Ex Vivo 막 기관 문화 모델에 대 한 상처 치유 연구

요약

전직에 대 한 프로토콜 vivo 막 기관 문화 모델 부상 치료 연구는 설명 하는 유용한. 이 모델 시스템 재생 치유를 촉진 하는 에이전트 또는 조직된 3D 다세포 환경에서 약물 독성의 효과 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.

초록

각 막은 상처 치유를 공부 하는 모델 시스템으로 광범위 하 게 사용 되었습니다. 능력을 생성 하 고 2 차원 (2D)과 3 차원 (3D) 문화에 기본 포유류 세포를 활용 풍부한 정보 뿐만 아니라 각 막 생물학에 대 한 뿐만 아니라 상처 치유, myofibroblast 생물학, 그리고 일반적으로 흉터에 대 한 발생 . 프로토콜의 목적은 myofibroblast 개발, 흉터 특징을 측정 하는 분석 결과 시스템입니다. 우리는 돼지 눈을 사용 하는 각 막 기관 문화 비보 전 모델을 보여 줍니다. 이 앞쪽 keratectomy 상처, 세계에서 아직도 각 원형 블레이드는 판형 이라는 부상는. 앞쪽 각 막의 약 1/3의 플러그는 상피, 지하실 멤브레인와 스트로 마의 앞쪽 부분을 포함 하 여 제거 됩니다. 부상, 후 각 지구에서 잘라, 콜라겐/한 천 자료에 있으며 주민 섬유 아 세포에 의해 세포 증식과 세포 외 기질 분 비를 증가 시키기 위해 안정화 된 비타민 c 보충 세럼 무료 매체에 2 주 동안 경작. 앞쪽 기질에 myofibroblasts의 활성화 치료 각 막에 분명 하다. 이 모델은 상처 폐쇄, myofibroblasts과 거리, 그리고 독성 연구 개발 시험을 사용할 수 있습니다. 또한,이 시스템에서 유전자 최저에 대 한 지질 중재 siRNA transfection 작은 분자 억제제의 효과 테스트할 수 있습니다.

서문

상해, 외상, 또는 감염에서 발생 하는 각 막에 흉터 불투명도 및 영구적인 시력 상실을 쇠 약하게 될 수 있습니다. 따라서, 치료 적 개입에 대 한 대상으로 지정할 수 경로 식별 하는 중요 한 필요가 있다. 현재 치료 옵션 제한 되며 전 세계에 걸쳐 환자에 액세스할 수 있습니다 각 막 이식, 주로 이루어져 있다. 둘 다 (그림 1) 인간과 동물 각 차원에 대 한 이용 될 수 있다 고 3D 세포 배양 연구^1,2. 인간 시체 각 막 이식에 적합 하지 않은 안구 은행 또는 중앙된 조직 은행 (국가 질병 연구 교환 (NDRI))에서 얻어질 수 있다 그리고 동물 눈은 도살 장에서 얻어질 수 있다. 기본 각 막 상피 세포, stromal 섬유 아 세포, 그리고 더 최근에, 내 피 세포, 절연 수 및 상처 치유에 대 한 이러한 조직에서 경작 그리고 독물학 연구^3,,45. 눈부신 눈 질병의 분자 기준 이해의 중요성 뿐만 아니라 조직과 문화 1 차 셀 수의 접근이 했다 각 막 연구에 대 한 중요 한 모델 시스템을. 각 막 흉터 정상적인 각 막 투명 하 고 상처의 특정 유형을 만드는 불투명도 또는 fibrotic 흉터 (^6에서검토)에 에이전트의 효과 테스트에 이상적입니다. 몇 가지 vivo에서 각 막 상처 치유 모델은 또한 광범위 하 게 이용 되어 상처 연구¹. 덜 활용 되었습니다 전 비보 각 막 상처 치유 모델^7,8 여기에서 설명 하는. 이 방법의 목표는 흉터 결과 3d 다세포 거리 제조 업체에 의해 특징을 계량 하는 ex vivo 모델 시스템 각 막.

