酵母呼吸と発酵代謝を分析するバッチ文化の指数関数的成長カイネティクス

要約

ここで指数方程式に酵母の急激な成長をあてはめによる呼吸と発酵の代謝を推定するためのプロトコルを提案する.速度論的パラメーターの計算は、発酵やミトコンドリア呼吸に及ぼす物質・化合物のスクリーニングが可能です。

要約

指数段階の酵母細胞が発酵やミトコンドリアの呼吸によって ATP を生産することによって成長を支えます。発酵性の炭素濃度は主に酵母細胞が ATP; を生成する方法を制御します。したがって、発酵性炭水化物含量の変化は、出芽酵母のエネルギー代謝を駆動します。本稿では、濃度の変化の影響と呼吸と発酵の代謝に炭素源の性質を推定する指数の酵母の増殖に基づく高スループット方法について説明します。出芽酵母の成長はマイクロ プレートで測定または円錐動揺 600 の光学濃度 (OD) を決定することによってフラスコ nm。その後、成長曲線は、対指数段階の特定および選定し装備は指数関数的成長方程式運動パラメーターを取得する時間のプロットの OD で組み込まれています。2 倍時間が高い低固有成長率は一般に呼吸成長を表します。逆に、下方の 2 倍の時間で特定の成長率は、発酵の成長を示します。倍加時間と特定の成長率のしきい値は、非発酵性の炭素源や発酵性の糖の高濃度など、よく知られている呼吸または発酵条件を使用して推定されます。これは、各特定の緊張に取得されます。最後に、計算の速度論的パラメーターは、酵母が発酵および/または呼吸の成長を示すかどうかを確立するしきい値と比較されます。この方法の利点は、発酵や呼吸代謝に及ぼす物質/化合物を理解するための相対的なシンプルさです。成長が、複雑な複雑な生物学的プロセスであることを強調することが重要です。したがって、このメソッドからの予備的なデータは、酸素消費量の定量化と発酵副産物の蓄積によって確証する必要があります。これにより、この手法は、邪魔されたり、発酵や呼吸代謝を高める化合物/物質のスクリーニングとして使用できます。

概要

酵母の生育生理・分子機構の多数を識別するために貴重なツールとして務めています。成長は主に 3 つの方法によって測定: スポット テスト、コロニー形成単位のカウントは、成長曲線のシリアル希薄。これらの手法は、特定の応答または表現型を調査する単独または様々 な基板、環境条件、変異体、および化学薬品との組み合わせで使用できます。

ミトコンドリアの呼吸は、成長カイネティクスを未知のメカニズムを発見するため正常に適用されている生物学的プロセスです。この場合、非発酵性の炭素の成長媒体の補充源 (ミトコンドリア呼吸により代謝されて排他的) エタノールや乳酸、グリセロールなどの評価により、カーボンおよびエネルギー源として、呼吸器の成長、酸化的リン酸化アクティビティ¹の摂動を検出することが重要であります。その一方で、発酵の背後にあるメカニズムを解読するための方法として成長速度論的モデルを使用する複雑です。

クラブツリーとウォーバーグの効果^2,3などの特定の表現型の背後にある分子メカニズムを明らかにする発酵とミトコンドリアの呼吸の研究が欠かせません。Crabtree の効果は解糖系フラックスの増加、ミトコンドリア呼吸の抑制、発酵、発酵性炭水化物高濃度の存在下で ATP を生成するための主要な道の確立によって特徴付けられる (>0.8 mM)^4,5。Warburg 効果は、発酵の主な製品は、哺乳類細胞、乳酸⁶されて代謝アナログ違い Crabtree の効果です。確かに、Warburg 効果は、さまざまな癌細胞の糖代謝と酸素⁷存在下でも消費トリガーによって展示されます。これにより、呼吸から発酵 Crabtree の効果への切り替えの分子基盤を勉強 (エタノール生産) のためのバイオ テクノロジーの影響と潜在的な影響の両方にいるがん研究

