JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Eski bir protokol vivo kornea organ kültür model çalışmaları şifa yara açıklanan için yararlı. Bu modeli sistem rejeneratif iyileşmesine katkıda bulunmak üzere ajanlar veya ilaç toksisitesi organize 3D çok hücreli ortamında etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.

Özet

Kornea kapsamlı bir model sistem olarak yara iyileşmesi çalışma kullanılmaya başlanmıştır. Yeteneği oluşturmak ve iki boyutlu (2D) ve üç boyutlu (3D) kültür birincil memeli hücrelerinde kullanmak sadece kornea biyoloji hakkında aynı zamanda şifa, myofibroblast biyoloji ve genel olarak yara yara hakkında bilgi hazinesi üretti . Protokol amacı skarlasma karakterize myofibroblast geliştirme miktarının bir tahlil sistemidir. Biz domuz gözleri kullanarak bir kornea organ kültür ex vivo modeli göstermek. Yarası bu ön keratectomy içinde kornealar hala dünya içinde bir trephine olarak adlandırılan bir dairesel bıçakla yaralı. Bir fiş yaklaşık 1/3 ön kornea epitel, membran ve stroma ön parçası gibi kaldırılır. Yaralama sonra kornealar dünyanın gelen kesmek, kollajen/agar üste monte ve stabilize hücre çoğalması ve hücre dışı matriks salgılanmasını artırmak için C vitamini ile desteklenmiş serum özgür ortamda iki haftadır ikamet fibroblastlar tarafından kültürlü. Myofibroblasts anterior stroma içinde aktivasyonu iyileşmiş kornea belirgindir. Bu model yara kapatma, myofibroblasts ve fibrotik işaretleri ve toksikoloji çalışmaları için tahlil için kullanılabilir. Buna ek olarak, küçük molekül inhibitörleri yanı sıra lipit-aracılı siRNA transfection gen nakavt için etkileri bu sistemi test edilebilir.

Giriş

Yaralanma, travma ya da enfeksiyon sonucu kornea skarlasma opaklıklar ve kalıcı görme kaybı zayıflatıcı için yol açabilir. Böylece, terapötik müdahale için yönlendirilebilir yolları tanımlamak için kritik bir ihtiyaç vardır. Mevcut tedavi seçenekleri sınırlı ve dünya çapında hastalar için erişilebilir değildir öncelikle kornea nakillerine oluşur. İnsan (Şekil 1) ve hayvan kornealar-ebilmek var olmak kullanmak için 2D ve 3D hücre kültürü çalışmaları1,2. İnsan kadavra kornealar nakil için uygun değildir göz bankaları veya merkezi doku bankaları (Ulusal hastalık araştırma değişim (NDRI)) elde edilebilir ve hayvan gözleri bir mezbaha elde edilebilir. Birincil kornea epitel hücreleri, stromal fibroblastlar ve daha yakın, endotel hücreleri, izole ve olması için yara iyileşmesi bu dokularda gelen kültürlü ve toksikoloji3,4,5çalışmalar. Göz hastalığı kör moleküler temelini anlamak önemi ek olarak, çalışma için bir önemli model sistemi kornea doku ve kültür primer hücre yeteneği erişilebilirliğini yaptı. Korneanın normal kornea şeffaf ve opaklıklar veya fibrotik izleri (6' gözden) belirli türden yaralar oluşturmak gibi yara izi üzerinde ajanların etkileri test etmek için idealdir. Birkaç vivo içinde kornea yara iyileşme modelleri Ayrıca kapsamlı çalışmalar1yara izi için kullanılmıştır. Daha az kullanılan eski olmuştur vivo kornea yara burada ayrıntılı olarak açıklayan şifa modeli7,8 . Bu yöntemin skarlasma sonuçları çok hücreli bir 3D fibrotik yapımcıları ile karakterize ölçmek için hedeftir kornea ex vivo modeli sistemi.