24-72 h⁹내 닫습니다 각 막 상피 부상 하 일반적으로 상피의 지하실 멤브레인을 위반 하지 않습니다. 부상, 곧 후 상피의 가장자리에 세포 확산 하 고 상피 무료 표면 상피 장벽 기능을 다시 설정으로 이동 시작 합니다. 이 활동은 순차적으로 먼저 하 고, 상피 세포 대량^10,11의 복구를 달성 하기 위해 외부 limbal 지역에 있는 선구자 세포의 나중 단계에서 각 막 기저 세포 증식의 활성화를 옵니다. 이러한 상처는 종종 흉터 없이 치료. 그러나, 종종 지하실 막 기질에 침투 상처 흉터 형성¹발생 합니다. 각 막 실질 부상 후 기질 차별화 된 주민 stromal 세포 골 수에서 파생 된 fibrocytes^12,,1314포함 한 여러 기원 세포로 채워집니다. Fibrotic 흉터 치료 상처에 myofibroblasts의 지 속성에 의해 특징입니다. 이러한 병 적인 myofibroblasts 보여 초점 유착, 수축 성 α-부드러운 근육 걸 (α-SMA) 스트레스 섬유와 세포 외 기질 (ECM)의 현지 활성화 integrins의 축적을 통해 증가 접착-압수 잠재성 변형 성장 인자-베타 (TGFβ). 엽 전환 (응급), 상피로 알려진 파생 된 상피 세포의 분화 형성⁶흉터에 기여할 수 있습니다.

부상 후 세포 분화 및 apoptosis 사이의 미묘한 균형이 있다. 혈소판 파생 된 성장 인자 (PDGF)과 눈물에서 TGFβ 상피 목욕 기질, 유도 myofibroblast 차별화, TGFβ 활성화의 지속적인된 autocrine 루프와 같은 성장 요인 지하실 멤브레인에 위반 때문에 그리고 비 조직적인된 거리 ECM^15,16분 치료 상처에 myofibroblasts의 지 속성 안개 및 (그림 2) 각 막에 흉터를 촉진 합니다. 그러나, regeneratively 치유 상처 myofibroblasts 개발, 비록 그들은 apoptose 및 따라서 결 석 또는 치유 조직 (참조^6,10검토)에서 크게 감소 된 수. 따라서, fibrotic 흉터에 대 한 연구를 적어도 부분 과도 한 myofibroblast 개발 또는 myofibroblast 지 속성^17,18을 방지 하는 분자를 대상으로에 집중 했다. Myofibroblast 지 속성 특징 모든 조직¹⁹에 흉터와 거리 질병, 때문에 각 막 섬유 증의 일반적인 셀룰러 메커니즘 연구를 모델 시스템으로 유용할 수 있습니다.

우리의 모델 시스템에서 각 막 원통형 블레이드 라는 세계에 판형으로 부상입니다. 인간 돼지 각 중 하나는 6 또는 7 m m 판형;와 부상 수 있습니다 토끼 각 막에 대 한 6 m m 판형이 좋습니다. 돼지 막은 인간 각 막 크기에서 유사 합니다. 때문에 비용 효과적이 고 쉽게 사용할 수 있는 많은 수에서 돼지 각 기관 문화 정기적으로 사용 됩니다. 또한, 항 체 및 인간 반응 했다 siRNAs 돼지⁷cross-reacted 일관 되 게 있다. 부상, 후 각 막을 절단 하는 limbus로 전 세계에서 그대로 한 천/콜라겐 베이스에 탑재. 각 혈 청 무료 미디어에서 교양 플러스 섬유 아 세포 증식과 ECM 증 착²⁰를 시뮬레이션 하기 위해 비타민 C를 안정화. 혈 청의 추가 없으며 성장 요인 유도 myofibroblast 형성⁷필요 합니다. 각 막은 정기적으로 고정 하 고 문화의 2 주 후 조직학에 대 한 처리. 유전자 최저, 또는 상처 치유에 에이전트의 결과 테스트, 상처는⁷ 명이 후 상처에 siRNA로 대우 될 수 있다 또는 수용 성 에이전트 각각⁸미디어에 추가할 수 있습니다.

