Saccharomyces cerevisiae Cinética de crescimento exponencial na cultura de lote para analisar o metabolismo respiratório e fermentação

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo para estimar o metabolismo respiratório e fermentativa por encaixe o crescimento exponencial de Saccharomyces cerevisiae para a equação de crescimento exponencial. Cálculo dos parâmetros cinéticos permite o rastreio das influências de substâncias/compostos na fermentação ou respiração mitocondrial.

Resumo

Células de Saccharomyces cerevisiae na fase exponencial sustentam seu crescimento através da produção de ATP através de fermentação e/ou respiração mitocondrial. A concentração de carbono fermentáveis rege principalmente como as células de levedura geram ATP; assim, a variação nos níveis de carboidratos fermentáveis impulsiona o metabolismo energético de S. cerevisiae. Este documento descreve um método de alta produtividade com base no crescimento exponencial de levedura para estimar os efeitos de alterações de concentração e natureza da fonte de carbono no metabolismo respiratório e fermentação. O crescimento de S. cerevisiae é medido em uma microplaca ou abalado cónico balão através da determinação da densidade óptica (OD) em 600 nm. Então, uma curva de crescimento é construída por plotagem OD versus tempo, que permite a identificação e seleção da fase exponencial e é equipado com a equação de crescimento exponencial para obter parâmetros cinéticos. Taxas de crescimento específico baixo com maiores tempos de duplicação geralmente representam um crescimento respiratório. Por outro lado, maiores taxas de crescimento com baixas vezes dobrando indicam crescimento fermentativa. Estimam-se valores de limite de tempo de duplicação da taxa de crescimento específico usando condições respiratórias ou fermentativa bem conhecidas, como fontes de carbono não-açúcares fermentáveis ou altas concentrações de açúcares fermentáveis. Isto é obtido para cada microrganismo específico. Finalmente, os parâmetros cinéticos calculados são comparados com os valores de limiar para estabelecer se a levedura apresenta crescimento fermentativa e/ou respiratório. A vantagem desse método é sua relativa simplicidade para entender os efeitos de um substância/composto no metabolismo fermentativa ou respiratório. É importante salientar que o crescimento é um complexo e intrincado processo biológico; Portanto, dados preliminares deste método devem ser corroborados pela quantificação do consumo de oxigênio e acúmulo de subprodutos da fermentação. Desse modo, esta técnica pode ser usada como uma triagem preliminar de compostos/substâncias que podem perturbar ou realce o metabolismo fermentativa ou respiratório.

Introdução

Crescimento de Saccharomyces cerevisiae tem servido como uma valiosa ferramenta para identificar dezenas de mecanismos fisiológicos e moleculares. Crescimento é medido principalmente por três métodos: diluições em série para testes, unidades formadoras de colônia contando e curvas de crescimento. Estas técnicas podem ser usadas isoladamente ou em combinação com uma variedade de substratos, condições ambientais, mutantes e produtos químicos para investigar respostas específicas ou fenótipos.

Respiração mitocondrial é um processo biológico em que cinética de crescimento tem sido aplicada com sucesso para descobrir mecanismos desconhecidos. Neste caso, a suplementação de meios de crescimento com carbono não-açúcares fermentáveis fontes como glicerol, lactato ou etanol (que são exclusivamente metabolizada pela respiração mitocondrial), como a única fonte de carbono e energia permite avaliar o crescimento respiratório, que é importante para detectar perturbações na fosforilação oxidativa atividade¹. Por outro lado, é complicado de usar modelos de cinética de crescimento como um método para decifrar os mecanismos subjacentes a fermentação.

O estudo da fermentação e respiração mitocondrial é essencial para elucidar os mecanismos moleculares por trás de certos fenótipos como o Crabtree e Warburg efeitos^2,3. O efeito Crabtree é caracterizado por um aumento de fluxo glicolítico, repressão da respiração mitocondrial e estabelecimento de fermentação como o principal caminho para gerar ATP na presença de altas concentrações de carboidratos fermentáveis (> 0,8 mM)^4,5. O efeito Warburg é metabolicamente analógico ao efeito Crabtree, com a diferença sendo que em células de mamíferos, o principal produto da fermentação é lactato⁶. Com efeito, o efeito Warburg é exibido por uma variedade de células cancerosas, provocando a absorção de glicose e de consumo, mesmo na presença de oxigênio⁷. Desse modo, estudar a base molecular do interruptor da respiração para fermentação no efeito Crabtree tem repercussões biotecnológicas (para produção de etanol) e potenciais impactos na pesquisa do câncer.

Crescimento de S. cerevisiae pode ser uma ferramenta adequada para estudar os efeitos de Crabtree e Warburg. Essa ideia é baseada no fato de que na fase exponencial de levedura, as vias centrais usadas para produzir ATP são respiração mitocondrial e a fermentação, que são essenciais para sustentar o crescimento. Por exemplo, o crescimento de S. cerevisiae é intimamente relacionado à função de caminhos de geração de ATP. Em moléculas de S. cerevisiae, o respiração mitocondrial produz aproximadamente 18 ATP por molécula de glicose, Considerando que a fermentação gera apenas 2 moléculas de ATP, portanto, espera-se que a taxa de crescimento tem apertadas ligações com as vias metabólicas produzir ATP⁸. A este respeito, quando a fermentação é a principal rota para gerar ATP, o fermento compensa a baixa produção de ATP, aumentando a taxa de absorção de glicose. Pelo contrário, o consumo de glicose pelas células de fermento que usam a respiração mitocondrial como a principal fonte de ATP é baixo. Isto indica que é importante para o fermento para disponibilidade de carboidratos de sentido antes de determinar como ATP será gerado. Portanto, a disponibilidade de glicose desempenha um papel importante no switch entre fermentação e respiração mitocondrial em S. cerevisiae. Na presença de quantidades elevadas de glicose, a levedura prefere fermentação como a rota central para gerar ATP. Curiosamente, quando o fermento é a fermentação, a taxa de crescimento específico é mantida no seu máximo. Por outro lado, sob níveis baixos de glicose, S. cerevisiae produz ATP usando respiração mitocondrial, a manutenção de baixas taxas de crescimento. Desse modo, a variação na concentração de glicose e a utilização de outras fontes de carbono induzir mudanças na preferência da levedura entre crescimento fermentativa e respiratório. Tendo em conta este facto com a equação de crescimento exponencial, pode-se obter o significado biológico de parâmetros cinéticos como a duplicação de tempo (Dt) e a taxa de crescimento específico (µ). Por exemplo, valores mais baixos µ foram encontrados quando a levedura utiliza respiração mitocondrial como o caminho principal. Pelo contrário, sob condições que favorecem a fermentação, foram encontrados valores superiores de µ . Esta metodologia pode ser utilizada para medir os prováveis mecanismos de quaisquer produtos químicos que afetam a fermentação e a respiração mitocondrial em S. cerevisiae.

O objetivo deste trabalho é propor um método baseado na cinética de crescimento para os efeitos de um determinada substância/composto na fermentação ou respiração mitocondrial de triagem.

Protocolo

1. meios de cultura e preparação do inóculo

1. Preparar 100 mL de meio líquido da 2% fermento extrato-peptona-dextrose (YPD) (adicionar 1 g de levedura extrato, 2 g de peptona de caseína, e 2 g de glicose em 100 mL de água destilada). Diluir 3 mL dos meios de comunicação em esterilizáveis tubos cônico de 15 mL. Autoclave a mídia por 15 min a 121 ° C e 1,5 libras por polegada quadrada.
   Nota: A mídia pode ser armazenada por até um mês 4 – 8 ° c.
2. Inocular um tubo cónico cheio com 3 mL de cool caldo YPD 2% estéril com 250 μL de células de S. cerevisiae conservados em glicerol a-20 ° C. Incube durante uma noite em um agitador orbital, a 30 ° C, com agitação a 200 rpm.
3. Raia, uma placa de Petri (60 x 15 mm²) repleto de estéril 2% YPD ágar-ágar (adicionar extrato de 10 g de fermento, 20 g de peptona de caseína, 20 g de glicose, e 20 g de ágar-ágar bacteriológico para 1.000 mL de água destilada) com as células cultivadas no tubo cónico com uma ansa estéril. Incube a placa de Petri a 30 ° C até as colônias isoladas mostram crescimento.
4. Preparar o pre-inóculo por inocular uma única colônia isolada em um tubo cônico cheio com 10 mL de cool caldo YPD 2% estéril e incubá-lo durante a noite a 30 ° C, com agitação contínua a 200 rpm.

2. meios de cultura e curvas de crescimento em microplacas

1. Prepare-se 10 mL de caldo YPD 1% (adicionar 0,1 g de levedura extrato, 0,2 g de peptona, e 0,1 g de glicose a 10 mL de água destilada), 10 mL de caldo YPD de 2% (adicionar 0,1 g de levedura extrato, 0,2 g de peptona, e 0,2 g de glicose a 10 mL de água destilada) e 10 mL de caldo YPD 10% (adicionar 0,1 g de levedura extrato, 0,2 g de peptona, e 1 g de glicose a 10 mL de água destilada). Autoclave estes meios de crescimento para 15 min a 121 ° C e 1,5 libras por polegada quadrada.
   Nota: Os meios de cultura serve como um controle do crescimento de fermentação.
2. Prepare-se 10 mL de caldo de (tipo) de etanol-peptona-extrato de fermento 2% e 10 mL de caldo de (YPG) de glicerol-peptona-extrato de levedura 2%. Para 2% tipo: Adicionar 0,1 g de levedura extrato, 0,2 g de peptona, e 0,2 mL de etanol a 10 mL de água destilada. Para 2% YPG: Adicionar 0,1 g de levedura extrato, 0,2 g de peptona, e 0,2 mL de glicerol a 10 mL de água destilada. Autoclave estes meios de crescimento para 15 min a 121 ° C e 1,5 libras por polegada quadrada.
   Nota: O glicerol e o etanol são fontes de carbono não-açúcares fermentáveis que são exclusivamente metabolizadas pela respiração mitocondrial. Por esta razão, eles são usados como um controles de crescimento respiratória. Nesta etapa, o tipo e a concentração da fonte de carbono nos meios de comunicação de cultura podem ser alteradas para testar os efeitos sobre o fenótipo de crescimento usando fermento extrato-peptona (YP) caldo de carne (10 g de extrato de levedura e 20 g de peptona de caseína em 1.000 mL de água destilada) como base. Para testar os efeitos de outros nutrientes além do carbono, completa sintético (SC) meio é suplementado de acordo com o objetivo do experimento. A base para o meio de SC é 1,8 g de nitrogênio levedura base sem aminoácidos, 5 g de sulfato de amônio [(NH₄)₂SO₄], 1,4 g de fosfato monossódico (NaH₂PO₄), e 2 g de abandono se misturam em 1.000 mL de água destilada. Suplemento a mídia com uma fonte de carbono e fonte de nitrogênio adicional nas concentrações necessárias.
3. Adicionar 145 μL de meios de cultura apropriados para o delineamento de cada poço de uma microplaca esterilizada (10 x 10-bem) com uma tampa e inocular-lhes 5 μL do pre inóculo.
   Nota: Se o objetivo é a tela a influência de substâncias/compostos sobre o metabolismo energético da levedura, essa substância/composto devem ser adicionado durante esta etapa. Além disso, qualquer tipo de microplacas com tampa deve ser útil.
4. Incubar a placa multi bem em um leitor de microplacas a 30 ° C, com agitação constante a 200 rpm por 48 h. medida da densidade óptica (OD) em 600 nm cada 30 ou 60 min.
   Nota: Se o leitor de microplacas não tem a opção para incubar o microplate, podem ser incubada em um agitador orbital nas mesmas condições entre cada medição do OD.

3. crescimento curvas em Matrases abalados

1. Adicione 4,8 mL dos meios de cultura apropriados para autoclave e matrases de 20 mL. Inocule cada frasco com 200 μL da cultura pré-inóculo no OD_600nm ~ 2 em caldo YPD 2% legal, estéril. Incube-os a 30 ° C, com constante agitação a 250 rpm durante 24 h.
   Nota: Se o período de incubação é superior a 24 h, adicione 12 mL dos meios de cultura apropriados para autoclave e matrases de 50 mL. Inocule-lhes com 500 μL do pre inóculo. Também é importante considerar os controles de crescimento fermentativa (mídia YP com 1%, 2% ou 10% de glicose) e controles de crescimento respiratória (mídia YP com 2% de glicerol ou etanol).
2. Levar 100 μL da cultura Erlenmayer abalada e diluí-la em 900 μL de água destilada em um fluorímetro de 1 mL e misture suavemente pipetando. Medir a D.O. a 600 nm, utilizando um espectrofotômetro cada 2 h. Para obter o real OD, multiplique o resultado por 10.

4. processamento de dados e cálculo de parâmetros cinéticos

1. Crie um novo arquivo de projeto do software pacote estatístico. Na seção de "nova tabela e gráfico", escolha a opção "XY" .
   1. Selecione a opção: "Comece com uma tabela de dados vazio" na seção "Dados de amostra" .
   2. Selecione o tipo de gráfico "Pontos e ligação" . Embora a seção de "X" desmarcada no segmento do "Subcolumns para repetições ou valores de erro" e no "Y" seção escolha a opção: "Digite (10) valores replicar em subcolumns lado a lado e plotar a média e o erro SD". Clique no botão criar.
      Nota: O formato de tabela possui uma coluna de X e várias colunas de Y, cada uma com os 10 subcolumns escolhidos anteriormente.
2. Escrever o tempo no qual OD medidas foram feitas na coluna de X (por exemplo, 0, 30, 60, 90 min ou 0, 1, 1,5, 2 h). Nas colunas de Y, escreva os valores de OD obtidos a partir das culturas.
3. Identifica a fase de crescimento exponencial, transformando os dados da coluna de Y em logaritmos. Clique no botão "Analisar" , escolher a análise de "Transformar" , selecione os valores de Y usando Y = Log(Y). Vá para a "Galeria dos resultados", selecione "Transformar" tabela de dados, clique no botão "Analisar" e escolher a análise de "Regressão Linear" . Exclua os valores de OD que não seguem um comportamento linear. Para excluir os valores, selecione-os na tabela de dados e digite "Ctrl + E".
   Nota: É importante excluir os valores que não seguem a fase exponencial, uma vez que a equação de crescimento exponencial se encaixa bem com a fase exponencial.
4. Na "Galeria de tabelas de dados", selecione a tabela de dados "dados 1". Clique no botão "Analisar" e escolher a análise de "Regressão não-linear (ajuste de curva)" entre as análises"XY".
5. Selecione os conjuntos de dados para analisar e clique no botão "Okey" . Na aba "Ajuste" escolher a seção "Equação exponencial" e selecione a "equação de crescimento exponencial" (, onde X é a concentração de células, X₀ é a concentração de células no tempo zero, μ é a taxa de crescimento específico, e t é o tempo). Use o "ajuste de mínimos quadrados" como um método de montagem e deixar desmarcado a seção interpolar. Clique no botão "Okey" .
   Nota: O guia com os resultados de forma não-lineares é na "Galeria dos resultados". O software calcula a duplicação de tempo (Dt) e específicas de taxa de crescimento (μ). O software mostra μ como K , na aba de resultados.
6. Abra um novo arquivo de projeto e na seção "nova tabela e gráfico" , selecione a opção coluna. Escolha a opção "Iniciar com uma tabela de dados vazio" e selecione o gráfico desejado. Escolha para plotar a média com o SD. Selecione o botão "Criar" .
7. Copie o μ ou Dt valores na guia resultados de forma não-linear que é na "Galeria dos resultados" e colá-los em uma coluna. Finalmente, selecione o botão "Analisar" e escolha a análise desejada na seção "Análise da coluna" para comparar os parâmetros cinéticos das diferentes condições nutrimental.
   Nota: Os parâmetros cinéticos Obtém dos controles do crescimento fermentativa (mídia YP com 1%, 2% ou 10% de glicose) e controles de crescimento respiratória (mídia YP com 2% de glicerol ou etanol) ajuda a estabelecer o limite da respiração mitocondrial e fermentativa, respectivamente. Comparando o cinético parâmetros da condição nutricional e analisada com o crescimento de respiratório e fermentativa substância/composto ajudam a identificar o possível efeito sobre o metabolismo respiratório ou fermentativa.

Resultados

Curvas de crescimento podem ser usadas para preliminarmente discriminar entre fenótipos respiratórios e fermentativa em levedura S. cerevisiae . Portanto, foram realizadas culturas de lote de S. cerevisiae (BY4742) com concentrações diferentes de glicose que foram relatadas para induzir o crescimento de fermentação: 1%, 2% e 10% (p/v)⁹. Mostrando um fenótipo fermentativa de culturas têm uma fase de pequeno lag e uma fase exponencial com um...

Discussão

Muito tempo se passou desde que J. Monod¹⁰ expressa que o estudo do crescimento de culturas bacterianas é o método básico de microbiologia. O advento das ferramentas moleculares atrasa o uso e o estudo do crescimento como uma técnica. Apesar da complexidade de crescimento que envolve inúmeros processos inter-relacionados, seus mecanismos subjacentes podem ser descritos usando modelos matemáticos¹¹. Esta é uma abordagem robusta que pode ser usada como uma ferramenta c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orbital Shaker	Thermo Scientific	4353	For inoculum incubation or conical fask cultures
Bioscreen	Growth curves	C MBR	For batch cultures in microplates
Glucose	Sigma	G7021	For YPD broth preparation
Peptone from casein, enzymatic digest	Sigma	82303	For YPD broth preparation
Yeast extract	Sigma	09182-1KG-F	For YPD broth preparation
Bacteriological Agar	Sigma	A5306	For YPD agar preparation
NaH2PO4	Sigma	S8282	For SC broth preparation
(NH4)2SO4	Sigma	A4418	For SC broth preparation
Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate	Sigma	Y1251	For SC broth preparation
Yeast synthetic drop-Out medium supplements	Sigma	Y1501	For SC broth preparation
Ammonium sulfate granular	J.T. Baker	0792-R	For medium supplementation example
Resveratrol	Sigma	R5010	For medium supplementation example
Galactose	Sigma	G8270	For medium supplementation example
Sucrose	Sigma	S7903	For medium supplementation example
Absolut ethanol	Merck	107017	For medium supplementation example
Glycerol	J.T. Baker	2136-01	For medium supplementation example
GraphPad Prism	GraphPad Software		For data analysis
Honeycomb microplates	Thermo Scientific	9502550	For microplate cultures