Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

بروتوكول للسابقين فيفو الجهاز القرنية الثقافة النموذجية مفيدة للجرح شفاء الدراسات هو وصف. يمكن استخدام هذا النظام النموذجي لتقييم آثار عوامل لتعزيز الشفاء التجدد أو سمية العقاقير في بيئة متعددة الخلايا 3D منظم.

Abstract

القرنية وقد استخدمت على نطاق واسع كنظام نموذجي لدراسة التئام الجروح. القدرة على توليد واستخدام خلايا الثدييات الأولية في اثنين الأبعاد (2D) والثقافة (ثلاثي الأبعاد) الأبعاد الثلاثة قد ولدت ثروة معلومات ليس فقط حول البيولوجيا القرنية ولكن أيضا حول الجرح تضميد الجراح، والبيولوجيا أرومية، وتندب بشكل عام . وهدف البروتوكول هو نظام مقايسة للتحديد الكمي للتنمية أرومية، الذي يميز تندب. علينا أن نظهر ثقافة جهاز القرنية السابقين فيفو نموذج باستخدام عيون خنزير. في هذا كيراتيكتومي الأمامي الجرح، جرح القرنيات لا يزال في أنحاء العالم مع شفرة دائرية تسمى ترفين. يتم إزالة المكونات من حوالي 1/3 للقرنية الأمامي منها الظهارة والغشاء الطابق السفلي والجزء الأمامي ستروما. بعد إصابة، هي القرنيات قص من أنحاء العالم والتي شنت على قاعدة الكولاجين/أجار ومثقف لمدة أسبوعين في المصل تستكمل المتوسطة الحرة مع استقرار فيتامين C لزيادة تكاثر الخلايا وإفراز المصفوفة خارج الخلية من الخلايا الليفية المقيم. تفعيل ميوفيبروبلاستس في ستروما الأمامي يتجلى في القرنية تلتئم. يمكن استخدام هذا النموذج للاعتداء إغلاق الجرح، وضع علامات تليفية وميوفيبروبلاستس، ودراسات علم السموم. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن اختبار تأثيرات مثبطات جزيء صغير، فضلا عن تعداء siRNA الدهن بوساطة للجينات ضربة قاضية في هذا النظام.

Introduction

تندب في القرنية الناتجة عن الإصابة أو الصدمة أو الإصابة يمكن أن تؤدي إلى إضعاف نسبة تظليل وفقدان الرؤية الدائمة. ومن ثم، هناك حاجة ماسة لتحديد المسارات التي يمكن أن تكون مستهدفة للتدخل العلاجي. خيارات العلاج الحالية محدودة، وتتمثل أساسا في عمليات زرع القرنية، التي لا يمكن الوصول إلى المرضى عبر العالم. الإنسان (الشكل 1) والقرنية الحيوانية يمكن أن تستخدم ل 2D وخلية 3D ثقافة الدراسات1،2. يمكن الحصول على القرنيات الجثث البشرية لا تصلح لزرع من المصارف العين أو مصارف مركزية الأنسجة (الوطنية المرض بحوث التبادل (ندري))، ويمكن الحصول على عيون الحيوان من مسلخ. الابتدائي الخلايا الظهارية القرنية والليفية stromal وأكثر في الآونة الأخيرة، خلايا بطانية، يمكن عزل ومثقف من هذه الأنسجة لالتئام الجروح ودراسات علم السموم3،،من45. بالإضافة إلى أهمية فهم الأساس الجزيئي لأمراض العيون المسببة للعمى، جعلت إمكانية الحصول على القدرة على الثقافة الابتدائية الخلايا والأنسجة القرنية نظام نموذجا هاما للدراسة. القرنية مثالية لاختبار آثار وكلاء على تندب القرنية عادية تتسم بالشفافية وإنشاء أنواع معينة من الجروح نسبة تظليل أو ندبات تليفية (استعرض في6). في فيفو القرنية الجرح الشفاء نماذج عديدة أيضا على نطاق واسع استخدمت تندب الدراسات1. وقد استخدمت أقل السابقين فيفو القرنية الجرح الشفاء النموذجي7،8 هي تصف بالتفصيل هنا. والهدف من هذا الأسلوب لقياس نتائج تندب تتميز بصانعي تليفية في 3D متعددة الخلايا القرنية السابقين فيفو نموذج النظام.