Bu epitelyal membran normalde ihlal etmediği yaralama kornea epitel 24-72 h9içinde kapanır. Yakında yaralama sonra hücreleri epitel kenarında yayılan ve ücretsiz epitel yüzeye epitel bariyer fonksiyonu yeniden kurmak için geçiş yapma başlayın. Bu etkinlik ardışık olarak kornea bazal hücre çoğalması etkinleştirme tarafından ilk ve, bir sonraki aşamada, kurtarma epitel hücre kitle10,11ulaşmak için dış limbal bölgede bulunan öncü hücrelerinin içinde gelir. Bu yaralar kez skarlasma olmaksizin iyilesmektedir. Ancak, membran kez stroma nüfuz bir yara yara oluşumu1sonuç. Kornea stromal yaralama sonra stroma farklılaştırılmış ikamet stromal hücreler kemik iliği türevi fibrocytes12,13,14gibi birden çok kökenli hücreleri ile doldurulur. Fibrotik yara iyileştirici bir yara myofibroblasts sebat karakterizedir. Bu patolojik myofibroblasts integrinler odak yapışıklıklar, contractile α-düz kas aktin (α-SMA) stres lifleri ve hücre dışı matriks (ECM) yerel etkinleştirme birikimi ile artan yapışma göstermek-münzevi gizli dönüştürme büyüme faktörü-beta (TGFβ). Epitel mezenkimal geçiş (EMT), bilinen, türetilmiş epitel hücreleri farklılaşma da oluşumu6scar için katkıda bulunabilir.

Yaralama sonra hücre farklılaşma ve Apoptozis arasında hassas bir denge olduğunu. Trombosit-türevi büyüme faktörü (PDGF) ve TGFβ gelen gözyaşları ve epitel myofibroblast farklılaşma, TGFβ harekete geçirmek, sürekli otokrin döngüsünü inducing stroma, banyo yapma gibi membran ihlali nedeniyle, büyüme faktörleri ve salgı dağınık fibrotik ECM15,16. İyileşmiş yara myofibroblasts sebat haze ve kornea (Şekil 2) skarlasma teşvik etmektedir. Ancak, regeneratively iyileşmiş yara myofibroblasts geliştirmek rağmen onlar apoptose ve böylece yok olan veya önemli ölçüde azaltılmış numarası (başvuru6,10dakika sonra gözden) iyileşmiş doku. Böylece, fibrotik skarlasma araştırma en azından kısmen aşırı myofibroblast geliştirme veya myofibroblast sebat17,18önlemek molekülleri hedefleme üzerinde odaklanmıştır. Çünkü tüm dokularda19skarlasma ve fibrotik hastalığında myofibroblast sebat karakterize, kornea fibrozis genel hücresel mekanizmaları incelemek için bir model sistem olarak yararlı olabilir.

Modeli sistemimizde bir trephine hala içinde iken dünya denilen silindirik bir bıçak ile kornea yaralı. İnsan ve domuz kornealar yaralı ya da bir 6 veya 7 mm trephine ile; tavşan kornealar için 6 mm trephine tercih edilir. Domuz kornea insan kornea boyutunda benzer. Uygun maliyetli ve çok sayıda hazır oldukları için domuz kornealar rutin olarak organ kültür için kullanılır. Ayrıca, antikorlar ve insan ile tepki için yapılan çift sürekli olarak domuz7ile cross-reacted. Yaralama sonra kornealar limbus ile dünya üzerinden olduğu gibi kesilir ve bir agar/kollajen üzerinde temel monte. Kornealar serum serbest ortamda kültürlenir Ayrıca fibroblast proliferasyonu ve ECM ifade20benzetimi yapmak için C vitamini stabilize. Ne serum eklenmesi ne de büyüme faktörleri myofibroblast oluşumu7ikna etmek için ihtiyaç vardır. Kornealar düzenli olarak sabit ve histoloji için kültür iki hafta sonra işlenir. Gen nakavt veya yara iyileşmesi üzerinde bir ajan etkilerini test etmek için yara ile siRNA yarada7 yaralama sonra tedavi edilebilir veya çözünür bir ajan medya için sırasıyla8eklenebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. organ kültür