프로토콜

1. 기관 문화

1. 준비
   1. 다음과 같이 한 솔루션을 준비 합니다. 작은 술병에 준비 1% 한 천은 1 mg/mL 소 콜라겐 DMEM F12에 최대 20 mL. 뜨거운 접시에 끓여 야 가져와. 솔루션 50 mL 원뿔 튜브에 넣어. 응고에서 솔루션을 유지 하는 뜨거운 접시에 물 욕조에 튜브를 배치 합니다.
   2. 보충 세럼-무료 미디어 (SSFM) 재료의 테이블에에서 제공 된 구성에 따라 준비 합니다.
      참고: 필요한 양의 대비해 SSFM 처리할 각 막의 수에 따라 달라 집니다. 보통 30 mL 4 각에 대 한 충분 한 매체 이다.
2. 해 부
   참고: 절 개 후드 또는 화학 후드에이 단계를 수행 합니다. 눈은 여전히 지구를 보호 하기 위해 개별 가방에 부착 된 뚜껑 함께 제공 됩니다.
   1. 에탄올 청소도 마 보드에 스트레이트에 지 외과 블레이드와 뚜껑에서 글로브를 제거 합니다. 칼 또는 작은 위 (그림 3A, 3B)를 사용 하 여 눈에서 과잉 지방 조직을 제거 합니다.
   2. 뚜껑에서 세계를 제거한 후 세계 뒤로 집게로 누른 즉시 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 눈을 찍어. 신속 하 게 그것을 찍어 (100 mL 비 커)에서 10% 요오드에 3 배. 빨리 찍어 PBS (~ 100 mL 비 커, 자주 변경 PBS에서에서) 2 배.
   3. 깨끗 한 수건 이나 티슈 using, 원주는 판형으로 잘라 긴장 된 각 막 표면에 충분 한 압력으로 눈 랩.
      참고: 각 막 접촉에서 수건 이나 티슈를 방지 하기 위해 주의.
3. 부상
   1. 6mm 판형을 사용 하 여 각 막의 중심을 상처. 전체 각 막 통해 전체 두께 상처를 만들지 않고 상피와 앞쪽 기질에 침투.
      참고: 있는 피를 관통 하는 경우 새 액체 및 압력의 손실을 볼 수 있습니다. 이 경우에 눈을 폐기 해야한다.
   2. 각 막의 중심에는 판형, 180 ° 시계 방향 및 시계 반대 방향으로 5 회전 x (방향 변경 때마다 그것은 것으로 계산 한 번) 상처를 깊게 하기 위해 가벼운 압력을 적용 하는 동안.
      참고: 상처 이제 깊은 만큼 조직 플랩 집게의 쌍을 사용 하 여 해제를 허용 해야 합니다. 이 경우 반복 하지 않으면 1.3.2 단계.
   3. 플랩 가장자리에서 들어올립니다. 동시에 다른 한편 또는 두 번째 사람 앞쪽 각 막 상처 여백 내에서 해제 하는 집게 계속 조직 버려야 하 세계에 평행 절단 블레이드를 사용 합니다. 이 단계의 결론에 원형 상처 (참조 그림 3 C, 3D) 각 막의 가운데에 위치 해야 합니다.