إصابة الظهارة القرنية التي لا يخل الغشاء الظهارية عادة يغلق داخل 24-72 ح9. قريبا بعد إصابة، تبدأ الخلايا عند حافة ظهارة تنتشر وتهاجر إلى السطح الحر الظهارية، وإعادة تأسيس وظيفة الحاجز الظهارية. هذا النشاط تسلسلياً يليه تفعيل انتشار الخلايا القاعدية القرنية أولاً، وفي مرحلة لاحقة، من الخلايا السليفة التي تقع في منطقة حوفي الخارجي لتحقيق الانتعاش من الخلايا الظهارية الشامل10،11. غالباً ما تشفي هذه الجروح بدون تندب. ومع ذلك، النتائج جرح التي تخترق الغشاء الطابق السفلي ستروما غالباً ما في تشكيل ندبة1. بعد إصابة stromal القرنية، يتم ملؤها سدى مع خلايا أصول متعددة بما في ذلك الخلايا اللحمية المقيم المتباينة، فضلا عن المشتقة من نخاع العظم فيبروسيتيس12،،من1314. ندبات تليفية تتسم باستمرار ميوفيبروبلاستس في التئام الجروح. إظهار هذه ميوفيبروبلاستس المرضية الالتصاق المتزايد من خلال تراكم إينتيجرينس في الالتصاقات المحورية، وألياف الإجهاد أكتين (α-SMA) الهوس α-السلس العضلات والتنشيط المحلي للمصفوفة خارج الخلية (ECM)-المحتبسة الكامنة تحويل عامل النمو-بيتا (TGFβ). التفريق بين الخلايا الظهارية المشتقة، تعرف باسم الظهارية الانتقالية الوسيطة (EMT)، قد يسهم أيضا في ندبة تشكيل6.

هناك توازن دقيق بين الخلية التمايز والمبرمج بعد إصابة. بسبب الخرق في غشاء الطابق السفلي، عوامل النمو مثل عامل النمو المشتقة من الصفيحات (PDGF) و TGFβ من الدموع وظهاره يستحم ستروما، الذي يحفز التمايز أرومية، حلقة متواصلة autocrine TGFβ التنشيط، إفراز غير منظم تليفية ECM15،16. ويعزز استمرار ميوفيبروبلاستس في الجرح تلتئم الضباب والندوب في القرنية (الشكل 2). ومع ذلك، في ريجينيراتيفيلي تلتئم الجرح على الرغم من أن تطوير ميوفيبروبلاستس، أنهم أبوبتوسي وهكذا هي غائبة أو انخفاض ملحوظ في عدد في الأنسجة تلتئم في المرجع6،10(استعراض). وهكذا، قد ركزت البحوث على ندبات تليفية جزئيا على الأقل على استهداف الجزيئات التي تحول دون التنمية أرومية المفرط أو أرومية استمرار17،18. نظراً لاستمرار أرومية يميز المرض ندبات وتليفيه على حد سواء في جميع الأنسجة19، قد يكون من المفيد كنظام نموذجي لدراسة الآليات الخلوية العامة التليف القرنية.

في النظام النموذجي، هو إصابة القرنية بشفرة أسطواني يسمى ترفين في حين لا يزال في أنحاء العالم. البشرية ويمكن إصابة الخنازير القرنيات مع أما 6 أو 7 ملم تريفيني؛ للقرنيات الأرنب ترفين 6 مم المفضل. القرنية الخنزير مشابه في الحجم للقرنية البشرية. لأنها فعالة من حيث التكلفة ومتاحة بسهولة في إعداد كبيرة، والقرنيات خنزير تستخدم بشكل روتيني لثقافة الجهاز. وعلاوة على ذلك، قد دأبت كروسريكتيد الأجسام المضادة وسيرناس لتتفاعل مع الإنسان مع خنزير7. بعد إصابة، القرنيات هي قطع من أنحاء العالم مع ليمبوس سليمة والتي شنت على قاعدة أجار/الكولاجين. القرنيات تربى في وسائل الإعلام الحرة المصل بالإضافة إلى استقرت فيتامين (ج) لمحاكاة انتشار تنتجها الخلايا الليفية وإدارة المحتوى في المؤسسة ترسب20. إضافة المصل لا عوامل النمو لا بد للحث على تشكيل أرومية7. القرنيات بشكل روتيني ثابت وتجهيزها للأنسجة بعد أسبوعين ثقافة. للجينات ضربة قاضية، أو لاختبار آثار وكيلاً على التئام الجرح يمكن أن تعامل مع siRNA في الجرح بعد إصابة7 أو عامل القابلة لذوبان يمكن أن تضاف إلى وسائل الإعلام، على التوالي8.

Protocol

1-الجهاز الثقافة

  1. الأعمال التحضيرية
    1. إعداد أجار الحل كما يلي. وفي قارورة صغيرة، تعد أجار 1% و 1 ملغ/مل من الكولاجين البقري في دميم-F12 يصل إلى 20 مل. جلب ليغلي على طبق ساخن. وضع الحل في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. ضع الأنبوبة في حمام مائي على لوحة الساخن للحفاظ على الحل من ترسيخ.
    2. تحضير الوسائط الحرة المصل المكملة (سفم) وفقا لتكوين المنصوص عليه في الجدول للمواد.
      ملاحظة: المبلغ اللازم من سفم سيعد يعتمد على عدد القرنيات بحيث تتم معالجتها. عادة ما يكون 30 مل وسائط كافية للقرنيات 4.
  2. تشريح
    ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة في غطاء تشريح أو غطاء كيميائية. يتم شحنها في العيون مع أغطية لا تزال تعلق في أكياس فردية لحماية الكرات.
    1. إزالة الكرات من أغطية مع شفرة حافة مستقيمة جراحية على لوح تقطيع تنظيفها الإيثانول. إزالة الأنسجة الدهنية الزائدة من العين باستخدام شفرة أو مقصات صغيرة (الشكل 3 أ، 3).
    2. بعد إزالة الكرة الأرضية من الغطاء، عقد العالم جيدة مع الملقط وتراجع فورا العين في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS). وتراجع بسرعة x 3 في اليود 10% (في كوب 100 مل). وتراجع بسرعة x 2 في برنامج تلفزيوني (~ 100 مل في كوب، تغيير برنامج تلفزيوني في كثير من الأحيان).
    3. استخدام منشفة نظيفة أو الأنسجة، التفاف العين circumferentially مع ما يكفي من الضغط على سطح القرنية مشدود قطع مع ترفين.
      ملاحظة: الحرص على منع منشفة أو الأنسجة من الاتصال بالقرنية.
  3. مما أدى إلى إصابة
    1. استخدام ترفين 6 مم للجرح وسط القرنية. اختراق ظهارة وسدى الأمامي دون جرح سمك كامل من خلال القرنية كاملة.
      ملاحظة: إذا كان يتم اختراق البطانة، سيتبين فقدان الضغط وتسرب السوائل. وفي هذه الحالة يجب أن يتم تجاهل العين.
    2. ترفين في وسط القرنية، تدويره 180 درجة عكس اتجاه عقارب الساعة وعقارب الساعة 5 x (في كل مرة يتم تغيير الاتجاه أنه سيتم حساب كمرة واحدة) أثناء تطبيق الضغط الخفيف لتعميق الجرح.
      ملاحظة: الآن يجب أن يكون الجرح عميق ما يكفي للسماح رفرف أنسجة برفع استخدام زوج من الملقط. إذا كان هذا ليس هو الحال تكرار الخطوة 1-3-2.
    3. رفع رفرف من الحواف. في الوقت نفسه، أما باليد الأخرى أو مع شخص ثان، استخدم شفرة، خفض مواز للعالم لقطع الأنسجة كما الملقط الاستمرار في رفع قبالة القرنية الأمامية ضمن الهامش الجرح. وفي ختام هذه الخطوة ينبغي أن يكون هناك جرح دائري يقع في مركز القرنية (انظر الشكل 3 جيم، 3D).
  4. قطع وإزالة القرنية من أنحاء العالم
    1. عقد العين مع الأنسجة، جعل شق صغير 1 ملم بعيداً عن الحافة القرنية مع شفرة حيث يتم تضمين ليمبوس في ثقافة الجهاز.
    2. باستخدام الصغيرة، الوصول إلى مقص حاد شق بإنشائه في الخطوة السابقة قطع جميع أنحاء العالم، الاحتفاظ بهامش ملليمتر في جميع أنحاء القرنية للحفاظ ليمبوس سليمة.
    3. وضع القرنية في صحن 60 ملم مع 1 مل من برنامج تلفزيوني، الجانب الجرح لأسفل حتى المتصاعدة.
  5. تصاعد
    1. تأكد من أجار وصلت إلى درجة حرارة دافئة (حوالي 25 درجة مئوية).
    2. مع اثنين من أزواج من الملقط، إنشاء كوب بعقد الجانبان القرنية مع الجانب بطانية. إضافة حل أجار ارتفعت درجة حرارة تصل إلى القرنية باستخدام ماصة نقل عقيم حتى أنها كاملة.
    3. بعد أن يصلب أجار (عادة حوالي 30-45 ثانية) بعناية الوجه القرنية مع أجار إلى لوحة 60 ملم (رقم 3E). وتغطي بغطاء.
  6. الحضانة
    1. إضافة 4 مل سفم إلى اللوحة، الحفاظ على القرنيات في واجهة الهواء السائل على الحدود حوفي في 5% CO2 في 37 درجة مئوية. تحديث وسائل الإعلام بعد 24 ساعة وبعد ذلك مرة كل يومين.
      ملاحظة: إذا كان أداء تعداء داخل الجرح، حذف المضادات الحيوية حتى بعد تعداء.
    2. الرطب على سطح القرنية مرة واحدة يوميا بإضافة 1 قطره سفم من وسائل الإعلام مكيفة في الطبق للحفاظ على رطوبة. لهذا، تأخذ الطبق خارج الحاضنة ووضعه تحت غطاء محرك السيارة، وإزالة غطاء صحن، الرطب السطح مع وسائل الإعلام من طبق استخدام ماصة معقمة، تغطية مرة أخرى ووضعها مرة أخرى في الحاضنة.
    3. للجينات ضربة قاضية، علاج الجرح باستهداف الجين أو التحكم في siRNA هو الرصاصية إلى ناقل بوساطة الدهن حسب تعليمات المورد (انظر أدناه).
    4. مزيج 5 ميليلتر (50 بمول) من siRNA إلى 50 ميليلتر من المصل خفض الحد الأدنى الوسائط الأساسية (على سبيل المثال.، غروب-الفنزويلية). ميكس 2 ميليلتر من تعداء الكاشف إلى 50 ميليلتر من المصل خفض وسائل الإعلام. ترك هذا الجلوس لمدة 5 دقائق وثم مزجها.
    5. إضافة 200 ميليلتر من الوسائط المصل خفض الحد الأدنى إلى خليط كاشف/siRNA.
    6. "الماصة؛" دروبويسي على الجرح واحتضانها ح 3.
    7. تغسل siRNA من سطح القرنية مع وسائل الإعلام في الطبق. تغيير الوسائط حضانة سفم + المضادات الحيوية (انظر الجدول للمواد). تستمر الحضانة كما ذكر سابقا (الخطوات 1.6.1-1.6.2).