  1. Hazırlıklar
    1. Agar çözüm aşağıdaki gibi hazırlayın. Küçük bir şişeye %1 agar ve DMEM-F12 1 mg/mL sığır kolajen hazırlamak ilâ 20 mL. Sıcak plaka üzerinde kaynamaya getir. Çözüm 50 mL konik tüp içine koymak. Tüp güçlendirilerek gelen çözüm tutmak için sıcak tabakta su banyosu yerleştirin.
    2. İlave serum-ücretsiz medya (SSFM) göre sağlanan Malzemeler tablokompozisyon hazırlamak.
      Not: SSFM hazırlıklı olmak için gerekli miktarı işlenecek kornealar sayısına bağlıdır. Genellikle 30 mL 4 kornealar için yeterli ortamıdır.
  2. Diseksiyon
    Not: Bu adım bir diseksiyon başlık veya kimyasal bir başlık yerine getirmek. Gözleri hala küreler korumak için bireysel torbalara bağlı kapakları ile sevk edilir.
    1. Küre etanol temizlenmesi doğrama panosunda bir düz-kenar cerrahi bıçak ile kapakları kaldırın. Aşırı yağ dokusunda bir bıçak veya küçük makas (Şekil 3A, 3B) kullanılarak gözünden kaldırın.
    2. Dünya kapak kaldırma sonra Dünya özafagusu forseps ile tutun ve hemen fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) gözüne batır. Hızlı bir şekilde o eğim % 10 iyot (içinde 100 mL kabı) 3 x. Hızlı bir şekilde PBS (bir ölçek, değişiklik PBS sık ~ 100 mL) 2 x daldırma.
    3. Temiz bir havlu veya doku kullanarak, çepeçevre yeterince baskı ile trephine kesmek için gergin bir kornea yüzey için gözle sarın.
      Not: havlu veya doku kornea iletişim kurmanızı önlemek için dikkat ediniz.
  3. Yaralama
    1. 6 mm trephine kornea merkezi yarası için kullanın. Epitel ve anterior stroma bir tam-kalınlık yara yoluyla tüm kornea yapmadan nüfuz.
      Not: Endotel nüfuz, basınç ve sızıntı sıvı kaybı görülecektir. Bu durumda göz atılmalıdır.
    2. Trephine kornea ortasına yerleştirin, 180 ° saat yönünde ve saat yönünün tersine 5 döndürün x (yönü değişti her zaman o bir kez kabul edilir) yara derinleştirmek için hafif basınç uygularken.
      Not: Yara şimdi forseps çifti kullanılarak kaldırılması bir doku kapak izin vermek için yeterince derin olmalıdır. Bu durumda tekrar adım 1.3.2 değilse.
    3. Kenarlarından kapağı kaldırın. Aynı zamanda, diğer el ile veya ikinci bir kişi ile paralel olarak dünya forseps kapalı yara kenar boşluğu içinde ön kornea kaldırmaya devam ederken dokuyu kesip kesme bir bıçak kullanın. Bu adım sonuç olarak (bkz: Şekil 3 C, 3D) kornea merkezinde yer alan dairesel bir yara olması gerekirdi.
  4. Kesme ve kornea Globe'dan kaldırma
    1. Limbus organ kültüründe eklenmesi doku gözle holding, korneanın küçük bir insizyon attım 1 mm kenar uzak bir bıçak ile olun.
    2. Küçük kullanarak, keskin makas milimetre kenar boşluğunu limbus sağlam tutmak için kornea boyunca tüm dünyada kesmek için önceki adımda oluşturduğunuz kesi erişimi.
    3. PBS, yara yan 1 mL ile 60 mm çanak kornea montaj kadar yerleştirin.
  5. Montaj
    1. Agar bir sıcak sıcaklık (yaklaşık 25 ° C) geldi emin olun.
    2. Forseps iki çift ile bir fincan korneanın endotel yan yüzünde iki tutarak oluşturun. Sıcak-up agar çözüm dolu olduğu kadar steril transfer pipet kullanarak kornea ekleyin.
    3. Agar sertleşir sonra (genellikle yaklaşık 30-45 s) dikkatle kornea agar ile 60 mm plaka (Şekil 3E) çevirmek. Bir kapak ile kapak.
  6. Kuluçka
    1. Plakasına kornealar vasıl 37 ° C'de % 5 CO2 limbal sınırında bir hava-sıvı arayüzey Bakımı SSFM 4 mL ekleyin Medya 24 h ve bundan sonra her gün sonra yenileyin.
      Not: Bir transfection yara içine gerçekleştirmek ise, transfection kadar sonra antibiyotik gözardı et.
    2. Günde bir kez kornea yüzey nemi korumak için çanak şartına medyada SSFM 1 damla ekleyerek ıslak. Bunun için bulaşık kuluçka makinesi dışında bu başlık altında yer, çanak kapağı kaldırmak, steril bir pipet kullanarak çanak medyadan ile yüzey ıslak, tekrar kapak alıp geri kuluçka makinesi.
    3. Gen köşenize için gen hedeflemeyle yarayı tedavi veya complexed lipid-aracılı taşıyıcıya üreticinin yönergeleri (aşağıya bakın) göre siRNA kontrol.
    4. Mix 5 µL (50 pmol) indirimli serum minimum temel medya 50 µL içine siRNA (Örn., Opti-MEM). Mix 2 µL transfection reaktif azaltılmış-serum medya 50 µL içine. Bu sit 5 min için izin ve sonra bunları karıştırın.
    5. Azaltılmış-serum en az medya 200 µL reaktif/siRNA karışıma ekleyin.
    6. Dropwise yara pipet ve 3 h kuluçkaya.
    7. SiRNA çanak medyası ile kornea yüzeyinden dışarı yıkamak. Kuluçka medya değiştirmek için SSFM + ( Tablo reçetesigörmek) antibiyotik. Kuluçka (adımları 1.6.1-1.6.2) daha önce belirttiğimiz gibi devam edin.

