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Resumo

Um protocolo para uma ex modelo de cultura da córnea órgão vivo, útil para estudos de cicatrização de feridas é descrita. Este sistema de modelo pode ser usado para avaliar os efeitos de agentes para promover a cicatrização regenerativa ou toxicidade de drogas em ambiente 3D multicelular organizada.

Resumo

A córnea tem sido amplamente utilizada como um sistema modelo para estudar a cicatrização de feridas. A capacidade de gerar e utilizar células primárias de mamíferos em duas dimensões (2D) e a três dimensões (3D) cultura gerou uma riqueza de informações não só sobre Biologia da córnea, mas também sobre a ferida cura, Miofibroblasto, biologia e cicatrizes em geral . O objetivo do protocolo é um sistema de ensaio para quantificar o desenvolvimento Miofibroblasto, que caracteriza a cicatriz. Vamos demonstrar um órgão corneal cultura ex vivo modelo usando olhos de porco. Neste anterior fotorrefrativa ferida, córneas ainda na globo estão feridas com uma lâmina circular chamada uma trefina. Um plugue de aproximadamente 1/3 da córnea anterior é removido, incluindo o epitélio, a membrana basal e a parte anterior do estroma. Após ferimento, córneas são cortadas do globe, montadas sobre uma base de colagénio/agar e cultivadas por duas semanas, complementado-soro livre médio com estabilizado vitamina C para aumentar a proliferação celular e secreção de matriz extracelular pelos fibroblastos residentes. Ativação de miofibroblastos no estroma anterior é evidente na córnea cicatrizada. Este modelo pode ser usado para o ensaio de fechamento da ferida, o desenvolvimento de miofibroblastos e marcadores fibróticas e para estudos de toxicologia. Além disso, os efeitos de inibidores de pequenas moléculas, bem como a transfeccao siRNA lipídica mediada por knockdown do gene podem ser testados neste sistema.

Introdução

Cicatrizes na córnea resultantes de infecção, trauma ou lesão podem levar a debilitante opacidades e perda de visão permanente. Assim, há uma necessidade crítica para identificar caminhos que podem ser direcionados para a intervenção terapêutica. Opções atuais do tratamento são limitadas e consistem principalmente de transplantes da córnea, que não são acessíveis aos pacientes em todo o mundo. Cultura de células 3D estudos1,2e ambos humanos (Figura 1) e córneas animais podem ser utilizadas para 2D. Córneas de cadáver humano não são adequadas para transplante podem ser obtidas em bancos de olhos ou bancos de tecidos centralizado (nacional doença pesquisa Interchange (NDRI)), e olhos de animais podem ser obtidos de um matadouro. Células epiteliais da córnea primárias, fibroblastos do estroma e, mais recentemente, as células endoteliais, podem ser isoladas e cultivadas destes tecidos para cicatrização de feridas e toxicologia estuda3,4,5. Além da importância de compreender a base molecular da cegueira doença ocular, a acessibilidade do tecido e a capacidade de cultura primária de células fez a córnea um sistema importante modelo para estudo. A córnea é ideal para testar os efeitos dos agentes em cicatrizes como a córnea normal é transparente e certos tipos de feridas criam opacidades ou cicatrizes fibróticas (revistas em6). Várias em vivo modelos cura de ferida da córnea também tem sido utilizados extensivamente para cicatrizes de estudos1. Menos utilizado tem sido o ex vivo da córnea ferida cura modelo7,,8 é descrever em detalhe aqui. O objetivo desse método é quantificar resultados cicatricial caracterizados por fabricantes fibróticos em um 3D multicelulares corneal ex sistema de modelo vivo.