2-علم الأنسجة: مقاطع البارافين وإيمونوستينينج

  1. إعداد الأنسجة
    1. وبعد أسبوعين حضانة، إذا كان استخدام بعض الأنسجة لكمية الوقت الحقيقي بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (قرة-PCR) التحليل، قبل تحديد، قص القرنية في النصف من خلال الجرح. مكان هذا النصف أو ¼ فقط (أما هو ما يكفي من الأنسجة) إلى استقرار كاشف حماية الجيش الملكي النيبالي.
    2. استخدام مجموعة أدوات قياسية عزلة، عزل الحمض النووي الريبي وأداء بكر قرة.
      ملاحظة: وبدلاً من ذلك، الجزء الجرحى فقط يمكن عزل واختبار للتعبير الجيني.
    3. مكان الآخر نصف القرنية في أشرطة علم أمراض الأنسجة، وتغرق في مثبت (10% فورمالين) لمدة 2-4 أيام في درجة حرارة الغرفة (RT).
    4. البارافين تضمين هذا نصف الجرحى القرنية باستخدام التقنيات القياسية.
      ملاحظة: توجيه القرنية الجرحى لضمان أن تسفر تقطيع الأنسجة شريحة من القرنية.
  2. إيمونوستينينج باستخدام 3، 3 '--ديامينوبينزيديني (DAB)
    1. 1 يوم
      1. تسمية الشرائح بشكل صحيح باستخدام قلم رصاص. دي بارافينيزي الأنسجة بوضع الشرائح في جرة مع مسح عامل (التغييرات 2، 10 دقيقة).
      2. ترطيب الأنسجة بنقل الشرائح إلى إيثانول في خفض تركيزات (100%، 100%، 70%، 50%، dH2س، dH20، 5 دقائق لكل تغيير).
      3. إجراء استرداد مستضد مايكرويف الشرائح في جرة بلاستيكية مع سترات المخزن المؤقت (10 ملم، ودرجة الحموضة 6.4) لمدة 5 دقائق. أولاً دورة 5 دقيقة بقوة 50%. إعادة ملء الجرة مع المخزن المؤقت لسترات وتكرار. يبرد لمدة 10 دقائق.
      4. أغسل x 3 مع برنامج تلفزيوني، 2 دقيقة. بيرميبيليزي الأنسجة مع % 1 X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني 10 دقيقة في كتلة الرايت الجزأين مع 3% الماعز العادي المصل (خ ع) ح 1 في RT في الغرفة الرطبة.
      5. احتضان الأنسجة بجسم الأولية (1: 100 أو كما يوحي المورد) في 3% خ ع بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (300 ميليلتر كل شريحة).
    2. 2 يوم
      1. شطف الشرائح x 3 مع ببست (برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 1% 20 توين)، 2 دقيقة. وضع الشرائح في 3 ٪ ح2س2 ل 10 دقيقة لكتلة البيروكسيديز الذاتية. أغسل x 3 مع ببست، 2 دقيقة. احتضان الأقسام مع جسم الثانوي (1: 250) برنامج الصحة الإنجابية في 3% خ ع عن ح 1 في الرايت (300 ميليلتر كل شريحة).
      2. تغسل شرائح 3 x PBST، 2 دقيقة. التعامل مع الشرائح مع عدة الدأب. إضافة 300 ميليلتر/الشريحة للحد الأدنى 3 يغسل الشرائح مع dH2س 2 x (الانخفاضات السريعة).
      3. كونتيرستين مع توضع ليغسل س. 20 الشريحة مع dH2س 2 x (الانخفاضات السريعة). وصمة عار مع وكيل لالتشطيب شطف س. 20 درهم2س للأنسجة ديهيدراتي س. 20 بوضع الشرائح في زيادة تركيزات إيثانول (50%، 70%، 100%، 100%، جميع الانخفاضات السريعة).
      4. الجاف للشرائح على منشفة ورقية تحت غطاء محرك السيارة لمدة 10-20 دقيقة.
      5. تحميل الشرائح باستخدام 1 قطره من تركيب وسائط، الغطاء مع ساترة. التسمية ومخزن في الرايت
      6. صورة الشرائح تحت مجهر، والتحديد الكمي لإشارة البث الإذاعي الرقمي مع إيماجيج7 (انظر القسم 4).
  3. إيمونوستينينج: الأسفار
    1. في يوم 1 اتبع الخطوات الموضحة في الخطوة 2.2.1. نفذ الخطوات التالية في اليوم 2.
    2. شطف الشرائح x 3 في ببست لكل 2 دقيقة. احتضان الأقسام مع معلم fluorophore جسم الثانوية في 3% خ ع (1: 200) ح 1 في الرايت
    3. أغسل 3 x في ببست، 2 دقيقة. تحميل الشرائح باستخدام 1 قطره 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) تركيب وسائل الإعلام وتغطية مع ساترة. الجافة في منشفة ورقية تحت غطاء محرك السيارة للحد الأدنى 30 مخزن في الظلام في 4 درجات مئوية حتى تصوير الأسفار.
  4. تحديد مقدار استخدام "ي الصورة"
    1. تحميل إصدار "فيجي" إيماجيج، التي تشمل الإضافات اللازمة للبث الإذاعي الرقمي تلطيخ القياس الكمي.
    2. فتح صورة في فيجي وحدد صورة ← لون ← Deconvolution اللون.
    3. حدد "ح ربت" كوصمة عار وثم انقر فوق موافق. وسوف تظهر ثلاث صور جديدة. حدد الصورة التي تحتوي على تلطيخ الدأب فقط.
    4. لتحديد مقدار stromal تلطيخ فقط، استخدم الدالة ممحاة ImageJ لإزالة صورة الدأب الظهارة.
    5. حدد تحليل ← قياس (أو Ctrl + M) وسجل القيمة.

النتائج

إيمونوهيستوتشيميستري هو الفحص الأولية المستخدمة لتحليل نجاح السابقين فيفو الجرح تجربة الشفاء. ويصور الشكل 4 ظهارة وسدى الأمامي في الأنسجة التحكم (الشكل 4A, 4B). ست ساعات بعد إصابة، الظهارة كان غائبا (الشكل 4، 4 د<...

Discussion

ويصف هذا البروتوكول نموذج لدراسة التئام الجروح في بيئة ثلاثية الأبعاد طبقية طبيعية. استخدام جهاز الثقافة كوسيط بين الخلية والثقافة والدراسات المجراة في يقلل كثيرا من التكاليف، فضلا عن الحد من الإجراءات المتعلقة بالحيوانات الحية. 3D نماذج أخرى قد تم فائدة كبيرة في الميدان بما في ذلك ذاتية ...

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

هذا العمل كان يدعمها EY024942 R01 نيي المعاهد الوطنية للصحة، البحوث "منع العمى"، شمال ولاية الطبية جامعة غير المقيد أموال البحث، ومنطقة الليونز 20-يوسف مجهرية وتحليل الصور من مقاطع البارافين أجريت في "صميم مجهرية" و إعداد شرائح نسيجية أنجز في بيوريبوسيتوري وعلم الأمراض الأساسية في "مدرسة الطب آيكان" في جبل سيناء.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
PBSGibco10-010-023
Pen Strep MP Biomedicals91670049
Bovine Collagen SolutionAdvance Biomatrix5005
Pig eyes with lids attached Pel-freeze, ArkansasN/A
6.0 mm trephine KatenaK28014
Surgical Blade Personna0.009
Small scissorFisher895110
ForcepsFisher08953-F
Kim Wipes Kimberly-Clark™ 3412006-666
60 mm cell culture dishes Falcon08-772B
Supplemented Serum- Free media (SSFM)Add all of the following components to DMEM/F-12:  ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. 
DMEM/F-12Gibco11330
ITS Liquid Media Supplement SigmaI3146100X
RPMI 1640 Vitamins Solution SigmaR7256100X
GlutathioneSigmaG6013Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.
1% L-glutamine solution Gibco25030-081100X
MEM Non-essential amino acids solution Gibco11140100X
MEM Sodium pyruvate solution Gibco113601 M Stocks (1000X) and freeze in single use aliquits.  Use from freezer each time media is made.
ABAM SigmaA7292100X
Gentamicin Sigma30-005-CR200X
Vitamin C Wako070-04832-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)
10% Iodine Fisher ChemicalSI86-1
Tissue Path Cassettes Fisher22-272416
Normal Goat Serum (NGS)Jackson Immuno Research005-000-121We use 3% NGS
Mounting Media Thermo ScientificTA-030-FM
Safe Clear Fisher314-629
Ethyl AlcoholUltra Pure200CSGP200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) 
Sodium citrate FisherBP32710mM, pH 6.4
HematoxylinEMD MilliporeM10742500
Bluing agent Ricca Chemical Company220-106
1% Triton X-100Fisher9002-93-1Diluted in PBS
0.1% Tween 20 FisherBP337Diluted in PBS
3% Hydrogen Peroxide FisherH324
DAB Kit Vector LaboratoriesSK-4100
Agar Fisher BP1423-500Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL
ParafilmBermis13-374-12
Moist ChamberUse any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.
Lipofectamine 2000
Qiagen RNAprotect Cell ReagentQiagen 76104
Ambion PureLink RNA Mini KitThermo Scientific12183018A
Anti-Fibronectin-EDA AntibodySigmaF61401:200 Diluted in  3% normal goat serum
Anti-alpha smooth muscle actin AntibodySigmaA2547 or C6198 (cy3 conjugated)1:200 Diluted in 3% normal goat serum
Permafluor Thermo ScientificTA-030-FM
DAPI InvitrogenP36931
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP Invitrogen62-65201:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)
Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP Thermo ScientificPA1-859991:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3 Jackson Immuno Research115-165-1461:200 Diluted in  3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)
 Zeiss Axioplan2 ZeissMicroscope
SPOT-2Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MichiganCCD camera

