Saccharomyces cerevisiae Cinética de crecimiento exponencial en la cultura de lote para analizar el metabolismo respiratorio y fermentativo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para estimar el metabolismo respiratorio y fermentativo encajando el exponencial crecimiento de Saccharomyces cerevisiae a la ecuación de crecimiento exponencial. Cálculo de los parámetros cinéticos permite la proyección de la influencia de compuestos de sustancias en fermentación o respiración mitocondrial.

Resumen

Las células de Saccharomyces cerevisiae en la fase exponencial sostienen su crecimiento mediante la producción de ATP por fermentación o respiración mitocondrial. La concentración de carbono fermentables principalmente gobierna cómo las células de levadura generan ATP; por lo tanto, la variación en los niveles de carbohidratos fermentables impulsa el metabolismo energético de S. cerevisiae. Este papel describe un método de alto rendimiento basado en el crecimiento exponencial de la levadura para estimar los efectos de los cambios de la concentración y naturaleza de la fuente de carbono sobre el metabolismo respiratorio y fermentativo. El crecimiento de S. cerevisiae es medido en una microplaca o sacudirse cónico matraz mediante la determinación de la densidad óptica (OD) a 600 nm. Entonces, una curva de crecimiento es construida por OD trazado frente al tiempo, que permite la identificación y selección de la fase exponencial y está equipado con la ecuación de crecimiento exponencial para obtener parámetros cinéticos. Las tasas de crecimiento bajo con tiempos de duplicación superiores generalmente representan un crecimiento respiratorio. Por el contrario, mayores tasas de crecimiento específico con menores tiempos de duplicación indican crecimiento fermentativo. Valores umbral de duplicar el tiempo y la tasa de crecimiento específico se calculan usando condiciones respiratorias o fermentativas bien conocidas, tales como fuentes de carbono no fermentables o altas concentraciones de azúcares fermentables. Esto se obtiene de cada cepa específica. Por último, los parámetros cinéticos calculados se comparan con los valores de umbral para establecer si la levadura demuestra crecimiento fermentativo o respiratorio. La ventaja de este método es su relativa sencillez para la comprensión de los efectos de un compuesto de sustancia en el metabolismo fermentativo o respiratorio. Es importante destacar que el crecimiento es un proceso intrincado y complejo biológico; por lo tanto, los datos preliminares de este método deben ser corroborados por la cuantificación del consumo de oxígeno y la acumulación de subproductos de la fermentación. Por lo tanto, esta técnica puede utilizarse como una proyección preliminar de compuestos/sustancias que pueden alterar o mejorar el metabolismo fermentativo o respiratorio.

Introducción

Crecimiento de Saccharomyces cerevisiae ha servido como una herramienta valiosa para identificar decenas de mecanismos fisiológicos y moleculares. Crecimiento se mide principalmente por tres métodos: diluciones seriadas para pruebas de punto, unidad formadora de colonias contando y las curvas de crecimiento. Estas técnicas se pueden utilizar solo o en combinación con una variedad de sustratos, condiciones ambientales, mutantes y productos químicos para investigar las respuestas específicas o fenotipos.

La respiración mitocondrial es un proceso biológico en el cual cinética de crecimiento se ha aplicado con éxito para descubrir mecanismos desconocidos. En este caso, la suplementación del medio de crecimiento con carbono no fermentables fuentes tales como el glicerol, el lactato o el etanol (que se metabolizan exclusivamente por la respiración mitocondrial), como la única fuente de carbono y energía permite evaluar la crecimiento respiratorio, que es importante detectar las perturbaciones en la fosforilación oxidativa actividad¹. Por otro lado, es complicado usar modelos cinéticos de crecimiento como un método para descifrar los mecanismos detrás de la fermentación.

El estudio de la fermentación y la respiración mitocondrial es fundamental para dilucidar los mecanismos moleculares detrás de ciertos fenotipos como el Crabtree y Warburg efectos^2,3. El efecto Crabtree se caracteriza por un aumento del flujo glicolítico, la represión de la respiración mitocondrial y el establecimiento de la fermentación como la vía primaria para generar ATP en presencia de altas concentraciones de carbohidratos fermentables (> 0,8 mM)^4,5. El efecto de Warburg es metabólicamente análogo al efecto Crabtree, con la diferencia que en células de mamíferos, el principal producto de la fermentación es lactato⁶. De hecho, el efecto de Warburg es exhibido por una variedad de células cancerosas, provocando la absorción de glucosa y consumo incluso en presencia de oxígeno⁷. De tal modo, estudiando la base molecular de la cambio de respiración a la fermentación en el efecto Crabtree tiene repercusiones biotecnología (producción de etanol) e impactos potenciales en la investigación del cáncer.

Crecimiento de S. cerevisiae puede ser una herramienta adecuada para estudiar los efectos de Crabtree y Warburg. Esta idea es basa en el hecho de que en la fase exponencial de la levadura, las vías central utilizadas para producir ATP son la respiración mitocondrial y la fermentación, que son esenciales para sostener el crecimiento. Por ejemplo, el crecimiento de S. cerevisiae está íntimamente relacionada con la función de las vías generadoras de ATP. En moléculas de S. cerevisiae, la respiración mitocondrial produce aproximadamente 18 ATP por molécula de glucosa, mientras que la fermentación sólo genera 2 moléculas de ATP, por lo tanto, se espera que la tasa de crecimiento tiene estrecha vínculos con las vías metabólicas la producción de ATP⁸. En este sentido, cuando la fermentación es la ruta principal para generar ATP, la levadura compensa la baja producción de ATP mediante el aumento de la tasa de absorción de la glucosa. Por el contrario, el consumo de glucosa por las células de levadura que utilizan la respiración mitocondrial como la principal fuente de ATP es bajo. Esto indica que es importante que la levadura a la disponibilidad de hidratos de carbono de sentido antes de determinar cómo se genera ATP. Por lo tanto, la disponibilidad de la glucosa desempeña un papel importante en el interruptor entre fermentación y respiración mitocondrial en S. cerevisiae. En presencia de altas cantidades de glucosa, la levadura prefiere la fermentación como la ruta central para generar ATP. Curiosamente, cuando la fermentación de la levadura, la tasa de crecimiento se mantiene en su máximo. Por otra parte, bajo niveles bajos de glucosa, S. cerevisiae produce ATP utilizando la respiración mitocondrial, manteniendo tasas de crecimiento. Por lo tanto, variación en la concentración de la glucosa y el uso de otras fuentes de carbono inducir cambios en la preferencia de la levadura entre el crecimiento fermentativo y respiratorio. Teniendo en cuenta este hecho con la ecuación de crecimiento exponencial, se puede obtener el significado biológico de parámetros cinéticos como la duplicación de tiempo (Dt) y tasa de crecimiento específico (μ). Por ejemplo, se encontraron menores valores de μ cuando la levadura utiliza la respiración mitocondrial como la vía principal. Por el contrario, bajo condiciones que favorecen la fermentación, se encontraron valores más altos de μ . Esta metodología puede utilizarse para medir los probables mecanismos de sustancias químicas que afectan a la fermentación y la respiración mitocondrial en S. cerevisiae.

El objetivo de este trabajo es proponer un método basado en la cinética de crecimiento para la detección de los efectos de un determinada sustancia/compuesto sobre la respiración mitocondrial o fermentación.