Epiteliais da córnea, ferindo que não infringe a membrana basal epitelial normalmente fecha dentro de 24-72 h9. Logo após o ferimento, as células na borda do epitélio começam espalhando e migrando para a superfície epitelial livre, para restabelecer a função da barreira epitelial. Esta atividade sequencialmente é seguida pela ativação da proliferação da córnea basocelular primeiro e, numa fase posterior, de células precursoras, localizado na zona exterior estroma para alcançar a recuperação de células epiteliais em massa10,11. Estas feridas cicatrizam muitas vezes sem deixar cicatrizes. No entanto, uma ferida que penetra a membrana basal do estroma geralmente resulta em cicatriz formação1. Após ferimento do estroma da córnea, o estroma é preenchido com células de várias origens, incluindo células do estroma residentes diferenciadas, bem como derivados da medula óssea Fi12,13,14. Cicatrizes fibróticas é caracterizada pela persistência de miofibroblastos em uma cura ferida. Estes myofibroblasts patológicos demonstram maior adesão através da acumulação das integrinas em adesões focais, fibras de estresse de actina (α-SMA) músculo contrátil de α-liso e ativação local da matriz extracelular (ECM)-isolado latente-transformar o fator de crescimento-beta (TGFβ). A diferenciação das células epiteliais-derivado, conhecido como epitélio de transição mesenquimal (EMT), também pode contribuir para a formação de6da cicatriz.

Há um equilíbrio delicado entre a diferenciação celular e apoptose após ferimento. Por causa da violação na membrana do porão, crescimento fatores tais como fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e TGFβ de lágrimas e o epitélio banham o estroma, induzindo a diferenciação de Miofibroblasto, um loop de autócrina sustentado de ativação TGFβ e o secreção de desorganizada fibrótico ECM15,16. A persistência de miofibroblastos na ferida curada promove haze e cicatrizes na córnea (Figura 2). No entanto, em regeneratively curado ferida embora myofibroblasts desenvolver, eles apoptose e, portanto, estão ausentes ou significativamente reduzida em número no tecido curado (revisto em referência6,10). Assim, a pesquisa em cicatrizes fibróticas centrou pelo menos em parte no direcionamento de moléculas que impedem o desenvolvimento excessivo de Miofibroblasto ou Miofibroblasto persistência17,18. Porque a persistência de Miofibroblasto caracteriza doença cicatriz e fibrótica em todos os tecidos19, a córnea pode ser útil como um sistema modelo para estudar os mecanismos celulares gerais da fibrose.

Em nosso sistema de modelo, a córnea é ferida com uma lâmina cilíndrica chamada uma trefina enquanto ainda na globo. Humano e as córneas de porco podem ser feridas com qualquer um 6 ou 7 mm trefina; para córneas de coelho um trépano de 6mm é preferencial. A córnea de porco é semelhante em tamanho da córnea humana. Porque eles são custo-eficaz e prontamente disponível em grandes números, córneas de porco são rotineiramente utilizadas para cultura de órgãos. Além disso, os anticorpos e siRNAs feita reagir com humanos têm consistentemente cross-reacted com porco7. Após ferimento, córneas são cortadas do globo com o limbo intactas e montado sobre um base de agar/colágeno. As córneas são cultivadas em meios de comunicação isento de soro mais estabilizaram vitamina C para simular a proliferação de fibroblastos e deposição de ECM20. A adição de soro, nem fatores de crescimento são necessários para induzir a formação de Miofibroblasto7. As córneas são rotineiramente fixadas e processadas para histologia após duas semanas de cultura. Para knockdown do gene, ou para testar os efeitos de um agente na cicatrização de feridas, a ferida pode ser tratada com siRNA na ferida depois ferindo7 ou um agente solúvel pode ser adicionado para a mídia, respectivamente,8.

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Protocolo

1. o órgão cultura

  1. Preparações
    1. Prepare a solução de ágar como segue. Em um pequeno frasco, prepare-se 1% de ágar e colágeno bovino de 1 mg/mL em DMEM-F12 até 20 mL. Trazer para ferver em uma chapa quente. Colocar a solução em um tubo cónico de 50 mL. Colocar o tubo em um banho de água em uma chapa quente para manter a solução de solidificação.
    2. Prepare a mídia de soro livre completadas (SSFM) conforme a composição fornecida na Tabela de materiais.
      Nota: A quantidade necessária de SSFM estar preparado depende do número de córneas para serem processados. Geralmente 30 mL é suficiente meios para 4 córneas.
  2. Dissecação
    Nota: Execute esta etapa em uma capa de dissecação ou capuz químico. Os olhos são fornecidos com tampas ainda presa em sacos individuais para proteger os globos.
    1. Remova globos de tampas com uma lâmina de borda reta cirúrgica em uma tábua de etanol-limpo. Remova o excesso de tecido gorduroso do olho usando uma lâmina ou uma pequena tesoura (Figura 3A, 3B).
    2. Depois de retirar a tampa, o globo, segure o globo posteriormente com fórceps e mergulhe imediatamente o olho em tampão fosfato salino (PBS). Mergulhe-o rapidamente 3x em iodo 10% (em um copo de 100 mL). Mergulhe rapidamente 2x em PBS (~ 100 mL numa proveta, mudança frequentemente PBS).
    3. Usando um pano limpo ou tecido, embrulhe o olho circunferencialmente com pressão suficiente para ter uma superfície corneal esticada para cortar com a trefina.
      Nota: tenha cuidado para evitar a toalha ou tecido de entrar em contato com a córnea.
  3. Ferindo
    1. Use um trépano de 6mm para ferir o centro da córnea. Penetra o epitélio e o estroma anterior sem fazer uma ferida de espessura total através da córnea inteira.
      Nota: Se o endotélio é penetrado, uma perda de pressão e vazamento de fluido será vista. Neste caso, o olho deve ser Descartado.
    2. Colocar o trépano no centro da córnea, girá-la 180° no sentido horário e anti-horário 5 x (cada vez que a direção é alterada ele conta como uma vez), aplicando uma ligeira pressão para aprofundar a ferida.
      Nota: A ferida deve agora ser profunda o suficiente para permitir que um retalho de tecido ser levantado usando um par de pinças. Se isso não for a caso repita a etapa 1.3.2.
    3. Levante a aba das bordas. Ao mesmo tempo, com a outra mão ou com uma segunda pessoa, use uma lâmina, corte paralelo ao Globo de cortar o tecido, como a pinça continua a levantar a córnea anterior dentro da margem da ferida. Na conclusão desta etapa, deverá haver uma ferida circular localizada no centro da córnea (ver Figura 3 C, 3D).
  4. Cortando e removendo a córnea do globo
    1. Segurando o olho com o tecido, faça uma pequena incisão 1mm longe da borda da córnea com uma lâmina para que o limbo é incluído na cultura do órgão.
    2. Usando o pequeno, tesoura afiada acessar a incisão criada na etapa anterior para cortar ao redor do globo, mantendo uma margem de milímetros em toda a córnea para manter intacto o limbo.
    3. Coloque a córnea em um prato de 60 mm com 1 mL de PBS, ferida de lado para baixo até a montagem.
  5. Montagem
    1. Certifique-se que o ágar chegou-se a uma temperatura morna (cerca de 25 ° C).
    2. Com dois pares de pinças, crie uma taça, segurando os dois lados da córnea com o lado endotelial. Adicione a solução de ágar aqueceu em córnea usando uma pipeta de transferência estéril até que esteja completo.
    3. Depois que o ágar endurece (geralmente aproximadamente 30-45 s) flip cuidadosamente a córnea com o ágar-ágar em placa de 60 mm (Figura 3E). Cubra com uma tampa.
  6. Incubação
    1. Adicionar 4 mL de SSFM à placa, mantendo as córneas em uma interface ar-líquido na fronteira estroma em 5% CO2 a 37 ° C. Atualize a mídia após 24 h e depois disso todos os dias.
      Nota: Se executar uma transfecção na ferida, omita os antibióticos até depois do transfection.
    2. Molhe a superfície da córnea uma vez ao dia, adicionando 1 gota de SSFM da mídia condicionadas no prato para manter a umidade. Para isso, leve o prato fora da incubadora, colocá-lo sob o capô, retire a tampa do prato, molhe a superfície com mídia de prato usando uma pipeta estéril, cubra novamente e colocá-lo de volta na incubadora.
    3. Para o nocaute do gene, tratar a ferida com gene-alvo ou controle siRNA que é complexado a um portador de lipídios-mediada conforme instruções do fornecedor (veja abaixo).
    4. Mistura de 5 µ l (50 pmol) de siRNA em 50 µ l de soro e reduzida mínima essencial mídia (EG., Opti-MEM). Misture 2 µ l de reagente de transfeccao em 50 µ l de soro reduzido mídia. Deixe este sentar-se por 5 min e em seguida, misturá-los.
    5. Adicione 200 µ l de mídia mínima reduzido-soro para a mistura de reagente/siRNA.
    6. Pipetar gota a gota sobre o ferimento e incubar durante 3 h.
    7. Lave siRNA da superfície corneal com mídia no prato. Altere a mídia de incubação para SSFM + antibióticos (consulte a Tabela de materiais). Continue a incubação como mencionado anteriormente (passos 1.6.1-1.6.2).

2. histologia: Cortes de parafina e imunocoloração

  1. Preparação do tecido
    1. Após uma incubação de duas semanas, se usar algum do tecido para quantitativo em tempo real do polymerase reação em cadeia (qRT-PCR) análise, antes da fixação, cortada ao meio através da ferida, a córnea. Coloque esta metade ou apenas ¼ (também é de tecido suficiente) para estabilizar o reagente RNA-proteger.
    2. Usando um kit de isolamento padrão, isolar o RNA e executar qRT-PCR.
      Nota: Alternativamente, a parte ferida só pode ser isolada e testada para a expressão do gene.
    3. Coloque a outra metade da córnea em fitas de patologia do tecido e mergulhe no fixador (formol a 10%) durante 2 a 4 dias à temperatura ambiente (RT).
    4. Parafina incorporar esta metade da córnea ferida usando as técnicas padrão.
      Nota: Oriente a córnea ferida para garantir que o seccionamento de tecido irá produzir um corte transversal da córnea.
  2. Immunostaining usando 3, 3'-diaminobenzidine (DAB)
    1. Dia 1
      1. Rótulo de slides corretamente usando um lápis. De paraffinize do tecido, colocando slides em um frasco com agente (2 trocas, 10 min cada) de limpeza.
      2. Re-hidratar o tecido pela transferência de slides para etanol em diminuir as concentrações (100%, 100%, 70%, 50%, dH2O, dH20, 5min para cada alteração).
      3. Execute a recuperação do antígeno por microondas dos slides em um frasco de plástico com tampão citrato (10 mM, pH 6,4) por 5 min. Primeiro ciclo 5 min à 50% de potência. Encha a jarra com tampão citrato e repita. Esfriar por 10 min.
      4. Lave 3x com PBS, 2 min cada. Permeabilize tecido com 1% Triton X-100 em PBS 10 min no bloco RT. seções com 3% de soro de cabra normal (NGS) por 1h no RT em câmara úmida.
      5. Incubar o tecido com anticorpo primário (1: 100 ou como sugere o fornecedor) em 3% NGS durante a noite a 4 ° C (300 µ l por slide).
    2. Dia 2
      1. Enxágue os slides 3x com PBST (PBS, acrescido de 1% Tween 20), 2 min cada. Coloque slides em 3% H2O2 por 10 min bloquear a peroxidase endógena. Lave 3x com PBST, 2 min cada. Incubar as seções com anticorpo secundário HRP (1: 250) em 3% NGS por 1h no RT (300 µ l por slide).
      2. Lave slides 3 x PBST, 2 min cada. Trate de slides com o kit DAB. Adicionar 300 µ l/slide de 3 min. lavagem desliza com dH2O 2 x (mergulhos rápidos).
      3. Counterstain com hematoxilina por 20 s. lavagem do slide com dH2O 2 x (mergulhos rápidos). Mancha com agente de anil para 20 s. enxágue em dH2O por 20 s. desidratando tecido colocando slides em concentrações crescentes de etanol (50%, 70%, 100%, 100%, todos os mergulhos rápidos).
      4. Seque os slides em uma toalha de papel sob o capô para 10-20 min.
      5. Montagem de slides usando 1 gota de montagem mídia, cobrir com lamínula. Rotular e armazenar em RT
      6. Imagem dos slides sob um microscópio e quantificar o sinal DAB com ImageJ7 (ver secção 4).
  3. Immunostaining: fluorescência
    1. No dia 1 siga os passos descritos na etapa 2.2.1. Execute as seguintes etapas no dia 2.
    2. Enxágue os slides 3 x em PBST por 2 min cada. Incubar as seções com anticorpo secundário fluoróforo-tag em 3% NGS (1: 200) por 1h no RT
    3. Lave 3 x em PBST, 2 min cada. Montagem de slides usando 1 gota de 4 ′, mídia de montagem 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e cobrir com uma lamela. Seca na toalha de papel sob a capa de 30 min. loja no escuro a 4 ° C até imagens de fluorescência.
  4. Quantificação usando Image J
    1. Baixe a versão de "Fiji" do ImageJ, que inclui os plugins necessários para DAB, quantificação de coloração.
    2. Abrir uma imagem em Fiji e selecione imagem → → de cor cor deconvolução.
    3. Selecione "DAB-H" como a mancha e, em seguida, clique Okey. Três novas imagens aparecerão. Selecione a imagem que contém a única mancha de DAB.
    4. Para quantificar stromal coloração somente, use a função de borracha ImageJ para remover o epitélio da imagem DAB.
    5. Selecione analisar → medida (ou Ctrl + M) e registre o valor.

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Resultados

Imuno-histoquímica é o ensaio principal utilizado para analisar o sucesso do ex vivo ferida cura experimento. A Figura 4 mostra o epitélio e o estroma anterior no tecido de controle (Figura 4A, 4B). Seis horas após o ferimento, o epitélio estava ausente (Figura 4, 4-D). Seis dias após o ferimento como esperado, o epitélio tinha crescido (F...

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Discussão

Este protocolo descreve um modelo para o estudo de cicatrização de feridas, em um ambiente 3D estratificado natural. Uso da cultura de órgãos como um intermediário entre a cultura de células e de estudos in vivo reduz significativamente os custos, bem como reduzir os procedimentos em animais vivos. Outros modelos 3D tem sido de grande benefício para o campo, incluindo Self sintetizando o gel de colágeno, feita a partir de fibroblastos da córnea humana primária2 ou estas mesmas células i...

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Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo NIH-NEI R01 EY024942, pesquisa para evitar cegueira, Upstate Medical Universidade irrestrito fundos de investigação, e Lions distrito 20-Y. microscopia e análise de imagens de cortes de parafina foram realizadas no núcleo microscopia e preparação de lâmina histológica foi realizada no biorepositórios e no núcleo de patologia da faculdade de medicina de Icahn no Monte Sinai.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
PBSGibco10-010-023
Pen Strep MP Biomedicals91670049
Bovine Collagen SolutionAdvance Biomatrix5005
Pig eyes with lids attached Pel-freeze, ArkansasN/A
6.0 mm trephine KatenaK28014
Surgical Blade Personna0.009
Small scissorFisher895110
ForcepsFisher08953-F
Kim Wipes Kimberly-Clark™ 3412006-666
60 mm cell culture dishes Falcon08-772B
Supplemented Serum- Free media (SSFM)Add all of the following components to DMEM/F-12:  ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. 
DMEM/F-12Gibco11330
ITS Liquid Media Supplement SigmaI3146100X
RPMI 1640 Vitamins Solution SigmaR7256100x
GlutathioneSigmaG6013Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.
1% L-glutamine solution Gibco25030-081100x
MEM Non-essential amino acids solution Gibco11140100x
MEM Sodium pyruvate solution Gibco113601 M Stocks (1,000x) and freeze in single use aliquits.  Use from freezer each time media is made.
ABAM SigmaA7292100x
Gentamicin Sigma30-005-CR200x
Vitamin C Wako070-04832-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)
10% Iodine Fisher ChemicalSI86-1
Tissue Path Cassettes Fisher22-272416
Normal Goat Serum (NGS)Jackson Immuno Research005-000-121We use 3% NGS
Mounting Media Thermo ScientificTA-030-FM
Safe Clear Fisher314-629
Ethyl AlcoholUltra Pure200CSGP200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) 
Sodium citrate FisherBP32710 mM, pH 6.4
HematoxylinEMD MilliporeM10742500
Bluing agent Ricca Chemical Company220-106
1% Triton X-100Fisher9002-93-1Diluted in PBS
0.1% Tween 20 FisherBP337Diluted in PBS
3% Hydrogen Peroxide FisherH324
DAB Kit Vector LaboratoriesSK-4100
Agar Fisher BP1423-500Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL
ParafilmBermis13-374-12
Moist ChamberUse any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.
Lipofectamine 2000
Qiagen RNAprotect Cell ReagentQiagen 76104
Ambion PureLink RNA Mini KitThermo Scientific12183018A
Anti-Fibronectin-EDA AntibodySigmaF61401:200 Diluted in  3% normal goat serum
Anti-alpha smooth muscle actin AntibodySigmaA2547 or C6198 (cy3 conjugated)1:200 Diluted in 3% normal goat serum
Permafluor Thermo ScientificTA-030-FM
DAPI InvitrogenP36931
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP Invitrogen62-65201:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)
Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP Thermo ScientificPA1-859991:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3 Jackson Immuno Research115-165-1461:200 Diluted in  3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)
 Zeiss Axioplan2 ZeissMicroscope
SPOT-2Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MichiganCCD camera

Referências

  1. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121C, 178-193 (2014).
  2. Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e228-e238 (2011).
  3. Ronkko, S., Vellonen, K. S., Jarvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
  4. Bernstein, A. M., Twining, S. S., Warejcka, D. J., Tall, E., Masur, S. K. Urokinase receptor cleavage: a crucial step in fibroblast-to-myofibroblast differentiation. Molecular Biology of the Cell. 18 (7), 2716-2727 (2007).
  5. Zhu, Y. T., et al. Knockdown of both p120 catenin and Kaiso promotes expansion of human corneal endothelial monolayers via RhoA-ROCK-noncanonical BMP-NFkappaB pathway. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1509-1518 (2014).
  6. Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: The dark force in ocular wound healing and fibrosis. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 44-65 (2017).
  7. Gillespie, S. R., Tedesco, L. J., Wang, L., Bernstein, A. M. The deubiquitylase USP10 regulates integrin beta1 and beta5 and fibrotic wound healing. Journal of Cell Science. 130 (20), 3481-3495 (2017).
  8. Yang, Y., et al. TRPV1 potentiates TGFbeta-induction of corneal myofibroblast development through an oxidative stress-mediated p38-SMAD2 signaling loop. PLoS One. 8 (10), e77300(2013).
  9. Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. Disruption of the basement membrane after corneal debridement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (5), 1045-1053 (2000).
  10. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  11. Echevarria, T. J., Di Girolamo, N. Tissue-regenerating, vision-restoring corneal epithelial stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 256-268 (2011).
  12. Wilson, S. E., Mohan, R. R., Hong, J. W., Lee, J. S., Choi, R. The wound healing response after laser in situ keratomileusis and photorefractive keratectomy: elusive control of biological variability and effect on custom laser vision correction. Archives of Ophthalmology. 119 (6), 889-896 (2001).
  13. Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
  14. Lassance, L., Marino, G. K., Medeiros, C. S., Thangavadivel, S., Wilson, S. E. Fibrocyte migration, differentiation and apoptosis during the corneal wound healing response to injury. Experimental Eye Research. 170, 177-187 (2018).
  15. Jester, J. V., Ho-Chang, J. Modulation of cultured corneal keratocyte phenotype by growth factors/cytokines control in vitro contractility and extracellular matrix contraction. Experimental Eye Research. 77 (5), 581-592 (2003).
  16. Gallego-Munoz, P., et al. Effects of TGFbeta1, PDGF-BB, and bFGF, on human corneal fibroblasts proliferation and differentiation during stromal repair. Cytokine. 96, 94-101 (2017).
  17. Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biology Reports. 2, 78(2010).
  18. Lagares, D., et al. Targeted apoptosis of myofibroblasts with the BH3 mimetic ABT-263 reverses established fibrosis. Science Translational Medicine. 9 (420), (2017).
  19. Hinz, B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair. Journal of Investigative Dermatology. 127 (3), 526-537 (2007).
  20. Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1382-1388 (2010).
  21. Henderson, N. C., et al. Targeting of alphav integrin identifies a core molecular pathway that regulates fibrosis in several organs. Nature Medicine. 19 (12), 1617-1624 (2013).
  22. Muro, A. F., et al. An essential role for fibronectin extra type III domain A in pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (6), 638-645 (2008).
  23. Shinde, A. V., et al. The alpha4beta1 integrin and the EDA domain of fibronectin regulate a profibrotic phenotype in dermal fibroblasts. Matrix Biology. 41, 26-35 (2014).
  24. White, E. S., Muro, A. F. Fibronectin splice variants: understanding their multiple roles in health and disease using engineered mouse models. IUBMB Life. 63 (7), 538-546 (2011).
  25. Walraven, M., Hinz, B. Therapeutic approaches to control tissue repair and fibrosis: Extracellular matrix as a game changer. Matrix Biology. , (2018).
  26. Rosenbloom, J., Ren, S., Macarak, E. New frontiers in fibrotic disease therapies: The focus of the Joan and Joel Rosenbloom Center for Fibrotic Diseases at Thomas Jefferson University. Matrix Biology. 51, 14-25 (2016).
  27. Liu, J., et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13. Cell. 147 (1), 223-234 (2011).
  28. Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2011).
  29. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  30. Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
  31. Miron-Mendoza, M., Graham, E., Kivanany, P., Quiring, J., Petroll, W. M. The Role of Thrombin and Cell Contractility in Regulating Clustering and Collective Migration of Corneal Fibroblasts in Different ECM Environments. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (3), 2079-2090 (2015).
  32. Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 262-272 (2010).
  33. Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-Met gene. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (4), 1970-1980 (2010).
  34. Kramerov, A. A., Saghizadeh, M., Ljubimov, A. V. Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells. Journal of Visualized Experiments. (110), e54058(2016).
  35. Cho, S. Y., Kim, M. S., Oh, S. J., Chung, S. K. Comparison of synthetic glues and 10-0 nylon in rabbit lamellar keratoplasty. Cornea. 32 (9), 1265-1268 (2013).
  36. Sharma, A., Mehan, M. M., Sinha, S., Cowden, J. W., Mohan, R. R. Trichostatin a inhibits corneal haze in vitro and in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (6), 2695-2701 (2009).
  37. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Torricelli, A. A., Santhanam, A., Wilson, S. E. Corneal Molecular and Cellular Biology for the Refractive Surgeon: The Critical Role of the Epithelial Basement Membrane. Journal of Refractive Surgery. 32 (2), 118-125 (2016).
  38. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Santhanam, A., Torricelli, A. A. M., Wilson, S. E. Regeneration of Defective Epithelial Basement Membrane and Restoration of Corneal Transparency After Photorefractive Keratectomy. Journal of Refractive Surgery. 33 (5), 337-346 (2017).
  39. Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Experimental Eye Research. 161, 101-105 (2017).
  40. Janin-Manificat, H., et al. Development of ex vivo organ culture models to mimic human corneal scarring. Molecular Vision. 18, 2896-2908 (2012).
  41. Mohan, R. R., et al. Apoptosis, necrosis, proliferation, and myofibroblast generation in the stroma following LASIK and PRK. Experimental Eye Research. 76 (1), 71-87 (2003).
  42. Anumanthan, G., et al. KCa3.1 ion channel: A novel therapeutic target for corneal fibrosis. PLoS One. 13 (3), e0192145(2018).
  43. Chandler, H. L., Colitz, C. M., Lu, P., Saville, W. J., Kusewitt, D. F. The role of the slug transcription factor in cell migration during corneal re-epithelialization in the dog. Experimental Eye Research. 84 (3), 400-411 (2007).

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