4. 절단 및 전 세계에서 각 막 제거
   1. 조직으로 눈을 들고 있도록 각 막의 작은 절 개는 가장자리에서 1 m m 블레이드는 limbus 장기 문화에 포함 되어.
   2. 작은 사용 하 여, 날카로운가 위 절 개는 limbus를 그대로 유지 하는 각 막에 걸쳐 밀리미터 여백은 전세계 잘라 이전 단계에서 만든 액세스 합니다.
   3. 장착까지 PBS, 상처 면의 1 mL와 60 mm 접시에 막 내려 놓습니다.
5. 장착
   1. 따뜻한 온도 (약 25 ° C)에 한 천 온 다는 것을 확인 하십시오.
   2. 집게의 두 쌍, 내 피 쪽으로 각 막의 두 측면을 견디고 여 한 컵을 만듭니다. 찰 때까지 무 균 전송 피 펫을 사용 하 여 각 막에 따뜻하게 위로 한 솔루션을 추가 합니다.
   3. 후에 한 천 견고 (보통 대략 30-45 s) 신중 하 게 60 m m 플레이트 (그림 3E)으로 agar와 각 막 플립. 뚜껑으로 커버.
6. 부 화
   1. 37 ° c.에 5% CO₂ limbal 국경에 공기 액체 인터페이스에서 각을 유지 하는 접시 SSFM의 4 개 mL를 추가 그 후 매일 24 시간 후 미디어를 새로 고침 합니다.
      참고: 상처로 transfection를 수행 하는 경우 transfection 후 때까지 항생제를 생략 합니다.
   2. 수 분을 유지 하기 위해 접시에 바른된 미디어에서 SSFM 1 방울을 추가 하 여 일단 매일 각 막 표면에 젖은. 이 위해, 인큐베이터에서 접시를가지고, 후드 아래 장소, 접시 뚜껑을 제거, 젖은 접시 살 균 피 펫을 사용 하 여에서 미디어와 표면, 다시 커버를 다시 인큐베이터에서.
   3. 유전자 최저, 유전자를 대상으로 상처를 치료 또는 공급 업체의 지침 (아래 참조)에 의하여 지질 중재 캐리어에 complexed은 siRNA를 제어.
   4. 믹스 5 µ L (50 pmol) 감소-혈 청 최소 필수 미디어의 50 µ L에 siRNA의 (예., Opti 메모리). 감소 된 혈 청 미디어의 50 µ L로 transfection 시 약의 혼합 2 µ L. 5 분이 앉아 보자 하 고 그들을 섞는다.
   5. 시 약/siRNA 혼합물에 감소-혈 청 최소 미디어의 200 µ L를 추가 합니다.
   6. 상처에 dropwise 플라스틱 및 3 h에 품 어.
   7. SiRNA는 접시에 미디어와 함께 각 막 표면에서 세척 한다. SSFM + 항생제 ( 재료의 표참조)를 부 화 미디어를 변경 합니다. 계속 언급 했 듯이 이전 인큐베이션 (단계 1.6.1-1.6.2).

2. 조직학: 파라핀 섹션 및 Immunostaining

1. 조직 준비
   1. 후에 2 주 보육 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR) 분석, 담합, 전에 잘라 각 막 상처를 통해 반에 대 한 조직의 일부를 사용 하는 경우 이 반 또는 유일한 ¼ (중 하나는 충분 한 조직) 안정화 RNA 보호 시 약으로.
   2. 표준 절연 키트를 사용 하 여 RNA를 분리 하 고 qRT-PCR을 수행.
      참고: 또는 상처 부분만 수 수 분리 하 고 유전자 발현에 대 한 테스트.
   3. 다른 각 막의 조직 병리학 카세트에 놓고 실 온 (RT)에서 2-4 일에 대 한 정착 액 (10% 포 르 말린)에 잠수함.
   4. 파라핀이 표준 기술을 사용 하 여 부상된 각 막의 반 포함.
      참고: 조직 단면 각 막의 단면을 생산할 예정 이다 있도록 부상된 각 막을 방향을 정하십시오.
2. Immunostaining 3, diaminobenzidine (DAB)-3'를 사용 하 여
   1. 주 1
      1. 레이블 적절 연필을 사용 하 여 슬라이드. 드 비운 에이전트 (2 변경, 각 10 분)와 함께 항아리에 슬라이드를 삽입 하 여 조직 paraffinize.
      2. 감소 하는 농도 (100%, 100%, 70%, 50%, dH₂O, dH₂0, 각 변경에 대 일 분)에서 에탄올으로 슬라이드를 전송 하 여 조직의 rehydrate.
      3. 시트르산 버퍼 (10 m m, pH 6.4) 5 분에 대 한 플라스틱 항아리에 슬라이드 microwaving antigen 검색을 수행 합니다. 처음에 50% 전력에서 5 분 주기. 구 연산 염 버퍼와 항아리를 리필 하 고 반복 합니다. 10 분 동안 식혀.
      4. PBS, 3 x 2 분을 씻어. 1% 트라이 톤 X-100 실시간 블록에서 PBS 10 분에 3% 정상 염소 혈 청 (NGS) 습 한 챔버에 RT에 1 h와 섹션 조직 permeabilize
      5. 1 차적인 항 체와 조직을 품 어 (1: 100 또는 공급자에서 알 수 있듯이) 3%에서 NGS 4 ° C (슬라이드 당 300 µ L)에서 하룻밤.
   2. 주 2
      1. 린스 슬라이드 3 x PBST (PBS 플러스 1% 트윈 20), 2 분. 내 인 성 과산화 효소를 차단 하는 10 분 동안 3% H₂O₂ 에 슬라이드를 배치 합니다. PBST, 3 x 2 분을 씻어. 섹션 3%에서 HRP 이차 항 체 (1: 250)을 품 어 RT에서 1 h NGS (슬라이드 당 300 µ L).
      2. 씻어 슬라이드 3 x PBST, 2 분. DAB 키트와 함께 슬라이드를 취급 합니다. 추가 300 µ L/슬라이드 3 분 세척에 대 한 dH₂O 2 (빠른 딥) x 슬라이드.
      3. DH₂O 2 (빠른 딥) x 슬라이드 20 미 세척을 위한 Hematoxylin와 counterstain. DH₂O를 배치 하 여 20 s. Dehydrate 조직에에서 20 미 린스 청소법 에이전트와 얼룩 (50%, 70%, 100%, 100%, 모든 빠른 딥) 에탄올의 농도 증가에 슬라이드.
      4. 슬라이드 10-20 분에 대 한 후드 종이 타월에 건조.
      5. 미디어, coverslip 커버 장착 1 방울을 사용 하 여 슬라이드를 탑재 합니다. 레이블 및 실시간 저장
      6. 현미경 슬라이드를 이미지 하 고 계량 한 덩어리 신호 ImageJ⁷ (섹션 4 참조).
3. Immunostaining: 형광
   1. 주 1 단계 2.2.1에서에서 설명한 단계를 수행 합니다. 주2 다음 단계를 수행 합니다.
   2. 린스는 2 분 동안 PBST에서 3 x 슬라이드. 3%에서 이차 항 체 fluorophore 태그 섹션을 품 어 NGS (1: 200) 실시간에서 1 h
   3. 2 분 PBST에 3 배를 씻어. 슬라이드는 coverslip로 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 설치 미디어와 커버의 1 방울을 사용 하 여 탑재 합니다. 형광 이미징까지 4 ° C에서 어둠 속에서 30 분이 게에 대 한 후드 종이 수건에 건조.
4. 이미지 J를 사용 하 여 정량화
   1. ImageJ DAB 정량화를 얼룩이 지기에 대 한 필요한 플러그인을 포함의 "피지" 버전을 다운로드.
   2. 피지와 선택에서 이미지를 열고 이미지 → 색상 → 색상 Deconvolution.
   3. "H 소량" 얼룩으로 선택한 다음 확인을 클릭 합니다. 3 새로운 이미지 표시 됩니다. 만 한 덩어리 얼룩이 포함 된 이미지를 선택 합니다.
   4. Stromal 얼룩만 계량, DAB 이미지에서 상피를 제거 하 ImageJ 지우개 기능을 사용 합니다.
   5. 선택 → 분석 측정 (또는 Ctrl + M) 값을 기록 하 고.

결과

Immunohistochemistry 기본 분석 결과 활용은 전의 성공을 분석 하 비보 상처 치유 실험. 그림 4 에 상피 및 제어 조직 (그림 4A, 4B)에서 앞쪽 기질 보여 주며. 6 시간 후에 부상, 상피 (그림 4C, 4d)에 결 석 했다. 6 일 예상 대로 부상 후 상피 (4E 그림, 4 층) r...

토론

이 프로토콜 상처 치유는 자연 층 화 3D 환경에서 공부에 대 한 모델을 설명 합니다. 세포 배양 그리고 vivo에서 학문 사이 중간 장기 문화의 사용 비용 뿐만 아니라 살아있는 동물에 감소 절차에 크게 줄일 수 있습니다. 다른 3D 모델 되었습니다 자체 콜라겐 젤 기본 인간 각 막 섬유 아 세포² 또는이 같은 세포에서 만들어진 합성을 포함 하는 필드에 큰 혜택의 임베디드 젤 동물 파?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Gibco	10-010-023
Pen Strep	MP Biomedicals	91670049
Bovine Collagen Solution	Advance Biomatrix	5005
Pig eyes with lids attached	Pel-freeze, Arkansas	N/A
6.0 mm trephine	Katena	K28014
Surgical Blade	Personna	0.009
Small scissor	Fisher	895110
Forceps	Fisher	08953-F
Kim Wipes	Kimberly-Clark™ 34120	06-666
60 mm cell culture dishes	Falcon	08-772B
Supplemented Serum- Free media (SSFM)			Add all of the following components to DMEM/F-12:  ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C.
DMEM/F-12	Gibco	11330
ITS Liquid Media Supplement	Sigma	I3146	100X
RPMI 1640 Vitamins Solution	Sigma	R7256	100X
Glutathione	Sigma	G6013	Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.
1% L-glutamine solution	Gibco	25030-081	100X
MEM Non-essential amino acids solution	Gibco	11140	100X
MEM Sodium pyruvate solution	Gibco	11360	1 M Stocks (1000X) and freeze in single use aliquits.  Use from freezer each time media is made.
ABAM	Sigma	A7292	100X
Gentamicin	Sigma	30-005-CR	200X
Vitamin C	Wako	070-0483	2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)
10% Iodine	Fisher Chemical	SI86-1
Tissue Path Cassettes	Fisher	22-272416
Normal Goat Serum (NGS)	Jackson Immuno Research	005-000-121	We use 3% NGS
Mounting Media	Thermo Scientific	TA-030-FM
Safe Clear	Fisher	314-629
Ethyl Alcohol	Ultra Pure	200CSGP	200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%)
Sodium citrate	Fisher	BP327	10mM, pH 6.4
Hematoxylin	EMD Millipore	M10742500
Bluing agent	Ricca Chemical Company	220-106
1% Triton X-100	Fisher	9002-93-1	Diluted in PBS
0.1% Tween 20	Fisher	BP337	Diluted in PBS
3% Hydrogen Peroxide	Fisher	H324
DAB Kit	Vector Laboratories	SK-4100
Agar	Fisher	BP1423-500	Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL
Parafilm	Bermis	13-374-12
Moist Chamber			Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.
Lipofectamine 2000
Qiagen RNAprotect Cell Reagent	Qiagen	76104
Ambion PureLink RNA Mini Kit	Thermo Scientific	12183018A
Anti-Fibronectin-EDA Antibody	Sigma	F6140	1:200 Diluted in  3% normal goat serum
Anti-alpha smooth muscle actin Antibody	Sigma	A2547 or C6198 (cy3 conjugated)	1:200 Diluted in 3% normal goat serum
Permafluor	Thermo Scientific	TA-030-FM
DAPI	Invitrogen	P36931
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Invitrogen	62-6520	1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)
Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP	Thermo Scientific	PA1-85999	1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3	Jackson Immuno Research	115-165-146	1:200 Diluted in  3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)
Zeiss Axioplan2	Zeiss		Microscope
SPOT-2	Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan		CCD camera