2. Histoloji: Parafin kesitler ve Immunostaining

  1. Doku hazırlanıyor
    1. İki haftalık kuluçka sonra bazı doku kornea yarısı boyunca yara kesilmiş sabitleme önce nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) analizi için kullanıyorsanız. Bu yarım veya tek ¼ yerleştirin (yeterli doku da) RNA korumak reaktif sabitleme içine.
    2. Bir standart izolasyon kit kullanarak, RNA yalıtmak ve qRT-PCR gerçekleştirin.
      Not: Alternatif olarak, yaralı bölümü yalnızca getirilebilir izole ve gen ekspresyonu için test edilmiştir.
    3. Diğer yarısı kornea dokusu patoloji kaset yerleştirin ve oda sıcaklığında (RT) 2-4 gün için sabitleştirici (% 10 formalin) daldırın.
    4. Parafin bu standart yöntemlerle yaralı kornea yarısı gömün.
      Not: Yaralı kornea dokusu kesit kesit kornea üretecek emin olmak için gelecek şekilde yönlendirin.
  2. Immunostaining 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) kullanarak
    1. Gün 1
      1. Etiket düzgün bir kalem kullanarak slaytlar. Doku Ajan (2 değişiklik, 10 dk) temizlenmesi ile bir kavanoz içine slaytlar yerleştirerek de-paraffinize.
      2. Doku konsantrasyonları (% 100, % 100, % 70, %50, dH2O, dH20, her değişiklik için 5 dk) azalan, etanol içine slaytlar aktararak rehydrate.
      3. Antijen alma sitrat arabellek (10 mM, pH 6.4) 5 min için plastik bir kavanoza slaytlar mikrodalga tarafından gerçekleştirin. İlk 5 dk % 50 güç döngüsü. Sitrat arabelleği ile kavanoz dolum ve tekrarlayın. 10 dakikadır sakin olun.
      4. PBS ile 3 x 2 dakika yıkayın. Doku % 1 ile % 3 normal keçi serum (NGS) RT nemli odasında 1 h için PBS 10dk RT. bloğundaki Triton X-100 bölümleri permeabilize.
      5. Birincil antikor dokuyla kuluçkaya (1: 100 veya tedarikçi da anlaşılacağı gibi) 4 ° c (slayt başına 300 µL) NGS yılında % 3 gecede.
    2. 2. gün
      1. Durulama slaytlar PBST ile 3 x (PBS artı % 1 ara 20), 2 dak. Slaytlar % 3 H2O2 endojen peroksidaz engellemek 10 dakika yerleştirin. 3 x 2 dk PBST ile yıkayın. HRP ikincil antikor (1:250) %3 bölümlerle kuluçkaya NGS RT, 1 h için (slayt başına 300 µL).
      2. Slaytlar 3 yıkama x PBST, 2 dak. Slaytlar DAB kiti ile tedavi. 300 eklemek µL/slayt 3 dk. Yıkama için slaytlar ile dH2O 2 x (hızlı dips).
      3. 20 s. Yıkama için hematoksilen ile slayt dH2O 2 x (hızlı dips) ile counterstain. DH2O yerleştirerek 20 s. Dehydrate doku için 20 s. durulama için mavileştirme Aracısı ile leke etanol (% 50, % 70, % 100, %100, tüm hızlı dips) konsantrasyonları artan içine slaytlar.
      4. 10-20 dk için başlık altında bir kağıt havlu kuru slaytlarda.
      5. Medya, coverslip ile kapak montaj 1 damla kullanarak slaytları bağlayın. Etiket ve RT. mağazasında
      6. Mikroskop altında slayt görüntü ve DAB sinyal ImageJ7 (bakınız Bölüm 4) ile ölçmek.
  3. Immunostaining: floresan
    1. Gün 1 2.2.1. adımda anlatılan adımları izleyin. 2. gün'deaşağıdaki adımları.
    2. Durulama PBST 3 x 2 min için slaytlar. Fluorophore öğesini ikincil antikor %3 bölümlerle kuluçkaya NGS (1: 200) için 1 h RT.
    3. 3 x 2 dk PBST içinde yıkayın. Bir coverslip ile 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) montaj medya ve kapak 1 damla kullanarak slaytları bağlayın. Karanlıkta floresans görüntüleme kadar 4 ° C'de 30 dk mağaza için başlık altında kağıt havlu üzerinde kuru.
  4. Görüntü J kullanarak miktar
    1. DAB miktar boyama için gerekli eklentileri içerir ImageJ "Fiji" sürümünü karşıdan yükleyin.
    2. Fiji ve'yi seçin bir görüntüyü açmak görüntü → → renk renk Deconvolution.
    3. "H DAB" leke seçin ve Tamam'ı tıklatın. Üç yeni fotoğraf-ecek gözükmek. Tek DAB boyama içeren görüntü seçin.
    4. Sadece boyama stromal ölçmek için epitel DAB yansımadan kaldırmak için ImageJ silgi işlevini kullanın.
    5. Seçin → analiz ölçü birimi (ya da Ctrl + M) ve değeri kaydedin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

İmmünhistokimya olduğunu kullanılan birincil tahlil eski başarısını çözümlemek için şifa deney vivo yara. Şekil 4 epitel ve denetim doku (Şekil 4A, 4B) ön stroma gösteriyor. Altı saat sonra yaralama, epitel (Şekil 4 c, 4 D) yapıldı. Beklendiği gibi yaralama sonra altı gün epitel (4E rakam, 4F) reg...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu iletişim kuralı bir doğal tabakalı 3D ortamda yara iyileşmesi eğitim için bir modeli açıklar. Bir ara içinde vivo çalışmalar arasındaki hücre kültürü olarak organ kültür kullanımı yanı sıra canlı hayvanlar üzerinde azalan bakiyeli yönergeleri maliyeti önemli ölçüde azaltır. Diğer 3D modelleri kollajen jelleri birincil insan kornea fibroblastlar2 ya da bu aynı hücrelere yapılan kendi kendine sentezleme dahil olmak üzere alana büyük fayda hayvan kaynaklı co...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

Bu eser NIH NEI R01 EY024942, araştırma önlemek körlük, şehir dışında Üniversitesi Tıbbi sınırsız Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir ve aslanlar bölge 20-Y. mikroskobu ve görüntü analizi parafin bölümlerin mikroskobu özünde gerçekleştirilen ve histolojik slayt hazırlama Biorepository ve Sina Dağı, Icahn Tıp Fakültesi Patoloji özünde gerçekleştirildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
PBSGibco10-010-023
Pen Strep MP Biomedicals91670049
Bovine Collagen SolutionAdvance Biomatrix5005
Pig eyes with lids attached Pel-freeze, ArkansasN/A
6.0 mm trephine KatenaK28014
Surgical Blade Personna0.009
Small scissorFisher895110
ForcepsFisher08953-F
Kim Wipes Kimberly-Clark™ 3412006-666
60 mm cell culture dishes Falcon08-772B
Supplemented Serum- Free media (SSFM)Add all of the following components to DMEM/F-12:  ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. 
DMEM/F-12Gibco11330
ITS Liquid Media Supplement SigmaI3146100X
RPMI 1640 Vitamins Solution SigmaR7256100x
GlutathioneSigmaG6013Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.
1% L-glutamine solution Gibco25030-081100x
MEM Non-essential amino acids solution Gibco11140100x
MEM Sodium pyruvate solution Gibco113601 M Stocks (1,000x) and freeze in single use aliquits.  Use from freezer each time media is made.
ABAM SigmaA7292100x
Gentamicin Sigma30-005-CR200x
Vitamin C Wako070-04832-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)
10% Iodine Fisher ChemicalSI86-1
Tissue Path Cassettes Fisher22-272416
Normal Goat Serum (NGS)Jackson Immuno Research005-000-121We use 3% NGS
Mounting Media Thermo ScientificTA-030-FM
Safe Clear Fisher314-629
Ethyl AlcoholUltra Pure200CSGP200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) 
Sodium citrate FisherBP32710 mM, pH 6.4
HematoxylinEMD MilliporeM10742500
Bluing agent Ricca Chemical Company220-106
1% Triton X-100Fisher9002-93-1Diluted in PBS
0.1% Tween 20 FisherBP337Diluted in PBS
3% Hydrogen Peroxide FisherH324
DAB Kit Vector LaboratoriesSK-4100
Agar Fisher BP1423-500Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL
ParafilmBermis13-374-12
Moist ChamberUse any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.
Lipofectamine 2000
Qiagen RNAprotect Cell ReagentQiagen 76104
Ambion PureLink RNA Mini KitThermo Scientific12183018A
Anti-Fibronectin-EDA AntibodySigmaF61401:200 Diluted in  3% normal goat serum
Anti-alpha smooth muscle actin AntibodySigmaA2547 or C6198 (cy3 conjugated)1:200 Diluted in 3% normal goat serum
Permafluor Thermo ScientificTA-030-FM
DAPI InvitrogenP36931
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP Invitrogen62-65201:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)
Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP Thermo ScientificPA1-859991:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3 Jackson Immuno Research115-165-1461:200 Diluted in  3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)
 Zeiss Axioplan2 ZeissMicroscope
SPOT-2Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MichiganCCD camera

Referanslar

  1. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121C, 178-193 (2014).
  2. Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e228-e238 (2011).
  3. Ronkko, S., Vellonen, K. S., Jarvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
  4. Bernstein, A. M., Twining, S. S., Warejcka, D. J., Tall, E., Masur, S. K. Urokinase receptor cleavage: a crucial step in fibroblast-to-myofibroblast differentiation. Molecular Biology of the Cell. 18 (7), 2716-2727 (2007).
  5. Zhu, Y. T., et al. Knockdown of both p120 catenin and Kaiso promotes expansion of human corneal endothelial monolayers via RhoA-ROCK-noncanonical BMP-NFkappaB pathway. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1509-1518 (2014).
  6. Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: The dark force in ocular wound healing and fibrosis. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 44-65 (2017).
  7. Gillespie, S. R., Tedesco, L. J., Wang, L., Bernstein, A. M. The deubiquitylase USP10 regulates integrin beta1 and beta5 and fibrotic wound healing. Journal of Cell Science. 130 (20), 3481-3495 (2017).
  8. Yang, Y., et al. TRPV1 potentiates TGFbeta-induction of corneal myofibroblast development through an oxidative stress-mediated p38-SMAD2 signaling loop. PLoS One. 8 (10), e77300(2013).
  9. Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. Disruption of the basement membrane after corneal debridement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (5), 1045-1053 (2000).
  10. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  11. Echevarria, T. J., Di Girolamo, N. Tissue-regenerating, vision-restoring corneal epithelial stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 256-268 (2011).
  12. Wilson, S. E., Mohan, R. R., Hong, J. W., Lee, J. S., Choi, R. The wound healing response after laser in situ keratomileusis and photorefractive keratectomy: elusive control of biological variability and effect on custom laser vision correction. Archives of Ophthalmology. 119 (6), 889-896 (2001).
  13. Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
  14. Lassance, L., Marino, G. K., Medeiros, C. S., Thangavadivel, S., Wilson, S. E. Fibrocyte migration, differentiation and apoptosis during the corneal wound healing response to injury. Experimental Eye Research. 170, 177-187 (2018).
  15. Jester, J. V., Ho-Chang, J. Modulation of cultured corneal keratocyte phenotype by growth factors/cytokines control in vitro contractility and extracellular matrix contraction. Experimental Eye Research. 77 (5), 581-592 (2003).
  16. Gallego-Munoz, P., et al. Effects of TGFbeta1, PDGF-BB, and bFGF, on human corneal fibroblasts proliferation and differentiation during stromal repair. Cytokine. 96, 94-101 (2017).
  17. Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biology Reports. 2, 78(2010).
  18. Lagares, D., et al. Targeted apoptosis of myofibroblasts with the BH3 mimetic ABT-263 reverses established fibrosis. Science Translational Medicine. 9 (420), (2017).
  19. Hinz, B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair. Journal of Investigative Dermatology. 127 (3), 526-537 (2007).
  20. Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1382-1388 (2010).
  21. Henderson, N. C., et al. Targeting of alphav integrin identifies a core molecular pathway that regulates fibrosis in several organs. Nature Medicine. 19 (12), 1617-1624 (2013).
  22. Muro, A. F., et al. An essential role for fibronectin extra type III domain A in pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (6), 638-645 (2008).
  23. Shinde, A. V., et al. The alpha4beta1 integrin and the EDA domain of fibronectin regulate a profibrotic phenotype in dermal fibroblasts. Matrix Biology. 41, 26-35 (2014).
  24. White, E. S., Muro, A. F. Fibronectin splice variants: understanding their multiple roles in health and disease using engineered mouse models. IUBMB Life. 63 (7), 538-546 (2011).
  25. Walraven, M., Hinz, B. Therapeutic approaches to control tissue repair and fibrosis: Extracellular matrix as a game changer. Matrix Biology. , (2018).
  26. Rosenbloom, J., Ren, S., Macarak, E. New frontiers in fibrotic disease therapies: The focus of the Joan and Joel Rosenbloom Center for Fibrotic Diseases at Thomas Jefferson University. Matrix Biology. 51, 14-25 (2016).
  27. Liu, J., et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13. Cell. 147 (1), 223-234 (2011).
  28. Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2011).
  29. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  30. Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
  31. Miron-Mendoza, M., Graham, E., Kivanany, P., Quiring, J., Petroll, W. M. The Role of Thrombin and Cell Contractility in Regulating Clustering and Collective Migration of Corneal Fibroblasts in Different ECM Environments. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (3), 2079-2090 (2015).
  32. Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 262-272 (2010).
  33. Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-Met gene. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (4), 1970-1980 (2010).
  34. Kramerov, A. A., Saghizadeh, M., Ljubimov, A. V. Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells. Journal of Visualized Experiments. (110), e54058(2016).
  35. Cho, S. Y., Kim, M. S., Oh, S. J., Chung, S. K. Comparison of synthetic glues and 10-0 nylon in rabbit lamellar keratoplasty. Cornea. 32 (9), 1265-1268 (2013).
  36. Sharma, A., Mehan, M. M., Sinha, S., Cowden, J. W., Mohan, R. R. Trichostatin a inhibits corneal haze in vitro and in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (6), 2695-2701 (2009).
  37. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Torricelli, A. A., Santhanam, A., Wilson, S. E. Corneal Molecular and Cellular Biology for the Refractive Surgeon: The Critical Role of the Epithelial Basement Membrane. Journal of Refractive Surgery. 32 (2), 118-125 (2016).
  38. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Santhanam, A., Torricelli, A. A. M., Wilson, S. E. Regeneration of Defective Epithelial Basement Membrane and Restoration of Corneal Transparency After Photorefractive Keratectomy. Journal of Refractive Surgery. 33 (5), 337-346 (2017).
  39. Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Experimental Eye Research. 161, 101-105 (2017).
  40. Janin-Manificat, H., et al. Development of ex vivo organ culture models to mimic human corneal scarring. Molecular Vision. 18, 2896-2908 (2012).
  41. Mohan, R. R., et al. Apoptosis, necrosis, proliferation, and myofibroblast generation in the stroma following LASIK and PRK. Experimental Eye Research. 76 (1), 71-87 (2003).
  42. Anumanthan, G., et al. KCa3.1 ion channel: A novel therapeutic target for corneal fibrosis. PLoS One. 13 (3), e0192145(2018).
  43. Chandler, H. L., Colitz, C. M., Lu, P., Saville, W. J., Kusewitt, D. F. The role of the slug transcription factor in cell migration during corneal re-epithelialization in the dog. Experimental Eye Research. 84 (3), 400-411 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T psay 144korneaScarringfibrozisMyofibroblastEx vivoOrgan k lt r

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır