Saccharomyces cerevisiae Cinétique de croissance exponentielle en Culture pour analyser le métabolisme respiratoire et fermentatif

Résumé

Nous présentons ici un protocole afin d’évaluer le métabolisme respiratoire et fermentatif en ajustant la croissance exponentielle des Saccharomyces cerevisiae à l’équation de croissance exponentielle. Calcul des paramètres cinétiques permet le dépistage des influences de substances/composés sur la fermentation ou la respiration mitochondriale.

Résumé

Cellules de Saccharomyces cerevisiae en phase exponentielle soutiennent leur croissance par la production d’ATP par fermentation ou la respiration mitochondriale. La concentration de carbone fermentescibles principalement régit la façon dont les cellules de levure génèrent de l’ATP ; ainsi, la variation des niveaux de glucides fermentescibles lecteurs le métabolisme énergétique de S. cerevisiae. Cet article décrit une méthode de haut débit basée sur la croissance exponentielle de levure pour estimer les effets des changements de concentration et la nature de la source de carbone sur le métabolisme respiratoire et fermentatif. La croissance de S. cerevisiae est mesurée dans une microplaque ou secouée conique fiole par la détermination de la densité optique (do) à 600 nm. Ensuite, une courbe de croissance est construite par traçage OD par rapport au temps, qui permet l’identification et la sélection de la phase exponentielle et est équipé de l’équation exponentielle pour obtenir des paramètres cinétiques. Les taux de croissance spécifique faible avec des temps de doublement supérieurs représentent généralement une croissance respiratoire. À l’inverse, des taux plus élevés de croissance spécifique avec des temps de doublement inférieurs indiquent une croissance fermentaire. Seuils de doubler le temps et le taux de croissance spécifique sont estimées à l’aide de conditions respiratoires ou fermentatives bien connues, telles que les sources de carbone non fermentescibles ou des concentrations plus élevées de sucres fermentescibles. Ceci est obtenu pour chaque souche spécifique. Enfin, les paramètres cinétiques calculées sont comparées avec les valeurs de seuil pour établir si la levure montre la croissance fermentaire et/ou respiratoire. L’avantage de cette méthode est sa relative simplicité pour comprendre les effets d’un substance/composé sur le métabolisme fermentaire ou respiratoire. Il est important de souligner que la croissance est un processus biologique complexe et complex ; par conséquent, les données préliminaires de cette méthode doivent être corroborées par la quantification de la consommation d’oxygène et l’accumulation des sous-produits de la fermentation. Ainsi, cette technique peut servir comme un examen préliminaire des composés/substances susceptibles de déranger ou améliorer le métabolisme fermentaire ou respiratoire.

Introduction

Croissance de Saccharomyces cerevisiae a été un outil précieux pour identifier des dizaines de mécanismes physiologiques et moléculaires. La croissance est mesurée principalement par trois méthodes : dilutions en série pour spot test, unité formant colonie comptant et courbes de croissance. Ces techniques peuvent servir seul ou en combinaison avec une variété de substrats, les conditions environnementales, des mutants et produits chimiques pour l’étude des réponses spécifiques ou phénotypes.

La respiration mitochondriale est un processus biologique dans lequel cinétique de croissance a été appliquée avec succès pour découvrir les mécanismes inconnus. Dans ce cas, lorsqu’il s’agit de milieux de culture avec carbone non fermentescibles sources tels que le glycérol, lactate ou éthanol (qui sont exclusivement métabolisé par la respiration mitochondriale), car la seule source de carbone et d’énergie permet d’évaluer la croissance respiratoire, ce qui est importante de détecter les perturbations dans la phosphorylation oxydative activité¹. En revanche, c’est compliqué à utiliser des modèles cinétiques de croissance comme méthode pour décrypter les mécanismes derrière la fermentation.

L’étude de la fermentation et de la respiration mitochondriale est essentiel afin d’élucider les mécanismes moléculaires derrière certains phénotypes comme le Crabtree et Warburg effets^2,3. L’effet Crabtree est caractérisée par une augmentation du flux glycolytique, répression de la respiration mitochondriale et mise en place de la fermentation comme la voie principale pour générer de l’ATP en présence de fortes concentrations de glucides fermentescibles (> 0,8 mM)^4,5. L’effet Warburg est métaboliquement analogue à l’effet Crabtree, la différence étant que dans les cellules de mammifères, le principal produit de fermentation est lactate⁶. En effet, l’effet Warburg est illustré par une variété de cellules cancéreuses, déclenchant l’absorption du glucose et la consommation, même en présence d’oxygène⁷. Ainsi, étudier la base moléculaire du passage de la respiration à la fermentation dans l’effet Crabtree possède des répercussions biotechnologiques (pour la production d’éthanol) et impacts potentiels en recherche sur le cancer.

La croissance de S. cerevisiae peut être un outil approprié pour étudier les effets de Crabtree et Warburg. Cette idée est fondée sur le fait que dans la phase exponentielle de la levure, les voies centrales utilisées pour produire de l’ATP sont la respiration mitochondriale et la fermentation, qui sont essentielles pour soutenir la croissance. Par exemple, la croissance de S. cerevisiae est intimement liée à la fonction des voies génératrices de ATP. Dans les molécules de S. cerevisiae, la respiration mitochondriale produit environ 18 ATP par molécule de glucose, alors que la fermentation ne génère que 2 molécules d’ATP, donc il est prévu que le taux de croissance a des liens serrés avec les voies métaboliques production d’ATP,⁸. À cet égard, lorsque la fermentation est la principale voie pour générer de l’ATP, la levure compense la faible production d’ATP en augmentant le taux d’absorption du glucose. Au contraire, la consommation de glucose par les cellules de levure qui utilisent la respiration mitochondriale comme la principale source d’ATP est faible. Cela indique qu’il est important pour la levure pour la disponibilité de glucides sens avant de déterminer comment ATP sera généré. Par conséquent, la disponibilité de glucose joue un rôle important dans le commutateur entre la fermentation et de la respiration mitochondriale dans S. cerevisiae. En présence de quantités élevées de glucose, la levure préfère fermentation comme la voie centrale pour générer de l’ATP. Fait intéressant, lorsque la levure est en train de fermenter, le taux de croissance spécifique est maintenu à son maximum. En revanche, en vertu de faibles niveaux de glucose, S. cerevisiae produit ATP à l’aide de la respiration mitochondriale, maintenir des taux de croissance inférieurs. Ainsi, la variation de la concentration de glucose et de l’utilisation d’autres sources de carbone induire des changements dans la préférence de la levure entre croissance fermentaire et respiratoire. En tenant compte de ce fait avec l’équation exponentielle, on peut obtenir la signification biologique des paramètres cinétiques telles que le doublement des temps (Dt) et le taux de croissance spécifique (µ). Par exemple, des valeurs plus faibles de µ trouvées lorsque la levure utilise la respiration mitochondriale comme la voie principale. Au contraire, dans des conditions qui favorisent la fermentation, des valeurs de µ plus élevées trouvées. Cette méthode peut être utilisée pour mesurer les mécanismes probables de tout produit chimique influant sur la fermentation et la respiration mitochondriale dans S. cerevisiae.

L’objectif de cet article est de proposer une méthode basée sur la cinétique de croissance pour contrôler les effets d’un substance donné/composé sur la respiration mitochondriale ou fermentation.

Protocole

1. milieux de Culture et de la préparation de l’Inoculum

1. Préparation de 100 mL de milieu liquide extrait-peptone-dextrose (DPJ) levure de 2 % (ajouter 1 g de levure extrait, 2 g de peptone de caséine, et 2 g de glucose pour 100 mL d’eau distillée). Diluer 3 mL des médias dans des tubes coniques stérilisable 15 mL. Autoclave les médias pendant 15 min à 121 ° C et 1,5 lb/po2.
   Remarque : Les médias peuvent être stockés pendant jusqu'à un mois, 4 – 8 ° c.
2. Ensemencer un tube conique rempli de 3 mL de bouillon de la DPJ 2 % stérile cool avec 250 μl de cellules de S. cerevisiae conservés en glycérol à-20 ° C. Incuber pendant la nuit dans un agitateur orbital à 30 ° C sous agitation à 200 tr/min.
3. Ensemencer une boîte de Pétri (60 x 15 mm²) rempli d’agar de la DPJ stérile 2 % (ajouter 10 g de levure extrait, 20 g de peptone de caséine, 20 g de glucose, et 20 g d’agar bactériologique à 1 000 mL d’eau distillée) avec les cellules cultivées dans le tube à fond conique à l’aide d’une anse stérile. Incuber le de Petri à 30 ° C jusqu'à ce que les colonies isolées montrent une croissance.
4. Préparation de l’inoculum avant en inoculant une seule colonie isolée dans un tube conique contenant 10 mL de cool bouillon stérile de la DPJ 2 % et du jour au lendemain il incuber à 30 ° C sous agitation continue à 200 tr/min.

2. les milieux de Culture et les courbes de croissance en microplaques

1. Préparer 10 mL de bouillon de la DPJ de 1 % (ajouter l’extrait de 0,1 g de levure, 0,2 g de peptone, et 0,1 g de glucose à 10 mL d’eau distillée), 10 mL de bouillon de la DPJ de 2 % (ajouter l’extrait de 0,1 g de levure, 0,2 g de peptone, et 0,2 g de glucose à 10 mL d’eau distillée) et 10 mL de bouillon de la DPJ de 10 % (ajouter l’extrait de 0,1 g de levure, 0,2 g de peptone, et 1 g de glucose à 10 mL d’eau distillée). Autoclave ces milieux de croissance pendant 15 min à 121 ° C et 1,5 lb/po2.
   Remarque : Les milieux de culture sert à un contrôle de croissance fermentaire.
2. Préparer 10 mL de bouillon de 2 % levure extrait-peptone-éthanol (YPE) et 10 mL de bouillon de 2 % levure extrait-peptone-glycérol (GPJ). 2 % YPE : ajouter l’extrait de 0,1 g de levure, 0,2 g de peptone, et 0,2 mL d’éthanol à 10 mL d’eau distillée. 2 % GPJ : ajouter l’extrait de 0,1 g de levure, 0,2 g de peptone, et 0,2 mL de glycérol à 10 mL d’eau distillée. Autoclave ces milieux de croissance pendant 15 min à 121 ° C et 1,5 lb/po2.
   NOTE : Glycérol et l’éthanol sont des sources de carbone non fermentescibles qui sont exclusivement métabolisés par la respiration mitochondriale. Pour cette raison, ils sont utilisés comme un contrôle de croissance respiratoire. Dans cette étape, le type et la concentration de la source de carbone dans les milieux de culture peuvent être réglées pour tester les effets sur le phénotype de la croissance en utilisant le levure extrait-peptone (YP) bouillon (10 g d’extrait de levure et 20 g de peptone de caséine dans 1 000 mL d’eau distillée) comme base. Pour tester les effets d’autres éléments nutritifs en plus de carbone, un milieu synthétique (SC) complet est complété selon le but de l’expérience. La base de la moyenne de SC est 1,8 g d’azote de levure base sans acides aminés, 5 g de sulfate d’ammonium [(NH₄)₂SO₄], 1,4 g de phosphate monosodique (NaH₂PO₄), et 2 g d’abandon mélanger dans 1 000 mL d’eau distillée. Compléter les médias avec une source de carbone et la source d’azote supplémentaire dans les concentrations nécessaires.
3. Ajouter 145 μL de milieux de culture approprié pour le protocole expérimental dans chaque puits d’une microplaque stérile (10 x 10 puits) avec un couvercle et les ensemencer avec 5 μL de l’inoculum avant.
   Remarque : Si le but est d’éliminer l’influence de substances/composés sur le métabolisme énergétique de la levure, cet substance/composé devrait être ajouté au cours de cette étape. En outre, n’importe quel type de microplaque avec un couvercle devrait être utile.
4. Incuber les plaques multipuits dans un lecteur de microplaques à 30 ° C sous agitation constante à 200 tr/min pendant 48 h. mesurer la densité optique (do) à 600 nm toutes les 30 ou 60 min.
   Remarque : Si le lecteur de microplaque ne possède pas l’option pour incuber la microplaque, il peut être incubé dans un agitateur orbital dans les mêmes conditions entre chaque mesure de la Division d’opposition.

3. croissance courbes dans des fioles coniques secoués

1. Ajouter 4,8 mL du milieu de culture approprié à l’autoclave et fioles coniques de 20 mL. Inoculer chaque fiole avec 200 μl de la culture pré inoculum à OD_600nm ~ 2 dans le bouillon de la DPJ 2 % frais et stérile. Les incuber à 30 ° C sous agitation constante à 250 tr/min pendant 24 h.
   Remarque : Si la période d’incubation est supérieure à 24 h, ajouter 12 mL du milieu de culture approprié à l’autoclave et fioles coniques de 50 mL. Les ensemencer avec 500 μL d’inoculum avant. Il est également important d’examiner les contrôles croissance fermentaire (médias YP avec 1 %, 2 %, soit 10 % de glucose) et les contrôles de croissance respiratoire (médias YP avec 2 % de glycérol ou éthanol).
2. Prendre 100 μL de la culture de la fiole conique secoué et diluez-la dans 900 μL d’eau distillée dans une cuvette de spectrophotomètre de 1 mL et mélanger doucement en pipettant également. Mesurer le diamètre extérieur à 600 nm à l’aide d’un spectrophotomètre toutes les 2 h. Pour obtenir la vraie OD, multipliez le résultat par dix.

4. traitement des données et calcul des paramètres cinétiques

1. Créez un nouveau fichier de projet dans le logiciel progiciel de statistiques. Dans la section « nouveau tableauet graphique », choisissez l’option « XY » .
   1. Sélectionnez l’option : « Commencer par un tableau de données vide » dans la section « Exemples de données » .
   2. Sélectionnez le type de graphique « Points et la ligne de connexion » . Quitter la section « X » non sélectionnée dans le segment des « Subcolumns pour des répétitions ou des valeurs erronées », et dans « Y » section Choisissez l’option : « Entrer des valeurs répétées (10) en côte à côte subcolumns et tracer la moyenne et l’erreur SD ». Cliquez sur le bouton créer.
      Remarque : Le format de table comporte une colonne X et plusieurs colonnes de Y, chacune avec les 10 subcolumns choisis précédemment.
2. Écrire l’heure à laquelle OD les mesures ont été prises dans la colonne de X (par exemple, 0, 30, 60, 90 min ou 0, 1, 1,5, 2 h). Dans les colonnes de Y, écrire les valeurs de OD obtenus à partir des cultures.
3. Identifier la phase exponentielle de croissance transformant les données de colonne Y en logarithmes. Cliquez sur le bouton « Analyser » , choisissez l’analyse « Transformer » , sélectionnez les valeurs de Y à l’aide de Y = système. Allez à la « Galerie des résultats », sélectionnez « Transform » table de données, cliquez sur le bouton « Analyser » et choisissez l’analyse de « Régression linéaire » . Exclure les valeurs do qui ne suivent pas un comportement linéaire. Pour exclure des valeurs, sélectionnez-les dans le tableau de données, puis tapez « Ctrl + E ».
   Remarque : Il est important d’exclure les valeurs qui ne suivent pas la phase exponentielle, puisque l’équation exponentielle correspond bien à la phase exponentielle.
4. Dans la « Galerie de tableaux de données », sélectionnez la table de données « donnée 1 ». Cliquez sur le bouton « Analyser » et choisissez l' analyse de « Régression non-linéaire (ajustement de courbe) » parmi les « analyses XY ».
5. Sélectionnez les jeux de données à analyser, puis cliquez sur le bouton « OK » . Dans l’onglet « Ajuster » choisir la section « Équation exponentielle » et sélectionnez l' « équation de croissance exponentielle » (où X est la concentration cellulaire, X₀ est la concentration cellulaire au temps zéro, μ est le taux de croissance spécifique, et t est le temps). Utilisez la « méthode des moindres carrés digne » comme une méthode de lissage et laisser désélectionnées la section interpoler. Cliquez sur le bouton « OK » .
   Remarque : L’onglet avec les résultats de forme non linéaires est dans la « Galerie des résultats ». Le logiciel calcule doublement temps (Dt) et spécifiques au taux de croissance (μ). Le logiciel montre μ comme K dans l’onglet résultats.
6. Ouvrez un nouveau fichier de projet et dans la section « nouveau tableau et graphique » , sélectionnez le choix de la colonne. Choisissez l’option « Démarrer avec une table de données vide » et sélectionnez le graphe désiré. Choisissez tracer la moyenne avec la SD, sélectionnez le bouton « Créer » .
7. Copier les valeurs de Dt ou de μ dans l’onglet résultats fit non linéaire qui est dans la « Galerie des résultats » et les coller dans une colonne. Enfin, cliquez sur le bouton « Analyser » et choisissez l’analyse désirée dans la section « Analyses de colonne » pour comparer les paramètres cinétiques des différentes conditions éducationnels.
   Remarque : Les paramètres cinétiques obtient des contrôles croissance fermentaire (médias YP avec 1 %, 2 %, soit 10 % de glucose) et contrôles de croissance respiratoire (médias YP avec 2 % de glycérol ou éthanol) permet d’établir le seuil de la respiration par fermentation et mitochondriale, respectivement. En comparant la cinétique les paramètres de l’état nutritionnel et de la substance/composés testés avec la croissance de l’appareil respiratoire et fermentative aident à identifier l’effet possible sur le métabolisme respiratoire ou par fermentation.

Résultats

Courbes de croissance peuvent être utilisés pour distinguer provisoirement respiratoires et fermentatives phénotypes dans la levure S. cerevisiae . Donc, nous avons effectué des cultures en batch de S. cerevisiae (BY4742) avec des concentrations de glucose différentes qui ont été signalées pour induire la croissance par fermentation : 1 %, 2 % et 10 % (p/v)⁹. Les cultures présentant un phénotype fermentatif ont une phase de latence faib...

Discussion

Beaucoup de temps s’est écoulé depuis J. Monod¹⁰ exprimé que l’étude de la croissance des cultures bactériennes est la méthode de base de la microbiologie. L’avènement des outils moléculaires retarde l’utilisation et l’étude de la croissance en tant que technique. Malgré la complexité de la croissance, ce qui implique de nombreux processus interdépendants, ses mécanismes sous-jacents peuvent être décrit en utilisant des modèles mathématiques¹¹. Il...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orbital Shaker	Thermo Scientific	4353	For inoculum incubation or conical fask cultures
Bioscreen	Growth curves	C MBR	For batch cultures in microplates
Glucose	Sigma	G7021	For YPD broth preparation
Peptone from casein, enzymatic digest	Sigma	82303	For YPD broth preparation
Yeast extract	Sigma	09182-1KG-F	For YPD broth preparation
Bacteriological Agar	Sigma	A5306	For YPD agar preparation
NaH2PO4	Sigma	S8282	For SC broth preparation
(NH4)2SO4	Sigma	A4418	For SC broth preparation
Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate	Sigma	Y1251	For SC broth preparation
Yeast synthetic drop-Out medium supplements	Sigma	Y1501	For SC broth preparation
Ammonium sulfate granular	J.T. Baker	0792-R	For medium supplementation example
Resveratrol	Sigma	R5010	For medium supplementation example
Galactose	Sigma	G8270	For medium supplementation example
Sucrose	Sigma	S7903	For medium supplementation example
Absolut ethanol	Merck	107017	For medium supplementation example
Glycerol	J.T. Baker	2136-01	For medium supplementation example
GraphPad Prism	GraphPad Software		For data analysis
Honeycomb microplates	Thermo Scientific	9502550	For microplate cultures