Пивоваренные дрожжи Экспоненциальный рост кинетика в культуре партии для анализа дыхания и ферментативным метаболизма

Резюме

Здесь мы представляем протокол для оценки метаболизм дыхания и ферментативным путем установки экспоненциальный рост Saccharomyces cerevisiae экспоненциальный рост уравнения. Расчета кинетических параметров позволяет для проверки влияния веществ/соединений на брожение или митохондриальное дыхание.

Аннотация

Пивоваренные дрожжи клетки в экспоненциальной фазе роста, производя СПС через ферментации и/или митохондриальное дыхание. Концентрация углерода сбраживаемых главным образом регулирует как дрожжевых клеток генерировать СПС; Таким образом различия в уровнях сбраживаемых углеводов диски энергетический метаболизм S. cerevisiae. Этот документ описывает метод высокой пропускной способностью на основе экспоненциального дрожжей роста для оценки последствий изменения концентрации и характер источника углерода на метаболизм дыхания и ферментативной. Рост S. cerevisiae измеряется в Гонав или потрясен конической колбе путем определения оптической плотности (OD) на 600 Нм. Затем кривая роста построен построения ОД против времени, что позволяет выявление и отбор экспоненциальной фазе и оснащен экспоненциальный рост уравнение для получения кинетическими параметрами. Низкие конкретные темпы роста с выше удвоение раз обычно представляют дыхания рост. И наоборот более высокие темпы роста конкретных с нижней удвоение раз указывают на ферментативную рост. Пороговые значения удвоения время и темп роста конкретных оцениваются с помощью хорошо известных дыхания или ферментативную условия, такие как источников без сбраживаемых углерода или более высокие концентрации сбраживаемых Сахаров. Это получается для каждого конкретного штамма. Наконец рассчитанные кинетических параметров сравниваются с пороговые значения установить ли дрожжи показывает ферментативной и/или респираторных роста. Преимуществом данного метода является его относительная простота для понимания воздействия вещества/смеси на ферментативную или дыхательных путей метаболизма. Важно подчеркнуть, что рост является сложной и сложной биологический процесс; Таким образом предварительные данные из этого метода должен быть подтвержден количественная оценка потребления кислорода и накоплением побочные продукты брожения. Таким образом этот метод может использоваться как предварительный скрининг соединений/веществ, которые могут нарушить или улучшают ферментативную или дыхательных путей метаболизма.

Введение

Saccharomyces cerevisiae роста служит ценным инструментом для выявления десятки физиологических и молекулярных механизмов. Рост измеряется прежде всего тремя методами: серийных разведений для выборочной проверки, образуя колонии единица подсчета и кривых роста. Эти методы могут использоваться отдельно или в сочетании с различными субстратами, экологических условий, мутантов и химических веществ расследовать конкретные ответы или фенотипов.

Митохондриальное дыхание-это биологический процесс, в котором Кинетика роста успешно применяется для обнаружения неизвестных механизмов. В этом случае добавок питательных сред с без сбраживаемых углерода источников таких как глицерин, лактат или этанол (которые являются исключительно метаболизируется путем митохондриальное дыхание), как единственного источника углерода и энергии позволяет для оценки респираторные роста, который имеет важное значение для выявления возмущений в окислительного фосфорилирования деятельности¹. С другой стороны это сложно пользоваться кинетической модели роста как метод для расшифровки механизмов за брожения.

Изучение митохондриального дыхания и брожения имеет важное значение для прояснения молекулярных механизмов за определенные фенотипов например Крабтри и Варбург эффекты^2,3. Crabtree эффект характеризуется увеличением гликолитических потока, репрессии митохондриальное дыхание и создание ферментации как основной путь для генерации АТФ в присутствии высоких концентраций сбраживаемых углеводов (> 0,8 мм)^4,5. Варбург эффект метаболически аналого-Crabtree эффект, с той разницей, что в клетках млекопитающих, основным продуктом ферментации молочной кислоты⁶. Действительно Варбург эффект проявляется на различных раковых клеток, вызывая глюкозы и потребления даже в присутствии кислорода⁷. Таким образом изучая молекулярные основы перехода от дыхания для ферментации в Crabtree эффект в биотехнологических последствия (для производства этанола) и потенциального воздействия исследований рака.

S. cerevisiae рост может быть подходящим инструментом для изучения влияния Crabtree и Варбург. Эта идея основывается на том, что в экспоненциальной фазе дрожжей, Центральный путей, используемых для производства АТФ, митохондриальных дыхания и брожения, которые необходимы для поддержания экономического роста. Например рост S. cerevisiae тесно связано с функции генерации АТФ пути. В S. cerevisiae, митохондриальное дыхание производит приблизительно 18 ATP молекулы на молекулу глюкозы тогда как ферментация генерирует только 2 молекулы АТФ, поэтому ожидается что темпы роста имеет тесные связи с метаболических производства АТФ⁸. В этой связи когда брожение является основной маршрут для генерации АТФ, дрожжи компенсирует низкий уровень производства АТФ, увеличивая скорость поглощения глюкозы. Напротив потребление глюкозы клетками дрожжей, которые используют митохондриальное дыхание как основной источник АТФ является низким. Это означает, что это важно для дрожжей в смысле наличия углеводов до определения того, как будет создаваться СПС. Таким образом, наличие глюкозы играет важную роль в переключение между ферментации и митохондриальное дыхание в S. cerevisiae. При наличии большого количества глюкозы дрожжи предпочитает ферментации как Центральный маршрут для генерации АТФ. Интересно, что когда дрожжи брожения, темпы роста конкретных поддерживается на своего максимума. С другой стороны под низкий уровень глюкозы, S. cerevisiae производит АТП с использованием митохондриальное дыхание, поддержание темпов роста. Таким образом различия в концентрации глюкозы и использование других источников углерода вызывают изменения в дрожжи предпочтения между роста ферментативной и дыхания. Принимая во внимание этот факт с помощью уравнения экспоненциальный рост, можно получить Биологическая смысль кинетических параметров, таких как удвоение время (Dt) и конкретных прирост (мкг). Например более низкие значения µ были найдены когда дрожжи в качестве основного пути использует митохондриальное дыхание. Напротив в условиях, которые способствуют ферментации, были обнаружены высокие значения µ . Эта методология может использоваться для оценки вероятных механизмов любых химических веществ, влияющих на брожение и митохондриальное дыхание в S. cerevisiae.

Цель этого документа должна предложить метод, основанный на Кинетика роста для проверки воздействия данного вещества/смеси на митохондриальное дыхание или ферментации.

протокол

1. Культура средства массовой информации и подготовка посевным материалом

1. Подготовка 100 мл 2% дрожжевой экстракт Пептон декстрозы (YPD) жидкой среды (добавить 1 г дрожжей экстракт, казеина Пептон, 2 g и 2 g глюкозы до 100 мл дистиллированной воды). Отказаться от 3 мл СМИ в 15 мл стерилизуются конические трубы. Автоклав СМИ за 15 мин при температуре 121 ° C и 1,5 psi.
   Примечание: Средства массовой информации могут быть сохранены на срок до одного месяца на 4 – 8 ° C.
2. Прививать Конические трубки, заполненные с 3 мл прохладной стерильные 2% YPD бульон с 250 мкл клеток S. cerevisiae , сохранились в глицерин при-20 ° C. Инкубируйте на ночь в орбитальный шейкер при 30 ° C с перемешиванием на 200 об/мин.
3. Полоска Петри (60 x 15 мм²) наполнены стерильный 2% YPD агар (добавить 10 г дрожжей экстракт, 20 g Пептон казеина, 20 г глюкозы, и 20 g бактериологического агар до 1000 мл дистиллированной воды) с клеток, выращиваемых в конической трубки с помощью стерильных цикла. Инкубируйте Петри в 30 ° C до тех пор, пока отдельные колонии показывают рост.
4. Подготовить предварительный посевным материалом, прививки одной изолированной колонии в конической трубки заполнены с 10 мл прохладной стерильные 2% YPD бульона и проинкубируйте ее на ночь на 30 ° C при постоянном помешивании в 200 об/мин.

2. Культура СМИ и кривых роста в микропланшетов

1. Подготовка 10 мл 1% YPD бульона (добавить 0,1 г дрожжей экстракт, 0,2 г Пептон, и 0,1 г глюкозы до 10 мл дистиллированной воды), 10 мл 2% YPD бульона (добавить 0,1 г дрожжей экстракт, 0,2 г Пептон, и 0,2 г глюкозы до 10 мл дистиллированной воды) и 10 мл 10% YPD бульона (добавить 0,1 г дрожжей экстракт, 0,2 г Пептон, и 1 г глюкозы до 10 мл дистиллированной воды). Автоклав эти роста сред для 15 мин при температуре 121 ° C и 1,5 psi.
   Примечание: Культуры средств массовой информации служит элемент управления ферментативным роста.
2. Подготовка 10 мл 2% дрожжевой экстракт Пептон этанол (тип) бульона и 10 мл 2% дрожжевой экстракт Пептон глицерин бульона (YPG). 2% тип: добавить 0,1 г дрожжей экстракт, 0,2 г Пептон, и 0,2 мл этанола до 10 мл дистиллированной воды. 2% YPG: добавить 0,1 г дрожжей экстракт, 0,2 г Пептон, и 0,2 мл глицерина до 10 мл дистиллированной воды. Автоклав эти роста сред для 15 мин при температуре 121 ° C и 1,5 psi.
   Примечание: Глицерин и этанола, источников без сбраживаемых углерода, которые являются исключительно метаболизируется путем митохондриальное дыхание. По этой причине они используются в качестве контроля дыхания рост. В этом шаге типа и концентрации источника углерода в культуре средств массовой информации могут быть изменены для проверки воздействия на рост фенотип, используя дрожжевой экстракт Пептон (YP) отвар (10 г экстракта дрожжей и 20 g Пептон казеина в 1000 мл дистиллированной воды) в качестве базы. Чтобы проверить действие других питательных веществ, кроме углерода, синтетические полного среднего (SC) дополняется согласно целью эксперимента. База для средних SC является 1.8 g базовый без аминокислоты, 5 г сульфата аммония дрожжи азота [(NH₄)₂т₄], 1,4 г натрия фосфата (NaH₂PO₄), и 2 g отсева из смеси в 1000 мл дистиллированной воды. Дополнение к СМИ с источника углерода и источник дополнительного азота в необходимой концентрации.
3. Добавьте 145 мкл подходящих культуры средств массовой информации для экспериментальных дизайн каждой скважины стерильные Гонав (10 x 10-а) с крышкой и прививать им с 5 мкл предварительно посевным материалом.
   Примечание: Если цель состоит в том, чтобы экранировать влияние веществ/соединений на энергетический метаболизм дрожжи, что вещество/смесь следует добавить во время этого шага. Кроме того любой тип микропланшетов с крышкой должно быть полезным.
4. Инкубировать несколькими хорошо пластины в Считыватель микропланшетов при 30 ° C с постоянным перемешиванием в 200 об/мин за 48 ч. измерения оптической плотности (OD) на 600 Нм каждые 30 или 60 мин.
   Примечание: Если Считыватель микропланшетов не имеют возможность для инкубации микроплиты, он может быть инкубировали в орбитальный шейкер на тех же условиях между каждого измерения ОД.

3. рост кривых в потрясен Конические колбы

1. Добавьте 4,8 мл подходит культуры средств массовой информации в 20 мл Конические колбы и автоклав. Прививать каждый флакон с 200 мкл предварительно посевные культуры в ОД_600nm ~ 2 в прохладном, стерильные 2% YPD бульон. Инкубируйте их в 30 ° C с постоянным агитации за 24 часа на 250 об/мин.
   Примечание: Если инкубационный период выше, чем 24 часа, добавьте 12 мл подходящие средства массовой информации культуры 50 мл Конические колбы и автоклав. Прививать им с 500 мкл предварительно посевным материалом. Важно также рассмотреть ферментативным роста (YP СМИ с 1%, 2% или 10% глюкозы) и дыхательных путей роста элементов управления (YP СМИ с 2% глицерина или этанола).
2. Взять 100 мкл потрясен коническую колбу культуры и развести его в 900 мкл в кювет спектрофотометр 1 мл дистиллированной воды и осторожно перемешать, закупорить. Измерить ОД на 600 Нм, используя спектрофотометр каждые 2 ч. Для получения реальной ОД, умножьте результат на десять.

4. обработка данных и расчета кинетических параметров

1. Создание нового файла проекта в Статистический пакет программного обеспечения. В разделе «Новая таблица и график»выберите параметр «XY» .
   1. Выберите вариант: «Начать с пустой таблицы» в разделе «Примеры» .
   2. Выберите тип диаграммы «Точек и соединительная линия» . Оставить в разделе «X» , снят в сегменте «Перемножения реплицирует или значения ошибок», и в «Y» раздел выберите вариант: «Введите (10) реплицировать значения в бок о бок перемножения и сюжет среднее и SD ошибка». Нажмите кнопку Создать.
      Примечание: Формат таблицы имеет один столбец X и несколько столбцов в Y, каждое с 10 перемножения, отобранных ранее.
2. Запись времени, в котором ОД измерения были проведены в столбце X (например, 0, 30, 60, 90 мин или 0, 1, 1.5, 2 ч). В столбцах Y напишите ОД значения, полученные из культур.
3. Определите фазы экспоненциального роста, преобразования данных столбца Y в логарифмы. Нажмите на кнопку «Анализировать» , выберите «Преобразовать» анализ, выберите значения Y, используя Y = Log(Y). Перейдите в «Галерея результатов», выберите «Преобразовать» таблицы данных, нажмите кнопку «Анализировать» и выберите «Линейной регрессии» анализ. Исключите ОД значения, которые не следуют линейное поведение. Чтобы исключить значения, выберите их в таблице данных и типа «Ctrl + E».
   Примечание: Важно исключить значения, которые не следуют экспоненциальной фазе, так как уравнение экспоненциальный рост хорошо сочетается с экспоненциальной фазе.
4. В «Галерея таблицы данных», выберите таблицу данных » данных 1». Нажмите на кнопку «Анализировать» и выберите «Нелинейной регрессии (кривая fit)» анализ среди «XY анализа».
5. Выберите наборы данных для анализа и нажмите кнопку «ОК» . В закладке «Fit» выберите раздел «Экспоненциальные уравнения» и выберите «экспоненциальный рост уравнение» (, где X является концентрация клеток, X₀ является концентрация клеток на нулевое время, μ ставка определенного роста, и t — время). Используйте «наименьших квадратов пригодный» как метода установки и оставить невыбранном секции интерполяция. Нажмите кнопку «ОК» .
   Примечание: Вкладка с результатами нелинейные ЦФ находится в «Галерея результатов». Программное обеспечение вычисляет удвоение время (Dt) и конкретные темпы роста (μ). Программное обеспечение показывает μ как K на вкладке результаты.
6. Открыть файл нового проекта и в разделе «Новая таблица и график» , выберите Выбор столбцов. Выберите опцию «Начать с пустой таблицы» и выберите нужную диаграмму. Выберите участок средней с SD. Выберите кнопку «Создать» .
7. Скопируйте μ или Dt значения из вкладки нелинейные ЦФ результаты, которая находится в «Галерея результатов» и вставьте их в столбце. Наконец выберите кнопку «Анализировать» и выберите требуемый анализ в разделе «Столбец анализа» для сравнения кинетических параметров различных nutrimental условий.
   Примечание: Кинетические параметры, полученные из контроля ферментативной роста (YP СМИ с 1%, 2% или 10% глюкозы) и контроль дыхания рост (YP СМИ с 2% глицерина или этанол) помогает установить порог ферментативной и митохондриальное дыхание, соответственно. Сравнивая кинетических параметров от состояния питания и вещество/смесь assayed с дыхательной и ферментативным роста помогают определить возможное влияние на метаболизм дыхания или ферментативную.

Результаты

Кривые роста может использоваться для предварительно различать дыхания и ферментативным фенотипы в дрожжей S. cerevisiae . Таким образом, мы исполняли партии культуры S. cerevisiae (BY4742) с концентрациями различных глюкозы, представивших побудить ферментативным рост: 1%, ...

Обсуждение

Много времени прошло с момента J. Monod¹⁰ выразил, что изучение роста бактериальных культур является основным методом микробиологии. Появление молекулярной инструменты задержки использования и изучения роста как техника. Несмотря на сложность роста, которая включает в себя м...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orbital Shaker	Thermo Scientific	4353	For inoculum incubation or conical fask cultures
Bioscreen	Growth curves	C MBR	For batch cultures in microplates
Glucose	Sigma	G7021	For YPD broth preparation
Peptone from casein, enzymatic digest	Sigma	82303	For YPD broth preparation
Yeast extract	Sigma	09182-1KG-F	For YPD broth preparation
Bacteriological Agar	Sigma	A5306	For YPD agar preparation
NaH2PO4	Sigma	S8282	For SC broth preparation
(NH4)2SO4	Sigma	A4418	For SC broth preparation
Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate	Sigma	Y1251	For SC broth preparation
Yeast synthetic drop-Out medium supplements	Sigma	Y1501	For SC broth preparation
Ammonium sulfate granular	J.T. Baker	0792-R	For medium supplementation example
Resveratrol	Sigma	R5010	For medium supplementation example
Galactose	Sigma	G8270	For medium supplementation example
Sucrose	Sigma	S7903	For medium supplementation example
Absolut ethanol	Merck	107017	For medium supplementation example
Glycerol	J.T. Baker	2136-01	For medium supplementation example
GraphPad Prism	GraphPad Software		For data analysis
Honeycomb microplates	Thermo Scientific	9502550	For microplate cultures