References

  1. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121C, 178-193 (2014).
  2. Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e228-e238 (2011).
  3. Ronkko, S., Vellonen, K. S., Jarvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
  4. Bernstein, A. M., Twining, S. S., Warejcka, D. J., Tall, E., Masur, S. K. Urokinase receptor cleavage: a crucial step in fibroblast-to-myofibroblast differentiation. Molecular Biology of the Cell. 18 (7), 2716-2727 (2007).
  5. Zhu, Y. T., et al. Knockdown of both p120 catenin and Kaiso promotes expansion of human corneal endothelial monolayers via RhoA-ROCK-noncanonical BMP-NFkappaB pathway. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1509-1518 (2014).
  6. Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: The dark force in ocular wound healing and fibrosis. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 44-65 (2017).
  7. Gillespie, S. R., Tedesco, L. J., Wang, L., Bernstein, A. M. The deubiquitylase USP10 regulates integrin beta1 and beta5 and fibrotic wound healing. Journal of Cell Science. 130 (20), 3481-3495 (2017).
  8. Yang, Y., et al. TRPV1 potentiates TGFbeta-induction of corneal myofibroblast development through an oxidative stress-mediated p38-SMAD2 signaling loop. PLoS One. 8 (10), e77300 (2013).
  9. Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. Disruption of the basement membrane after corneal debridement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (5), 1045-1053 (2000).
  10. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  11. Echevarria, T. J., Di Girolamo, N. Tissue-regenerating, vision-restoring corneal epithelial stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 256-268 (2011).
  12. Wilson, S. E., Mohan, R. R., Hong, J. W., Lee, J. S., Choi, R. The wound healing response after laser in situ keratomileusis and photorefractive keratectomy: elusive control of biological variability and effect on custom laser vision correction. Archives of Ophthalmology. 119 (6), 889-896 (2001).
  13. Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
  14. Lassance, L., Marino, G. K., Medeiros, C. S., Thangavadivel, S., Wilson, S. E. Fibrocyte migration, differentiation and apoptosis during the corneal wound healing response to injury. Experimental Eye Research. 170, 177-187 (2018).
  15. Jester, J. V., Ho-Chang, J. Modulation of cultured corneal keratocyte phenotype by growth factors/cytokines control in vitro contractility and extracellular matrix contraction. Experimental Eye Research. 77 (5), 581-592 (2003).
  16. Gallego-Munoz, P., et al. Effects of TGFbeta1, PDGF-BB, and bFGF, on human corneal fibroblasts proliferation and differentiation during stromal repair. Cytokine. 96, 94-101 (2017).
  17. Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biology Reports. 2, 78 (2010).
  18. Lagares, D., et al. Targeted apoptosis of myofibroblasts with the BH3 mimetic ABT-263 reverses established fibrosis. Science Translational Medicine. 9 (420), (2017).
  19. Hinz, B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair. Journal of Investigative Dermatology. 127 (3), 526-537 (2007).
  20. Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1382-1388 (2010).
  21. Henderson, N. C., et al. Targeting of alphav integrin identifies a core molecular pathway that regulates fibrosis in several organs. Nature Medicine. 19 (12), 1617-1624 (2013).
  22. Muro, A. F., et al. An essential role for fibronectin extra type III domain A in pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (6), 638-645 (2008).
  23. Shinde, A. V., et al. The alpha4beta1 integrin and the EDA domain of fibronectin regulate a profibrotic phenotype in dermal fibroblasts. Matrix Biology. 41, 26-35 (2014).
  24. White, E. S., Muro, A. F. Fibronectin splice variants: understanding their multiple roles in health and disease using engineered mouse models. IUBMB Life. 63 (7), 538-546 (2011).
  25. Walraven, M., Hinz, B. Therapeutic approaches to control tissue repair and fibrosis: Extracellular matrix as a game changer. Matrix Biology. , (2018).
  26. Rosenbloom, J., Ren, S., Macarak, E. New frontiers in fibrotic disease therapies: The focus of the Joan and Joel Rosenbloom Center for Fibrotic Diseases at Thomas Jefferson University. Matrix Biology. 51, 14-25 (2016).
  27. Liu, J., et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13. Cell. 147 (1), 223-234 (2011).
  28. Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2011).
  29. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  30. Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
  31. Miron-Mendoza, M., Graham, E., Kivanany, P., Quiring, J., Petroll, W. M. The Role of Thrombin and Cell Contractility in Regulating Clustering and Collective Migration of Corneal Fibroblasts in Different ECM Environments. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (3), 2079-2090 (2015).
  32. Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 262-272 (2010).
  33. Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-Met gene. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (4), 1970-1980 (2010).
  34. Kramerov, A. A., Saghizadeh, M., Ljubimov, A. V. Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells. Journal of Visualized Experiments. (110), e54058 (2016).
  35. Cho, S. Y., Kim, M. S., Oh, S. J., Chung, S. K. Comparison of synthetic glues and 10-0 nylon in rabbit lamellar keratoplasty. Cornea. 32 (9), 1265-1268 (2013).
  36. Sharma, A., Mehan, M. M., Sinha, S., Cowden, J. W., Mohan, R. R. Trichostatin a inhibits corneal haze in vitro and in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (6), 2695-2701 (2009).
  37. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Torricelli, A. A., Santhanam, A., Wilson, S. E. Corneal Molecular and Cellular Biology for the Refractive Surgeon: The Critical Role of the Epithelial Basement Membrane. Journal of Refractive Surgery. 32 (2), 118-125 (2016).
  38. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Santhanam, A., Torricelli, A. A. M., Wilson, S. E. Regeneration of Defective Epithelial Basement Membrane and Restoration of Corneal Transparency After Photorefractive Keratectomy. Journal of Refractive Surgery. 33 (5), 337-346 (2017).
  39. Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Experimental Eye Research. 161, 101-105 (2017).
  40. Janin-Manificat, H., et al. Development of ex vivo organ culture models to mimic human corneal scarring. Molecular Vision. 18, 2896-2908 (2012).
  41. Mohan, R. R., et al. Apoptosis, necrosis, proliferation, and myofibroblast generation in the stroma following LASIK and PRK. Experimental Eye Research. 76 (1), 71-87 (2003).
  42. Anumanthan, G., et al. KCa3.1 ion channel: A novel therapeutic target for corneal fibrosis. PLoS One. 13 (3), e0192145 (2018).
  43. Chandler, H. L., Colitz, C. M., Lu, P., Saville, W. J., Kusewitt, D. F. The role of the slug transcription factor in cell migration during corneal re-epithelialization in the dog. Experimental Eye Research. 84 (3), 400-411 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

144

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved