדריאלי. מסיבה זו, הם משמשים כפקדי גידול בדרכי הנשימה. בשלב זה, ניתן לשנות את סוג ואת ריכוז פחמן מקור של תרבות המדיה כדי לבחון את ההשפעה על פנוטיפ צמיחה באמצעות שמרים תמצית-peptone (YP) מרק (10 גרם של תמצית שמרים וכ 20 גר' קזאין peptone ב 1,000 מ ל מים מזוקקים) כבסיס. כדי לבדוק את ההשפעות של מזינים אחרים מלבד פחמן, סינתטי מלא בינוני (SC) הוא בתוספת לפי מטרת הניסוי. הבסיס SC בינוני הוא 1.8 גרם שמרים חנקן הבסיס ללא חומצות אמינו, 5 g של אמוניום סולפט [(NH₄)₂אז₄], 1.4 גרם מונוסודיום פוספט (NaH₂PO₄), 2 גר' הנשירה לערבב 1,000 מ ל מים מזוקקים. תוספת התקשורת עם מקור פחמן, חנקן נוספים מקור בבית הריכוזים הדרוש.
3. להוסיף μL 145 מתאימים תרבות התקשורת על עיצוב ניסיוני כל טוב של microplate סטרילי (10 x 10-טוב) עם מכסה, לחסן אותם עם μL 5 של inoculum מראש.
   הערה: אם המטרה היא למסך את השפעת חומרים/תרכובות על חילוף החומרים האנרגטי של השמרים, החומר/המתחם צריך להוסיף במהלך שלב זה. בנוסף, כל סוג של microplate עם מכסה צריך להיות שימושי.
4. דגירה את הצלחת רב טוב בקורא microplate ב 30 ° C עם עצבנות מתמדת על סל ד 200 עבור 48 ה מדד הצפיפות האופטית (OD)-600 nm כל 30 או 60 דקות.
   הערה: אם הקורא microplate אין אפשרות דגירה של microplate, זה עשוי להיות מודגרות ב שייקר מסלולית-באותם התנאים בין כל מדידה של OD.

3. עקומות גדילה מזועזעת מבחנות חרוט

1. להוסיף 4.8 מ של התקשורת תרבות מתאימים מבחנות חרוט 20 מ"ל של החיטוי. לחסן כל הבקבוק עם 200 μL של התרבות inoculum טרום-OD_600nm ~ 2 במרק YPD 2% מגניב, סטרילי. דגירה אותם ב 30 ° C עם עצבנות מתמדת-250 סל"ד במשך 24 שעות ביממה.
   הערה: אם תקופת הדגירה הוא גבוה יותר מאשר 24 שעות ביממה, להוסיף 12 מ של התקשורת תרבות מתאימים מבחנות חרוט 50 מ ל, תא לחץ. לחסן אותם עם 500 μL של inoculum מראש. חשוב גם לקחת בחשבון פקדי צמיחה fermentative (מדיה YP עם 1%, 2% או 10% גלוקוז) ופקדי צמיחה הנשימה (YP מדיה עם 2% גליצרול או אתנול).
2. קח 100 μL של התרבות הבקבוק חרוט מזועזעת למהול אותו ב- 900 μL של מים מזוקקים ב cuvette ספקטרופוטומטרים 1 מ"ל ו לערבב בעדינות על ידי pipetting. למדוד את יתר על 600 nm באמצעות ספקטרופוטומטרים כל שעתיים. כדי לקבל את יתר אמיתית, הכפל את התוצאה ב-10.

4. עיבוד נתונים וחישוב פרמטרים קינטי

1. צור קובץ פרוייקט חדש בתוכנה סטטיסטית החבילה. בסעיף של "טבלה חדשה, גרף", בחר באפשרות "XY" .
   1. בחר באפשרות: "התחל עם טבלת נתונים ריק" במדור "נתונים לדוגמה" .
   2. בחר את סוג הגרף "נקודות, קו מחבר" . להשאיר את הסעיף "X" נבחר בקטע של "Subcolumns משכפל או ערכי שגיאה" ובחרו ב- "Y" סעיף האפשרות: "הזן ערכים שכפל (10) לצד subcolumns, עלילה Mean ו SD שגיאה". לחץ על לחצן צור.
      הערה: עיצוב הטבלה יש עמודה אחת X ו Y מספר עמודות, ולכל אחד יש subcolumns 10 שבחרת בעבר.
2. כתיבה הזמן-OD אשר נלקחו מידות בעמודה X (למשל, 0, 30, 60, 90 דקות או 0, 1, 1.5, 2 h). בעמודות Y, לכתוב את הערכים OD המתקבל התרבויות.
3. לזהות את שלב הגידול המעריכי להפוך הנתונים של עמודת Y לוגריתמים. לחץ על לחצן 'נתח' , בחר את הניתוח "להמיר" , בחר ערכי Y באמצעות Y = Log(Y). ללכת "גלריה של תוצאות", בחר "להמיר" טבלת נתונים, לחץ על לחצן 'נתח' , ובחרו את הניתוח "רגרסיה לינארית" . לא לכלול את הערכים OD אחרי התנהגות ליניארי. כדי לא לכלול ערכים, בחר אותם בטבלה נתונים והקלד "Ctrl + E.
   הערה: חשוב לא לכלול את הערכים אחרי השלב מעריכי מאז המשוואה הגידול האקספוננציאלי משתלב היטב שלב מעריכית.
4. 'גלריית טבלאות נתונים', בחר את טבלת הנתונים "נתונים 1". לחץ על לחצן 'נתח' ובחרו את ניתוח "רגרסיה לא ליניארית (עקומת התאמה)" בין הניתוחים"XY".
5. בחר ערכות הנתונים כדי לנתח, ולחץ על הלחצן "אישור" . בכרטיסיה "מתאים" בחר בסעיף "משוואה מעריכית" ובחר "צמיחה אקספוננציאלית משוואה" (, כאשר X הוא ריכוז תא, X₀ הוא התא ריכוז בזמן אפס, μ הוא שיעור צמיחה ספציפיים ו- t הוא הזמן). להשתמש את "שיטת הריבועים הפחותים מתאים" כשיטה התאמה ולהשאיר שלא נבחרו בסעיף interpolate. לחץ על הלחצן "אישור" .
   הערה: הכרטיסיה עם התוצאות בכושר לא לינארית היא "גלריה של תוצאות". התוכנה מחשבת ההכפלה (Dt) וזמן ספציפי שיעור הצמיחה (μ). התוכנה מציגה μ כמו K בכרטיסיה ' תוצאות '.
6. פתח קובץ פרוייקט חדש, ובחר במקטע "טבלה חדשה, גרף" , הבחירה עמודה. בחר את האפשרות "התחל עם טבלת נתונים ריק" , בחר את התרשים הרצוי. לבחור מגרש הממוצע עם SD. בחר לחצן "צור" .
7. העתק את μ או ערכים Dt מהכרטיסיה תוצאות בכושר לא לינארית כי הוא "גלריה של תוצאות" ולהדביק אותם בעמודה. לבסוף, בחר בלחצן ' 'נתח' ' ובחרו ' הניתוח הרצוי בסעיף "טור ניתוחים" כדי להשוות את הפרמטרים קינטי של התנאים nutrimental שונים.
   הערה: הפרמטרים קינטי המתקבל הפקדים צמיחה fermentative (מדיה YP עם 1%, 2% או 10% גלוקוז) ומסייע צמיחה הנשימה פקדים (YP מדיה עם 2% גליצרול או אתנול) להקים את הסף של fermentative ו מיטוכונדריאלי הנשימה בהתאמה. השוואת קינטי את הפרמטרים מצב תזונתי, חומר/מתחם לבדיקה עם הגידול בדרכי הנשימה, fermentative לסייע בזיהוי להשפעה אפשרית על חילוף החומרים בדרכי הנשימה או fermentative.

תוצאות

עקומות גדילה יכול לשמש preliminarily להפלות בין פנוטיפים הנשימה ו fermentative ב ס cerevisiae השמרים. לכן, ביצענו תרבויות אצווה של cerevisiae ס (BY4742) עם ריכוזי גלוקוז שונים דווח כי כדי לגרום לצמיחה fermentative: 1%, 2% ו- 10% (w/v)⁹. תרבויות מציג הפנוטיפ fermentative שלב פיגור קטן ויש שלב מערי...

Discussion

זמן רב עבר מאז ומונו ג'¹⁰ הביעו כי המחקר של הצמיחה של חיידקים תרבויות היא השיטה הבסיסית של מיקרוביולוגיה. כניסתו של הכלים מולקולרית מעכב את השימוש והלימוד של הגידול כמו טכניקה. למרות המורכבות של צמיחה אשר מערבת תהליכים לתקצב רבים, מנגנוני הבסיסית שלה יכולה להיות מתוארת באמצעות...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orbital Shaker	Thermo Scientific	4353	For inoculum incubation or conical fask cultures
Bioscreen	Growth curves	C MBR	For batch cultures in microplates
Glucose	Sigma	G7021	For YPD broth preparation
Peptone from casein, enzymatic digest	Sigma	82303	For YPD broth preparation
Yeast extract	Sigma	09182-1KG-F	For YPD broth preparation
Bacteriological Agar	Sigma	A5306	For YPD agar preparation
NaH2PO4	Sigma	S8282	For SC broth preparation
(NH4)2SO4	Sigma	A4418	For SC broth preparation
Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate	Sigma	Y1251	For SC broth preparation
Yeast synthetic drop-Out medium supplements	Sigma	Y1501	For SC broth preparation
Ammonium sulfate granular	J.T. Baker	0792-R	For medium supplementation example
Resveratrol	Sigma	R5010	For medium supplementation example
Galactose	Sigma	G8270	For medium supplementation example
Sucrose	Sigma	S7903	For medium supplementation example
Absolut ethanol	Merck	107017	For medium supplementation example
Glycerol	J.T. Baker	2136-01	For medium supplementation example
GraphPad Prism	GraphPad Software		For data analysis
Honeycomb microplates	Thermo Scientific	9502550	For microplate cultures