Protocolo

1. medios de cultivo y preparación del inóculo

1. Preparar 100 mL de medio líquido de 2% levadura extracto-peptona-dextrosa (YPD) (agregue 1 g de levadura extracto, 2 g de peptona de caseína, y 2 g de glucosa a 100 mL de agua destilada). Pipetear 3 mL de los medios de comunicación en esterilizable tubos cónicos de 15 mL. Autoclave de los medios de comunicación durante 15 min a 121 ° C y 1.5 psi.
   Nota: Los medios de comunicación pueden conservarse hasta un mes en 4 – 8 ° C.
2. Inocular un tubo cónico con 3 mL de fresco caldo YPD 2% estéril con 250 μL de células de S. cerevisiae conservadas en glicerol a-20 ° C. Incubar durante una noche en un agitador orbital a 30 ° C con agitación a 200 rpm.
3. Racha de un plato de Petri (60 x 15 mm²) lleno de estéril agar YPD al 2% (agregue Extracto de 10 g de levadura, 20 g de peptona de caseína, 20 g de glucosa, y 20 g de agar bacteriológico a 1.000 mL de agua destilada) con las células en el tubo cónico con un asa estéril. Incubar la placa de Petri a 30 ° C hasta que las colonias aisladas muestran crecimiento.
4. Preparar el inóculo previo al inocular una colonia aislada solo en un tubo cónico con 10 mL de fresco caldo YPD 2% estéril e incubar durante la noche a 30 ° C con agitación a 200 rpm.

2. medios de cultivo y las curvas de crecimiento en microplaca

1. Preparar 10 mL de caldo YPD 1% (agregar 0.1 g de levadura extracto, 0,2 g de peptona, y 0,1 g de glucosa en 10 mL de agua destilada), 10 mL de caldo YPD 2% (agregue 0.1 g de levadura extracto, 0,2 g de peptona, y 0,2 g de glucosa en 10 mL de agua destilada) y 10 mL de caldo YPD 10% (agregue 0.1 g de levadura extracto, 0,2 g de peptona, y 1 g de glucosa en 10 mL de agua destilada). Autoclave de estos medios de crecimiento durante 15 min a 121 ° C y 1.5 psi.
   Nota: Los medios de cultivo sirve como control de crecimiento fermentativo.
2. Preparar 10 mL de caldo de (YPE) 2% levadura peptona-extracto-etanol y 10 mL de caldo de 2% levadura peptona-extracto-glicerol (YPG). 2% YPE: Añadir 0.1 g de levadura extracto, 0,2 g de peptona, y 0,2 mL de etanol a 10 mL de agua destilada. 2% YPG: Añadir 0.1 g de levadura extracto, 0,2 g de peptona, y 0,2 mL de glicerol al 10 mL de agua destilada. Autoclave de estos medios de crecimiento durante 15 min a 121 ° C y 1.5 psi.
   Nota: La glicerina y etanol son fuentes de carbono no fermentables que se metabolizan exclusivamente por la respiración mitocondrial. Por esta razón, se utilizan como un control de crecimiento respiratorio. En este paso, pueden cambiarse el tipo y concentración de fuente de carbono en los medios de cultivo para probar los efectos en el fenotipo de crecimiento utilizando como base el caldo de peptona extracto (YP) de levadura (10 g de extracto de levadura y 20 g de peptona de caseína en 1.000 mL de agua destilada). Para probar los efectos de otros nutrientes además de carbono, sintético medio completo de (SC) es complementado según el objetivo del experimento. La base de medio SC es 1,8 g de levadura nitrógeno base sin aminoácidos, 5 g de sulfato de amonio [(NH₄)₂SO₄], 1,4 g de fosfato monosódico (NaH₂PO₄), y 2 g de abandono en 1.000 mL de agua destilada. Suplemento de los medios de comunicación con una fuente de carbono y fuente de nitrógeno adicional en las concentraciones necesarias.
3. Añadir 145 μL de medio de cultivo adecuado para el diseño experimental en cada pocillo de una microplaca estéril (10 x 10-bien) con una tapa e inocular con 5 μL del inóculo antes.
   Nota: Si el objetivo es detectar la influencia de compuestos de sustancias en el metabolismo energético de la levadura, debe agregarse sustancia/compuesto durante este paso. También, cualquier tipo de microplaca con tapa debe ser útil.
4. Incube la placa varios pocillos en un lector de microplacas a 30 ° C con agitación constante a 200 rpm por 48 h. medir la densidad óptica (OD) a 600 nm cada 30 o 60 minutos.
   Nota: Si el lector de microplacas no tiene la opción de Incube las microplacas, pueden ser incubado en un agitador orbital en las mismas condiciones entre cada medición del OD.