出芽酵母成長クラブツリーと Warburg 効果を研究する適切なツールがあります。このアイデアは酵母指数段階の ATP を生成するために使用する中央の経路がミトコンドリアの呼吸と発酵が成長を維持するために不可欠であるという事実に基づいています。例えば、酵母の成長は ATP 生成経路の機能に密接に関連しています。出芽酵母は、ミトコンドリア呼吸生成約 18 ATP 分子グルコース分子あたりの発酵だけ 2 ATP 分子を生成するのに対しそれ故にそれは期待成長率が新陳代謝の細道の緊密なリンクを持っていることATP⁸を生産します。この点で、発酵が ATP を生成する主要ルートと、酵母は低 ATP 生産のための糖取り込み率を増加を補正します。逆に、ミトコンドリア呼吸を使用して、ATP の主要な源として酵母細胞でブドウ糖の消費は低いです。これは ATP の生成方法を決定する前に感覚の炭水化物の可用性には、酵母にとって重要だを示します。発酵とミトコンドリア呼吸に切り替えるグルコース可用性が重要な役割を果たしているため、酵母。血糖値の高い量の存在下では、酵母は、ATP 生成に中央ルートとして発酵を好みます。興味深いことに、酵母を発酵すると、比増殖速度は最大限に維持されます。その一方で、ブドウ糖の低レベルで出芽酵母は低い成長率を維持するミトコンドリア呼吸を使用して ATP を生成します。それによって、グルコースと他の炭素源の利用の濃度の変化は発酵と呼吸成長間酵母の嗜好の変化を誘発します。指数方程式のこの事実を考慮して、1 つは倍加時間 (Dt) と特定の成長率 (μ) などの速度論的パラメーターの生物学的意義を取得できます。たとえば、酵母の主要な道としてミトコンドリア呼吸を使用する場合、低いμ値が発見されました。逆に、発酵を支持する条件の下で高いμの値が見つかりました。発酵とミトコンドリア呼吸に影響を与えるすべての化学物質の考えられるメカニズムを測定するこの手法を使用することがあります酵母。

本稿の目的は、ミトコンドリアの呼吸または発酵に及ぼす特定物質/化合物をスクリーニングするための成長速度論に基づく方法を提案することです。

プロトコル

1. 文化メディアと接種材料の準備

1. 2% 酵母エキス ペプトン右旋糖 (YPD) 液体培地の 100 ml (1 グラム酵母エキス、ペプトン、カゼインの 2 g と 2 g のブドウ糖 100 mL に蒸留水を追加)。メディアの 3 mL を 15 mL 滅菌の円錐管に分配します。オートクレーブ 121 ° C および 1.5 psi で 15 分メディア。
   注意: メディアが 4-8 ° C で最大 1 ヶ月間保存できます。
2. グリセロール-20 ° C で保存酵母細胞の 250 μ L とクールな滅菌 2 %ypd スープの 3 ml コニカル チューブに接種します。200 rpm で攪拌と 30 ° C で軌道シェーカーで一晩インキュベートします。
3. ペトリ皿 (60 × 15 mm²) 滅菌 2 %ypd 寒天でいっぱい連勝 (酵母 10 g を抽出、カゼイン ペプトン 20 g、ブドウ糖 20 g、20 g を 1,000 mL の細菌の寒天の蒸留水を追加) 滅菌ループを使って円錐管で育った細胞で。隔離されたコロニーは成長を示すまでは、30 ° C でシャーレを孵化させなさい。
4. クールな滅菌 2 %ypd スープの 10 ml の円錐管に単一の隔離されたコロニーを接種前接種を準備し、200 rpm で連続攪拌 30 ° C で一晩それを孵化させなさい。

2. 文化メディアとマイクロ プレートの成長曲線

1. 1 %ypd 液 10 mL を準備 (0.1 グラム酵母エキス、ペプトン、0.2 g と蒸留水 10 mL にブドウ糖の 0.1 g を追加)、2 %ypd スープ 10 mL (0.1 グラム酵母エキス、ペプトン、0.2 g と蒸留水 10 mL にブドウ糖の 0.2 g を追加)、10 %ypd スープ 10 ml (0.1 グラム酵母エキス、ペプトン、0.2 g と 1 g を 10 mL のブドウ糖の蒸留水を追加)。オートクレーブ 1.5 psi、121 ° C で 15 分間のこれらの成長媒体。
   注: 文化メディア発酵成長のコントロールとして機能します。
2. 2% の酵母エキス ペプトン エタノール (型) 液 10 mL と 2% の酵母エキス ペプトン グリセロール (YPG) 液 10 mL を準備します。2% のタイプ: 0.1 グラム酵母エキス、ペプトン、0.2 g と蒸留水 10 mL にエタノール 0.2 mL を追加。2% の YPG: 0.1 グラム酵母エキス、ペプトン、0.2 g と蒸留水 10 mL にグリセリン 0.2 mL を追加。オートクレーブ 1.5 psi、121 ° C で 15 分間のこれらの成長媒体。
   注: グリセリンとエタノールは、ミトコンドリアの呼吸により代謝されて排他的非発酵性の炭素源です。このため、彼らは呼吸成長コントロールとして使用されます。このステップでは、酵母エキス ペプトン (YP) スープ (10 g 酵母エキスと 1,000 mL の蒸留水でカゼイン ペプトン 20 g) をベースとした成長の表現型に及ぼす影響をテストの種類と培地の炭素源の濃度を変更ことができます。炭素以外の他の栄養素の効果をテストするため、実験の目的によると合成完了 (SC) 培地は補われます。SC 中のベースはアミノ酸、硫酸アンモニウム 5 g なし基本酵母窒素の 1.8 g [(NH₄)₂など₄]、リン酸二水素ナトリウム (NaH₂PO₄) の 1.4 g とドロップ アウトの 2 g を蒸留水 1,000 mL にミックスします。炭素源と必要な濃度の窒素ソース メディアを補足します。
3. フタ付き滅菌マイクロ プレート (10 x 10 も) の各ウェルに実験的なデザインの適切な培地の 145 μ L を追加し、事前接種の 5 μ L とそれらを接種します。
   注: 目的は、酵母のエネルギー代謝に及ぼす物質/化合物をスクリーニングするため、物質/化合物がこのステップの間に追加する必要があります。また、マイクロ プレート、ふた付きの任意の型は役に立つはず。
4. 48 h. メジャー 600 の光学濃度 (OD) の 200 rpm で一定の攪拌と 30 ° C でマイクロ プレート リーダーのウェル プレートを孵化させなさい nm 30 分または 60 分毎。
   注: マイクロ プレート リーダーにマイクロ プレートをインキュベートするオプションが設定されていない場合 OD のすべての測定の間同じ条件で軌道シェーカーで孵化する可能性があります。

3. 成長曲線の三角フラスコを振って

1. 20 mL 三角フラスコとオートクレーブに適した培地の 4.8 mL を追加します。外径_{600 ナノメートル}クールな滅菌の 2 %ypd スープ 〜 2 で事前接種文化 200 μ L を各フラスコを接種します。24 h の 250 rpm で一定の攪拌と 30 ° C でそれらを孵化させなさい。
   注: 潜伏期間が 24 時間よりも高い場合は、50 mL 三角フラスコとオートクレーブに適した培地の 12 mL を追加します。事前接種の 500 μ L とそれらを接種します。また、発酵の成長コントロール (1%、2%、または 10% ブドウ糖と YP メディア) および呼吸成長コントロール (YP メディア 2% グリセロールまたはエタノール) を考慮することが重要です。
2. 動揺円錐フラスコ培養の 100 μ L を取ると蒸留水 1 mL 分光光度計のキュベット、900 μ L で希釈して、軽くピペッティングで混ぜます。600 で外径を測定 nm の吸光度すべて 2 h。本当の OD を得るためには、結果を 10 倍します。

4. データ処理および速度論的パラメーターの計算

1. 統計パッケージ ソフトウェアで新しいプロジェクト ファイルを作成します。「新しいテーブルとグラフ」のセクションでは、下の"XY"を選択してください。
   1. 選択: 「サンプル データ」セクションの"空のデータのテーブルを含むスタート"を。
   2. 「点と線」グラフの種類を選択します。「下位の列をレプリケートまたはエラー値」のセグメントで選択"X"セクションを残すと"Y"セクションを選択: 「並べてサブで (10) 複製値を入力し平均、SD エラー プロット」。[作成] ボタンをクリックします。
      注意: 表形式、X 列が 1 つといくつかの Y 列をそれぞれ以前に選ばれた 10 のサブ。
2. 書き込みが OD で測定された X 列の時間 (例えば0、30、60、90 分または 0, 1, 1.5, 2 h)。Y 列の文化から得られた値を記述します。
3. Y 列データを対数変換指数的な成長フェーズを識別します。「分析」ボタンをクリックして、 「変換」分析を選択、選択 Y を使用して、Y 値 Log(Y) を =。移動「結果のギャラリー」、 「変換」データ テーブルを選択する「分析」ボタンをクリックし、 「線形回帰」の分析を選択します。線形行動に従っていない OD 値を除外します。値を除外するには、データ テーブルでそれらを選択し、 "Ctrl + E"を入力します。
   注: 指数関数的成長方程式指数段階とよくフィットするので指数段階に従っていない値を除外することが重要です。
4. 「データ テーブル ギャラリー」では、データ テーブルを選択"データ 1"。「分析」ボタンをクリックし、 「XY 分析」間「非線形回帰 (カーブ フィット)」の分析を選択します。
5. データを分析し、 "OK"ボタンをクリックを選択します。「フィット」タブで「指数方程式」セクションを選択し、 「急激な成長方程式」を選択 ( Xはセル濃度、 X₀がゼロの時は、 μ に細胞濃度は特定の成長率で、 tは時間)。継ぎ手方法として「最小二乗フィット」を使用し補間セクションを選択されていないまま。「OK」ボタンををクリックしてします。
   注: 非線形フィット結果] タブは、 「結果のギャラリー」です。ソフトウェア計算して 2 倍の時間 (Dt) と固有成長率 (μ)。ソフトウェアは、[結果] タブに、 Kとしてμを示しています。
6. 新しいプロジェクト ファイルを開き、 「新しいテーブルとグラフ」セクション列を選択します。「空のデータのテーブルを開始」オプションを選択し、目的のグラフを選択します。SD は「作成する」ボタン選択平均をプロットするを選択します。
7. 「結果のギャラリー」は、非線形フィット結果] タブからμやDtの値をコピーし、列に貼り付けます。最後に、 「分析」ボタンを選択し、さまざまな nutrimental 条件の速度論的パラメーターを比較する「列解析」セクションで目的解析を選択します。
   注: 速度論的パラメーター発酵成長コントロール (1%、2%、または 10% ブドウ糖と YP メディア) から入手し、呼吸成長コントロール (YP メディア 2% グリセロールまたはエタノール) は発酵とミトコンドリアの呼吸のしきい値を確立するのに役立ちますそれぞれ。運動の比較栄養状態と呼吸と発酵の成長の物質/化合物からのパラメーターは、呼吸または発酵代謝に影響の可能性を識別するのに役立ちます。

結果

成長曲線は、予め酵母酵母の呼吸と発酵の表現型の間で区別する使用できます。したがって、我々 は実行バッチ培養酵母(BY4742) の発酵の成長を誘導するために報告されている別グルコース濃度: 1%, 2%, 10% (w/v)⁹。発酵の表現型を示す文化には、小さな遅れ位相と高い成長率 (図 1) と指数段階があります。乳酸、グリ?...

ディスカッション

J. モノー¹⁰細菌文化の成長の研究、微生物学の基本的な方法を表明した長い時間が経ちました。分子ツールの出現は、使用状況や技術として成長の研究を遅らせます。多数の相互に関連するプロセスを含む成長の複雑さにもかかわらず、内在するメカニズムを数理モデル¹¹を使用して記述できます。これは最も複雑な分子メカニズム¹²を明?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orbital Shaker	Thermo Scientific	4353	For inoculum incubation or conical fask cultures
Bioscreen	Growth curves	C MBR	For batch cultures in microplates
Glucose	Sigma	G7021	For YPD broth preparation
Peptone from casein, enzymatic digest	Sigma	82303	For YPD broth preparation
Yeast extract	Sigma	09182-1KG-F	For YPD broth preparation
Bacteriological Agar	Sigma	A5306	For YPD agar preparation
NaH2PO4	Sigma	S8282	For SC broth preparation
(NH4)2SO4	Sigma	A4418	For SC broth preparation
Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate	Sigma	Y1251	For SC broth preparation
Yeast synthetic drop-Out medium supplements	Sigma	Y1501	For SC broth preparation
Ammonium sulfate granular	J.T. Baker	0792-R	For medium supplementation example
Resveratrol	Sigma	R5010	For medium supplementation example
Galactose	Sigma	G8270	For medium supplementation example
Sucrose	Sigma	S7903	For medium supplementation example
Absolut ethanol	Merck	107017	For medium supplementation example
Glycerol	J.T. Baker	2136-01	For medium supplementation example
GraphPad Prism	GraphPad Software		For data analysis
Honeycomb microplates	Thermo Scientific	9502550	For microplate cultures