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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Un protocole pour un ancien modèle de culture de cornée orgue vivo utile pour la cicatrisation des études est exposée. Ce système de modèle peut servir à évaluer les effets des agents pour favoriser la guérison régénératrice ou toxicité des médicaments dans un environnement 3D organisé de multicellulaire.

Résumé

La cornée a été utilisée intensivement comme système modèle pour étudier la cicatrisation des plaies. La capacité de générer et d’utiliser des cellules primaires de mammifères en deux dimensions (2D) et en trois dimensions (3D) culture a généré une mine de renseignements non seulement sur la biologie de la cornée, mais aussi sur la plaie, guérison, myofibroblastes biologie et la cicatrisation en général . L’objectif du protocole est un système de dosage pour quantifier les myofibroblastes développement, qui caractérise la cicatrisation. Nous démontrons un cornée orgue ex vivo modèle de culture à l’aide des yeux de cochon. Dans cette kératectomie antérieure enroulé, cornées encore dans le monde sont blessées avec une lame circulaire appelée un trépan. Un bouchon d’environ 1/3 de la cornée antérieure est supprimé y compris l’épithélium, la membrane basale et la partie antérieure du stroma. Après la blessure, cornées sont coupées du monde, montées sur un socle de collagène/agar et cultivées pendant deux semaines en milieu sans sérum complétée de vitamine c stabilisée pour augmenter la prolifération cellulaire et la sécrétion de la matrice extracellulaire par les fibroblastes résidents. Activation des myofibroblastes dans le stroma antérieur est évidente dans la cornée cicatrisée. Ce modèle peut être utilisé pour doser la fermeture de la plaie, le développement des myofibroblastes et marqueurs fibreuses et pour les études de toxicologie. En outre, les effets des inhibiteurs de petites molécules comme la transfection de siARN médiée par les lipides pour de gène peuvent être testées dans ce système.

Introduction

Cicatrisation de la cornée résultant de la blessure, un traumatisme ou une infection peut conduire à débiliter des opacités cornéennes et une cécité permanente. Ainsi, il y a un besoin essentiel d’identifier les voies qui peuvent être ciblés pour une intervention thérapeutique. Les options thérapeutiques actuelles sont limitées et consistent principalement en des greffes de cornée, qui ne sont pas accessibles aux patients à travers le monde. Tant humaines (Figure 1) et cornées animales peuvent être utilisées pour la 2D et la culture cellulaire 3D études1,2. Cornées de cadavre humain ne convient pas pour la transplantation peuvent être obtenues auprès de banques de le œil ou banques de tissus centralisé (National Disease Research Interchange (NDRI)), et animaux yeux peut provenir d’un abattoir. Cellules épithéliales cornéennes primaires et plus récemment, les cellules endothéliales, fibroblastes stromales peuvent être isolées et cultivées de ces tissus pour la cicatrisation des plaies et des études de toxicologie3,4,5. En plus de l’importance de comprendre les bases moléculaires de l’aveuglement des maladies oculaires, l’accessibilité des tissus et la capacité de cellules primaires de la culture a fait de la cornée un important système modèle pour l’étude. La cornée est idéale pour tester les effets des agents sur la cicatrisation de la cornée normale est transparente et de certains types de blessures créent opacités ou cicatrices fibreuses (évaluées à6). Aussi, plusieurs en vivo plaie cornéenne, modèles guérison ont été largement utilisés pour cicatrices études1. Moins utilisé a été l’ex vivo cornée plaie guérison modèle7,8 qui est décrit en détail ici. Cette méthode vise à quantifier les résultats cicatrisation caractérisées par les responsables fibreuses dans une 3D multicellulaires cornée ex vivo système de modèle.

Blessant épithéliale cornéenne qui ne viole pas la membrane basale épithéliale normalement ferme dans les 24 à 72 h9. Bientôt après la blessure, les cellules au bord de l’épithélium commencent à répandre et migrer vers la surface épithéliale et libre, pour rétablir la fonction barrière épithéliale. Cette activité est suivie dans l’ordre d’activation de la prolifération de la cornée Baso-cellulaire tout d’abord et, à un stade ultérieur, de cellules précurseurs situé dans la zone limbique extérieure pour obtenir la récupération de cellules épithéliales masse10,11. Ces blessures guérissent souvent sans laisser de cicatrices. Cependant, une blessure qui pénètre la membrane de sous-sol dans le stroma souvent traduit par cicatrice formation1. Après la blessure de stroma cornéen, le stroma est rempli avec des cellules de plusieurs origines, y compris les cellules stromales résidents différenciés ainsi que dérivés de la moelle osseuse des fibrocytes12,13,14. Cicatrices fibreuses se caractérise par la persistance des myofibroblastes dans une plaie de guérison. Ces myofibroblastes pathologiques démontrent une adhérence accrue grâce à l’accumulation des intégrines en focales, fibres de stress contractile musculaire lisse α actine (α-SMA) et activation locale de la matrice extracellulaire (ECM)-séquestré latente-transformant le facteur de croissance-bêta (TGFβ). La différenciation des cellules épithéliales dérivées, sous le titre épithéliales transition mésenchymateuse (EMT), peut-être aussi contribuer à6de la formation de cicatrices.