3. crecimiento curvas en matraces cónicos de sacudido

1. Añadir 4,8 mL de los medios de cultivo adecuados para autoclave y matraces 20 mL. Inocular cada frasco con 200 μL de la cultura pre-inóculo en OD_{600 nm} ~ 2 en fresco, estéril 2% caldo YPD. Incúbelos a 30 ° C con agitación constante a 250 rpm por 24 h.
   Nota: Si el período de incubación es superior a 24 h, añadir 12 mL de los medios de cultivo adecuados para autoclave y matraces de 50 mL. Les inocule con 500 μL del inóculo antes. También es importante considerar el crecimiento fermentativo controles (media YP con glucosa 1%, 2% o 10%) y controles de crecimiento respiratorio (medios YP con glicerol de 2% o etanol).
2. Tomar 100 μL de la cultura sacudido frasco cónico y diluirlo en 900 μL de agua destilada en una cubeta del espectrofotómetro 1 mL y suavemente mezclar mediante pipeteo. Medir la do a 600 nm usando un espectrofotómetro cada 2 h. Para obtener la do real, multiplique el resultado por diez.

4. procesamiento de datos y cálculo de parámetros cinéticos

1. Crear un nuevo archivo de proyecto en el software de paquete estadístico. En la sección de "nueva tabla y el gráfico", elija la opción "XY" .
   1. Seleccione la opción: "Comenzar con una tabla de datos vacía" en la sección "Datos de ejemplo" .
   2. Seleccione el tipo de gráfico "Puntos y línea de conexión" . Dejar la sección de "X" no seleccionada en el segmento de "Subcolumns de repeticiones o valores de error", y en la "Y" sección seleccionar la opción: "Ingresar valores repetidos (10) en subcolumns de lado a lado y parcela media y Error". Haga clic en el botón crear.
      Nota: El formato de tabla tiene una columna de X y varias columnas Y, cada uno con el 10 subcolumns elegidos previamente.
2. Escribir la hora en que OD se tomaron medidas en la columna de X (por ejemplo, 0, 30, 60, 90 min o 0, 1, 1.5, 2 h). En las columnas Y escriba los valores de OD obtenidos de las culturas.
3. Identificar la fase de crecimiento exponencial transformar datos de la columna Y de logaritmos. Haga clic en el botón "Analizar" , elige el análisis de "Transformar" , seleccione valores Y usando Y = Log(Y). Ir a la "Galería de resultados", seleccione "Transformar" la tabla de datos, haga clic en el botón "Analizar" y escoge " regresión lineal". Excluir los valores de OD que no siguen un comportamiento lineal. Para excluir los valores, seleccione en la tabla de datos y escriba "Ctrl + E".
   Nota: Es importante excluir los valores que no sigan la fase exponencial, ya que la ecuación de crecimiento exponencial se adapta bien a la fase exponencial.
4. En la "Galería de tablas de datos", seleccione la tabla de datos "datos 1". Haga clic en el botón "Analizar" y elige el análisis de la "Regresión no lineal (ajuste de la curva)" entre el "análisis XY".
5. Seleccione los conjuntos de datos a analizar y haga clic en el botón "OK" . En la ficha "Fit" elija la sección de "Ecuación exponencial" y seleccione la "ecuación de crecimiento exponencial" (donde X es la concentración de células, X₀ es la concentración de células a tiempo cero, μ es la tasa de crecimiento específico, y t es el tiempo). Utilizar el "ajuste de mínimos cuadrados" como un método de ajuste y deje sin seleccionar la sección de interpolar. Haga clic en el botón "OK" .
   Nota: La ficha con los resultados de forma no lineales está en la "Galería de resultados". El software calcula doblaje tiempo (Dt) y específicas de crecimiento (μ). El software muestra μ K en la pestaña resultados.
6. Abra un nuevo archivo de proyecto y en la sección "nueva tabla y gráfico" , seleccionar la opción columna. Elige la opción "Inicio con una tabla de datos vacía" y seleccione la gráfica deseada. Elija representar la media con el SD. Seleccione el botón "Crear" .
7. Copiar el μ o Dt los valores de la ficha de resultados de forma no lineal que se encuentra en la "Galería de resultados" y pegarlos en una columna. Por último, seleccione el botón "Analizar" y elegir el análisis deseado en la sección de "Análisis de la columna" para comparar los parámetros cinéticos de las diferentes condiciones nutrimentales.
   Nota: Los parámetros cinéticos obtienen de los controles de crecimiento fermentativo (media YP con glucosa 1%, 2% o 10%) y controles de crecimiento respiratorio (medios YP con glicerol de 2% o etanol) ayuda a establecer el umbral de la respiración mitocondrial y fermentativa, respectivamente. Comparando el cinético parámetros de la condición nutricional y sustancia/compuesto ensayaron con el crecimiento fermentativo y respiratorio ayudan a identificar el posible efecto sobre el metabolismo fermentativo o respiratorio.

Resultados

Las curvas de crecimiento pueden utilizarse para diferenciar preliminarmente los fenotipos respiratorios y fermentativos de la levadura S. cerevisiae . Por lo tanto, se realizaron cultivos batch de S. cerevisiae (BY4742) con concentraciones diferentes de glucosa que se han divulgado para inducir el crecimiento fermentativo: 1%, 2% y 10% (w/v)⁹. Las culturas que muestran un fenotipo fermentativo tienen un pequeño retraso y una fase exponencial con...

Discusión

Mucho tiempo ha pasado desde que J. Monod¹⁰ expresa que el estudio del crecimiento de cultivos bacterianos es el método básico de la microbiología. El advenimiento de las herramientas moleculares retrasa el uso y el estudio del crecimiento como una técnica. A pesar de la complejidad de crecimiento que involucra numerosos procesos relacionados entre sí, sus mecanismos subyacentes pueden describirse mediante el uso de modelos matemáticos¹¹. Se trata de un enfoque robust...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orbital Shaker	Thermo Scientific	4353	For inoculum incubation or conical fask cultures
Bioscreen	Growth curves	C MBR	For batch cultures in microplates
Glucose	Sigma	G7021	For YPD broth preparation
Peptone from casein, enzymatic digest	Sigma	82303	For YPD broth preparation
Yeast extract	Sigma	09182-1KG-F	For YPD broth preparation
Bacteriological Agar	Sigma	A5306	For YPD agar preparation
NaH2PO4	Sigma	S8282	For SC broth preparation
(NH4)2SO4	Sigma	A4418	For SC broth preparation
Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate	Sigma	Y1251	For SC broth preparation
Yeast synthetic drop-Out medium supplements	Sigma	Y1501	For SC broth preparation
Ammonium sulfate granular	J.T. Baker	0792-R	For medium supplementation example
Resveratrol	Sigma	R5010	For medium supplementation example
Galactose	Sigma	G8270	For medium supplementation example
Sucrose	Sigma	S7903	For medium supplementation example
Absolut ethanol	Merck	107017	For medium supplementation example
Glycerol	J.T. Baker	2136-01	For medium supplementation example
GraphPad Prism	GraphPad Software		For data analysis
Honeycomb microplates	Thermo Scientific	9502550	For microplate cultures