Il y a un équilibre délicat entre la différenciation cellulaire et l’apoptose après la blessure. En raison de la violation dans les membranes basales, les facteurs de croissance comme facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) et de TGFβ de larmes et de l’épithélium baignent le stroma, induisant la différenciation des myofibroblastes, une boucle autocrine soutenue d’activation de TGFβ, ainsi que la sécrétion de désorganisé fibrotique ECM15,16. La persistance des myofibroblastes dans la blessure guérie favorise la brume et la cicatrisation de la cornée (Figure 2). Cependant, en régénération guéri plaie bien que développent des myofibroblastes, ils apoptose et donc sont absents ou significativement réduite en nombre dans les tissus cicatrisés (revu en référence6,10). Ainsi, les recherches sur les cicatrices fibreuses portent au moins en partie sur le ciblage des molécules qui empêchent le développement excessif de myofibroblastes ou myofibroblastes persistance17,18. Parce que la persistance de myofibroblastes caractérise les cicatrices et fibrose maladie dans tous les tissus19, la cornée peut être utile comme système modèle pour étudier les mécanismes cellulaires généraux de la fibrose.

Dans notre système de modèle, la cornée est blessée avec une lame cylindrique appelée un trépan tout en restant dans le monde entier. Humaine et cornées de porc peuvent être blessées avec soit un trépan mm 6 ou 7 ; pour les cornées de lapin un trépan de 6 mm est préférable. La cornée de cochon est similaire en taille à la cornée humaine. Parce qu’ils sont rentables et facilement disponibles en grand nombre, des cornées de porc sont couramment utilisées pour la culture de l’orgue. En outre, les anticorps et siRNAs fait réagir avec l’homme ont constamment réagissent avec porc7. Après la blessure, cornées sont découpées dans le monde entier avec le limbe intactes et monté sur une base de gélose/collagène. Les cornées sont cultivées dans un milieu sans sérum plusent stabilisé de vitamine C pour simuler la prolifération des fibroblastes et ECM dépôts20. L’ajout de sérum ni facteurs de croissance sont nécessaires pour induire la formation de myofibroblastes7. Cornées sont systématiquement fixes et transformées pour histologie après deux semaines de culture. Pour de gène, ou pour tester les effets d’un agent sur la cicatrisation des plaies, la plaie peut être traitée avec des siARN dans la plaie après la blessure de7 ou un agent soluble peut être ajouté aux médias, respectivement8.

Protocole

1. organe Culture

  1. Préparations
    1. Préparer la solution d’agar comme suit. Dans un petit ballon, préparer 1 % d’agar et de collagène d’origine bovine en DMEM-F12 1 mg/mL à 20 mL. Porter à ébullition sur une plaque chauffante. Mettre la solution dans un tube conique de 50 mL. Placer le tube dans un bain d’eau sur une plaque chauffante pour empêcher la solution de solidification.
    2. Préparer supplémenté médias sans sérum (SSFM) selon la composition fournie dans la Table des matières.
      Remarque : La quantité nécessaire du SSFM à préparer dépend du nombre de cornées à traiter. 30 mL est habituellement assez pour 4 cornées.
  2. Dissection
    Remarque : Effectuez cette étape dans une hotte de dissection ou une hotte chimique. Les yeux sont livrés avec couvercles encore attachées en sachets individuels pour protéger les globes.
    1. Retirez les globes de couvercles avec une lame chirurgicale de droites sur une planche à découper nettoyé à l’éthanol. Retirer les excès de tissu graisseux de le œil à l’aide d’une lame ou une petite paire de ciseaux (Figure 3 a, 3 b).
    2. Après avoir retiré le globe du couvercle, tenir le monde entier vers l’arrière avec une pince et plonger immédiatement le œil dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Tremper rapidement elle x 3 à 10 % d’iode (dans un bécher de 100 mL). Tremper rapidement 2 x dans du PBS (~ 100 mL dans un bécher, PBS de changer fréquemment).
    3. À l’aide d’une serviette propre ou un mouchoir, envelopper l’oeil sur sa circonférence avec suffisamment de pression pour avoir une surface cornéenne tendue à couper avec le trépan.
      Remarque : prendre soin de prévenir la serviette ou un mouchoir en contact avec la cornée.
  3. Blessant
    1. Utilisez un trépan de 6 mm à blesser le centre de la cornée. Pénètrent dans l’épithélium et le stroma antérieur sans faire une plaie pleine épaisseur à travers la cornée entière.
      Remarque : Si l’endothélium est pénétrée, on constatera une perte de pression et le liquide qui fuirait. Dans ce cas, le œil doit être jetée.
    2. Placez le trépan dans le centre de la cornée, tourner 180° dans le sens horaire et anti-horaire 5 x (chaque fois que la direction est modifiée il comptera comme une fois) tout en appliquant une légère pression pour approfondir la plaie.
      Remarque : La plaie doit être maintenant assez profonde pour permettre un lambeau tissulaire à soulever à l’aide d’une paire de pinces. Si ce n’est pas le cas Répétez l’étape 1.3.2.
    3. Soulevez le rabat sur les bords. Dans le même temps, soit avec l’autre main une seconde personne, utilisez une lame, coupe parallèle au monde entier à découper le tissu comme la pince continue de soulever la cornée antérieure dans la marge de la plaie. À l’issue de cette étape, il devrait y avoir une plaie circulaire située au centre de la cornée (voir la Figure 3C, 3D).
  4. Couper et retirer le Globe de la cornée
    1. Maintenant le œil avec le tissu, faire une petite incision de 1 mm du bord de la cornée avec une lame afin que le limbe est inclus dans la culture de l’orgue.
    2. Ciseaux pointus à l’aide de petits, accéder à l’incision créée à l’étape préalable à la Coupe du monde, gardant une marge de millimètre tout au long de la cornée afin de préserver le limbe.
    3. Placez la cornée dans un plat de 60 mm avec 1 mL de PBS, à côté de la plaie vers le bas jusqu’au montage.
  5. Montage
    1. Veillez à ce que l’agar est venu à une température chaude (environ 25 ° C).
    2. Avec deux paires de pinces, créer une tasse en levant les deux côtés de la cornée et la face endothéliale. Ajouter la solution d’agar réchauffé dans la cornée à l’aide d’une pipette stérile jusqu'à ce qu’il est plein.
    3. Après l’agar durcit (habituellement environ 30 à 45 s) Retournez soigneusement la cornée avec la gélose dans la plaque (Figure 3E) de 60 mm. Couvrir avec un couvercle.
  6. Incubation
    1. Ajouter 4 mL de SSFM à la plaque de maintien des cornées à l’interface air-liquide à la frontière limbique dans 5 % CO2 à 37 ° C. Actualiser les médias après 24 h et par la suite tous les deux jours.
      Remarque : Si vous effectuez une transfection dans la plaie, omettre les antibiotiques jusqu'à ce qu’après la transfection.
    2. Mouiller la surface cornéenne, une fois par jour en ajoutant 1 goutte du SSFM depuis les milieux conditionnés dans le plat pour maintenir l’humidité. Pour ce faire, prendre le plat hors de l’incubateur, placez-le sous le capot, enlever le couvercle plat, mouiller la surface avec les médias de plat à l’aide d’une pipette stérile, couvrir à nouveau et remettre en place à l’incubateur.
    3. Pour l’inactivation du gène, traiter la plaie avec ciblage de gène ou contrôler les siARN qui est complexée à un transporteur lipide-négociée selon les instructions du fournisseur (voir ci-dessous).
    4. Mix 5 µL (50 pmol) de siARN dans 50 µL de sérum réduit minimal médias essentiels (p. ex.., Opti-MEM). Mélanger 2 µL de réactif de transfection dans 50 µL de sérum réduit-médias. Laisser ce reposer pendant 5 min et puis mélangez-les.
    5. Ajouter 200 µL de sérum réduit minimal médias au mélange réactif/siARN.
    6. Pipette goutte à goutte sur la plaie et incuber pendant 3 h.
    7. Lavent siRNA de surface de la cornée avec les médias dans le plat. Changer le milieu d’incubation au SSFM + antibiotiques (voir la Table des matières). Continuer d’incubation comme mentionné précédemment (pas 1.6.1-1.6.2).

2. histologie : Sections de paraffine et Immunostaining

  1. Préparer le tissu
    1. Après une incubation de deux semaines, si vous utilisez certains des tissus pour quantitative polymérase PCR (qRT-PCR) analyse en temps réel, avant de fixer, coupée de la cornée en deux par le biais de la plaie. Placez cette moitié ou seulement ¼ (soit est assez tissu) en stabilisant réactif RNA-protect.
    2. À l’aide d’un kit d’isolation standard, isoler l’ARN et exécuter qRT-PCR.
      Remarque : Sinon, la partie blessée seulement peut être isolée et testée pour l’expression des gènes.
    3. Placer l’autre moitié de la cornée en cassettes de pathologie des tissus et immergez-la dans le fixateur (formol à 10 %) pour 2 à 4 jours à température ambiante (RT).
    4. Paraffine cela incorporez la moitié de la cornée blessée selon les techniques habituelles.
      Remarque : Orienter la cornée blessée pour s’assurer que le sectionnement des tissus va produire un échantillon représentatif de la cornée.
  2. Immunomarquage à l’aide de 3, 3'-diaminobenzidine (DAB)
    1. Jour 1
      1. Étiquette glisse correctement à l’aide d’un crayon. Hors paraffinize le tissu en plaçant des diapositives dans un bocal avec agent (2 changements, 10 min chacun) de compensation.
      2. Réhydrater les tissus en transférant les diapositives dans l’éthanol à la baisse des concentrations (100 %, 100 %, 70 %, 50 %, dH2O, dH20, 5 min pour chaque modification).
      3. Effectuer des recherche d’antigène par micro-ondes des diapositives dans un pot en plastique avec tampon citrate (10 mM, pH 6,4) pendant 5 min. 5 min à 50 % de puissance de premier cycle. Remplissez le bocal avec tampon citrate et répéter. Refroidir pendant 10 min.
      4. Laver 3 fois avec du PBS, 2 min de chaque. Permeabilize tissu avec 1 % X-100 Triton en PBS 10 min au bloc RT. coupes avec 3 % de sérum de chèvre normal (NGS) pendant 1 h à RT en chambre humide.
      5. Incuber le tissu avec l’anticorps primaire (au 1/100 ou comme l’indique le fournisseur) dans 3 % NGS pour la nuit à 4 ° C (300 µL par lame).
    2. Jour 2
      1. Rincer les lames 3 x avec PBST (PBS plus 1 % Tween 20), 2 min de chaque. Placer les lames dans 3 % H2O2 pendant 10 min bloquer la peroxydase endogène. Laver 3 fois avec PBST, 2 minutes chacun. Incuber les sections avec l’anticorps secondaire de HRP (1/250) dans 3 % NGS pendant 1 h à RT (300 µL par lame).
      2. Les lames 3 x PBST, 2 minutes chacun. Traiter les diapositives avec le kit DAB. Ajouter 300 µL/lame pendant 3 min. laver les lames avec dH2O 2 x (dips rapides).
      3. Contre-coloration à l’hématoxyline pour lavage s. 20 la diapositive avec dH2O 2 x (dips rapides). Tache avec agent de bleuissement pour 20 s. rinçage en dH2O pour 20 s. Dehydrate tissu en plaçant se glisse dans l’augmentation des concentrations d’éthanol (50 %, 70 %, 100 %, 100 %, tous les trempettes rapides).
      4. Sécher les diapositives sur une serviette en papier sous le capot pour 10-20 min.
      5. Monter des diapositives en utilisant 1 goutte de montage multimédia, recouvrir d’une lamelle couvre-objet. Étiqueter et stocker à température ambiante.
      6. Image des diapositives sous un microscope et quantifier le signal DAB avec ImageJ7 (voir la section 4).
  3. Immunomarquage : Fluorescence
    1. Le jour 1 suivez la procédure décrite à l’étape 2.2.1. Effectuez les opérations suivantes sur 2 jours.
    2. Rincer les lames 3 x dans le PBST pour 2 min de chaque. Incuber les sections avec l’anticorps secondaire fluorophore-tag dans 3 % NGS (1 : 200) pendant 1 h à température ambiante.
    3. Laver 3 x dans le PBST, 2 minutes chacun. Montage de diapositives à 1goutte de 4′, supports de montage 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et le couvercle avec une lamelle. Sécher sur un essuie-tout sous le capot pour 30 min. magasin dans l’obscurité à 4 ° C jusqu’en imagerie de fluorescence.
  4. Quantification à l’aide d’Image J
    1. Télécharger la version « Fidji » d’ImageJ, qui comprend les plugins nécessaires pour DAB quantification de coloration.
    2. Ouvrir une image dans les îles Fidji et sélectionnez Image → couleurs → couleur déconvolution.
    3. Sélectionnez « H DAB » comme la tache et puis cliquez sur OK. Trois nouvelles images seront affiche. Sélectionnez l’image qui contient la seule coloration de DAB.
    4. Afin de quantifier stromales coloration uniquement, utilisez la fonction de gomme de ImageJ pour éliminer l’épithélium de l’image DAB.
    5. Sélectionnez analyser → mesure (ou Ctrl + M) et relever la valeur.

Résultats

Immunohistochemistry est le test principal utilisé pour analyser le succès de l’ex vivo plaie expérience de guérison. La figure 4 illustre l’épithélium et le stroma antérieur en tissu témoin (Figure 4 a, 4 b). Six heures après la blessure, l’épithélium est absente (Figure 4, 4D). Six jours après la blessure comme prévu, l’épithélium avait augme...

Discussion

Ce protocole décrit un modèle pour étudier la cicatrisation dans un environnement 3D stratifié naturel. Utilisation de la culture de l’orgue comme intermédiaire entre la culture cellulaire et études in vivo réduit considérablement les coûts ainsi que les procédures de réduction sur les animaux vivants. Autres modèles 3D ont été d’une grande utilité sur le terrain, y compris la synthèse des gels collagène fabriqués à partir de fibroblastes cornée humaine primaire2 ou ces mê...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les NIH-NEI R01 EY024942, recherches pour prévenir la cécité, Upstate Medical University sans restriction Research Funds, et Lions District 20-y microscopie et analyse d’images de sections de paraffine ont été effectuées à la base de la microscopie et préparation histologique a été réalisée à la banque de tissus biologiques et le noyau de la pathologie à l’école de médecine de l’Icahn au mont Sinaï.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
PBSGibco10-010-023
Pen Strep MP Biomedicals91670049
Bovine Collagen SolutionAdvance Biomatrix5005
Pig eyes with lids attached Pel-freeze, ArkansasN/A
6.0 mm trephine KatenaK28014
Surgical Blade Personna0.009
Small scissorFisher895110
ForcepsFisher08953-F
Kim Wipes Kimberly-Clark™ 3412006-666
60 mm cell culture dishes Falcon08-772B
Supplemented Serum- Free media (SSFM)Add all of the following components to DMEM/F-12:  ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. 
DMEM/F-12Gibco11330
ITS Liquid Media Supplement SigmaI3146100X
RPMI 1640 Vitamins Solution SigmaR7256100X
GlutathioneSigmaG6013Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.
1% L-glutamine solution Gibco25030-081100X
MEM Non-essential amino acids solution Gibco11140100X
MEM Sodium pyruvate solution Gibco113601 M Stocks (1000X) and freeze in single use aliquits.  Use from freezer each time media is made.
ABAM SigmaA7292100X
Gentamicin Sigma30-005-CR200X
Vitamin C Wako070-04832-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)
10% Iodine Fisher ChemicalSI86-1
Tissue Path Cassettes Fisher22-272416
Normal Goat Serum (NGS)Jackson Immuno Research005-000-121We use 3% NGS
Mounting Media Thermo ScientificTA-030-FM
Safe Clear Fisher314-629
Ethyl AlcoholUltra Pure200CSGP200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) 
Sodium citrate FisherBP32710mM, pH 6.4
HematoxylinEMD MilliporeM10742500
Bluing agent Ricca Chemical Company220-106
1% Triton X-100Fisher9002-93-1Diluted in PBS
0.1% Tween 20 FisherBP337Diluted in PBS
3% Hydrogen Peroxide FisherH324
DAB Kit Vector LaboratoriesSK-4100
Agar Fisher BP1423-500Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL
ParafilmBermis13-374-12
Moist ChamberUse any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.
Lipofectamine 2000
Qiagen RNAprotect Cell ReagentQiagen 76104
Ambion PureLink RNA Mini KitThermo Scientific12183018A
Anti-Fibronectin-EDA AntibodySigmaF61401:200 Diluted in  3% normal goat serum
Anti-alpha smooth muscle actin AntibodySigmaA2547 or C6198 (cy3 conjugated)1:200 Diluted in 3% normal goat serum
Permafluor Thermo ScientificTA-030-FM
DAPI InvitrogenP36931
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP Invitrogen62-65201:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)
Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP Thermo ScientificPA1-859991:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3 Jackson Immuno Research115-165-1461:200 Diluted in  3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)
 Zeiss Axioplan2 ZeissMicroscope
SPOT-2Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MichiganCCD camera

Références

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