Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול עבור אקסית vivo איברים הקרנית תרבות מודל שימושי עבור לימודי ריפוי הפצע מתואר. מערכת מודל זה יכול לשמש כדי להעריך את ההשפעות של סוכני כדי לקדם ריפוי משובי או רעילות התרופה סביבה מאורגנת multicellular תלת-ממד.

Abstract

הקרנית כבר בשימוש נרחב כמערכת מודל ללמוד ריפוי הפצע. היכולת ליצור ולהשתמש תאים בתרבית של ראשי שני מימד (2D) ואת שלושת ממדי (3D) תרבות יצר שפע של מידע לא רק על ביולוגיה הקרנית, אלא גם על הפצע ריפוי, ביולוגיה myofibroblast, וצלקות באופן כללי . המטרה של הפרוטוקול היא מערכת assay לכימות myofibroblast פיתוח, המאפיינת הצטלקות. נדגים איברים הקרנית תרבות שמחוץ דגם באמצעות העיניים חזיר. ב- keratectomy הקדמי זה פצע, קרניות עדיין בתוך העולם פצועים עם להב מעגלית הנקראת trephine. פקק של 1/3 של הקרנית הקדמי הוא הסיר כולל האפיתל, קרום המרתף של החלק הקדמי של stroma. לאחר פציעתו, קרניות לחתוך מהגלוב, רכוב על בסיס קולגן/אגר, תרבותי במשך שבועיים במדיום בחינם בתוספת-סרום יחודיי מיוצב להעצמת התפשטות תאים והפרשת מטריצה חוץ-תאית על ידי fibroblasts תושב. הפעלה של myofibroblasts ב stroma הקדמי ניכרת הקרנית נרפא. מודל זה יכול לשמש כדי assay הפצע הסגר, ההתפתחות של myofibroblasts וסמנים שהותירה ולאחר ללימודי הרעלים. בנוסף, ההשפעות של מעכבי מולקולה קטנה, כמו גם בתיווך השומנים siRNA תקנים עבור גנים יכול להיבדק במערכת זו.

Introduction

הצטלקות הקרנית הנובע פציעה, טראומה או זיהום יכול להוביל מתישה opacities, אובדן ראייה קבועים. לפיכך, יש צורך קריטי כדי לזהות מסלולים אשר ניתן לפלח התערבות טיפולית. אפשרויות הטיפול הנוכחי מוגבל, מורכב בעיקר השתלות הקרנית, אשר אינם נגישים לחולים ברחבי העולם. האדם (איור 1) והן לקרנית בעלי חיים יכול להיות מנוצל עבור דו-ממדי ולומד תרבית תאים 3D1,2. ניתן להשיג לקרנית גווייה האנושית לא מתאימה להשתלה העין בנקים או רקמות מרכזי בנקים (לאומי מחלות מחקר מחלף (NDRI)), עיניים חייתיות ניתן להשיג בית-מטבחיים. ראשי תאים אפיתל הקרנית, סטרומה fibroblasts ועוד לאחרונה, תאי אנדותל, יכול להיות מבודדת ותרבותית של רקמות אלה לריפוי הפצע ולא של הרעלים לימודים3,4,5. מעבר לחשיבות של הבנת הבסיס המולקולרי של מסנוור מחלת עיניים, הנגישות של רקמות ואת היכולת תרבות ראשי תאים הפך הקרנית מערכת מודל חשוב למחקר. הקרנית הוא אידיאלי עבור בחינת השפעת סוכנים על צלקות כפי הקרנית נורמלי הוא שקוף וליצור סוגים מסוימים של פצעים אטימות או שהותירה צלקות (נבדקה ב6). מספר ויוו הפצע הקרנית הריפוי מודלים יש גם בהרחבה מנוצל עבור צלקות מחקרים1. פחות מנוצל היה לשעבר vivo הקרנית פצע ריפוי מודל7,8 המתארים בפירוט כאן. המטרה של שיטה זו היא לכמת את התוצאות הצטלקות מאופיין על-ידי עושי שהותירה ב- 3D multicellular הקרנית ex-vivo מודל המערכת.

הקרנית אפיתל ופצעו זה אינו מפר קרום המרתף אפיתל בדרך כלל סוגר תוך 24-72 h9. זמן קצר לאחר פציעתו, התאים בקצה של האפיתל להתחיל להפיץ ושל העברת לתוך השטח חינם אפיתל, להקים מחדש את פונקציית מחסום האפיתל. פעילות זו ברצף ואחריו הפעלה של התפשטות התאים הבזליים הקרנית קודם, בשלב מאוחר יותר, של תאים קודמן ממוקם באיזור limbal החיצונית כדי להשיג התאוששות של תאים אפיתל המונים10,11. הפצעים האלו לעיתים קרובות לרפא ללא צלקות. עם זאת, פצע חודר קרום המרתף stroma לעיתים קרובות גורמת היווצרות צלקת1. לאחר ופצעו סטרומה הקרנית, מאוכלסת stroma תאים של מקורות מרובים כולל תושב סטרומה תאים, כמו גם הנגזרות מח עצם fibrocytes12,13,14. שהותירה צלקות מאופיין על ידי ההתמדה של myofibroblasts פצע ריפוי. אלה myofibroblasts פתולוגית להדגים אדהזיה מוגבר באמצעות ההצטברות של אינטגרינים הדבקויות מוקד, סיבי סטרס אקטין (α-SMA) השריר α חלקה כויץ ו ההפעלה המקומי של מטריצה חוץ-תאית (ECM)-מבודד כמוס-צורה של גורם גדילה-בטא (TGFβ). הבידול של תאים אפיתל נגזר, המכונה אפיתל המעבר mesenchymal (אמבולנס), עשויים לתרום גם צלקת היווצרות6.

יש איזון עדין בין תאית התמיינות אפופטוזיס לאחר פציעתו. בגלל הקרע בתוך קרום המרתף, צמיחה גורמים כמו פקטורי גדילה נגזר טסית (דם PDGF) ואת TGFβ מרוב דמעות האפיתל להתרחץ stroma, גרימת myofibroblast בידול, לולאה autocrine מתמשכת של הפעלת TGFβ, ו הפרשת לא מאורגן שהותירה ECM15,16. התמדתו של myofibroblasts בתוך הפצע נרפא מקדם אובך, הצטלקות הקרנית (איור 2). עם זאת, ב- regeneratively נרפא פצע למרות myofibroblasts לפתח, הם apoptose, ובכך הם נעדרים או מספר מופחת באופן משמעותי ברקמה בריאה (נבדקה תוך התייחסות6,10). לפיכך, מחקר על שהותירה צלקות התמקדה לפחות בחלקו מיקוד מולקולות המונעים התפתחות myofibroblast מוגזמת או myofibroblast התמדה17,18. כי התמדה myofibroblast מאפיינת במחלה וצלקות וגם שהותירה רקמות כל19, הקרנית עשויה להועיל כמערכת מודל ללמוד כללי המנגנונים התאיים של פיברוזיס.

במערכת מודל שלנו, הקרנית פצוע עם להב גלילי המכונה trephine בעוד עדיין בתוך העולם. בני אדם ונפצעו חזיר לקרנית יכול להיות עם גם 6 או 7 מ מ trephine; ארנב לקרנית trephine 6 מ מ היא המועדפת. הקרנית חזיר דומה בגודל של הקרנית האנושית. כי הן חסכוניות וזמין במספרים גדולים, החזיר את הקרנית משמשים באופן שגרתי לתרבות איברים. יתר על כן, נוגדנים, siRNAs עשוי להגיב עם האדם יש בעקביות cross-reacted עם חזיר7. לאחר פציעתו, קרניות מנותקים מן העולם עם לימבוס ללא פגע, רכוב על אגר/קולגן הבסיס. קרניות הן בתרבית בתקשורת ללא סרום פלוס התייצב ויטמין C כדי לדמות פיברובלסט התפשטות ו- ECM התצהיר20. התוספת של סרום ולא גורמי גדילה לא נחוצים כדי לעודד היווצרות myofibroblast7. לקרנית באופן שגרתי קבוע, מעובד עבור היסטולוגיה לאחר שבועיים של תרבות. עבור גנים, או כדי לבדוק את ההשפעות של סוכן על ריפוי הפצע, הפצע יכולים להיות מטופלים עם siRNA בפצע לאחר ופצעו7 או סוכן מסיסים יכולים להתווסף לתקשורת, בהתאמה8.

Protocol

1. איבר תרבות

  1. ההכנות
    1. להכין פתרון אגר כדלקמן. בבקבוקון קטן, להכין אגר 1% 1 מ"ג/מ"ל קולגן ב- DMEM-F12 עד 20 מ ל. להביא לרתיחה על פלטה חמה. לשים את הפתרון לתוך צינור חרוטי 50 מ. הצב צינור בתוך אמבט מים על פלטה חמה כדי למנוע את הפתרון שהשרף מתהווה.
    2. להכין שהושלם ללא סרום מדיה (SSFM) לפי ההרכב סיפק את הטבלה של חומרים.
      הערה: הסכום הדרוש של SSFM להיות מוכנים תלוי המספר של הקרנית יעובדו. בדרך כלל 30 מ ל הוא מספיק מדיה עבור 4 לקרנית.
  2. דיסקציה
    הערה: לבצע שלב זה ברדס לנתיחה או ברדס כימי. העיניים נשלחים בשלמותם עדיין מחוברת בשקיות נפרדות כדי להגן על גלובס.
    1. הסר גלובס העפעפיים עם להב כירורגי קצה ישר על לוח חוטב ניקיתי אתנול. להסיר רקמות שומן עודף של העין באמצעות סכין או מספריים קטנים (איור 3A, 3B).
    2. לאחר הסרת הגלובוס המכסה, להחזיק את העולם posteriorly עם מלקחיים, מיד לטבול את העין בתוך תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS). במהירות לטבול את זה ב 10% יוד (בתוך 100 מ ל)-x 3. טובלים במהירות 2 x ב- PBS (~ 100 מ בגביע, PBS שינוי בתדירות גבוהה).
    3. באמצעות מגבת נקייה או רקמות, לעטוף את העין circumferentially עם מספיק לחץ יש משטח הקרנית מתוח לחתוך עם trephine.
      הערה: לטפל כדי למנוע את המגבת או רקמות של פנייה אל הקרנית.
  3. ופצעו
    1. השתמש trephine 6 מ מ פצע את המרכז של הקרנית. לחדור את אפיתל ואת משתית הקדמי מבלי לבצע פצע מלא-עובי דרך הקרנית כולו.
      הערה: אם זה חדרו של אנדותל, אובדן הלחץ ואת הנוזל דולף יראו. במקרה זה צריך להיות מושלך העין.
    2. במקום את trephine במרכז הקרנית, לסובב אותו 180° נגד כיוון השעון ונגד 5 x (בכל פעם הכיוון השתנה זה ייחשב פעם אחת) תוך הפעלת לחץ קל להעמיק את הפצע.
      הערה: הפצע כעת אמור להיות עמוק מספיק כדי לאפשר דש רקמות יבוטל באמצעות זוג מלקחיים. אם זה לא המקרה חוזר שלב 1.3.2.
    3. הרם הכנף מהקצוות. במקביל, עם היד השנייה או עם אדם נוסף, השתמש להב חיתוך במקביל העולם כדי לשדר את הרקמה כמו המלקחיים להמשיך תמריא הקרנית הקדמי בתוך שולי הפצע. בתום שלב זה צריך להיות פצע עגול הממוקם במרכז הקרנית (ראה איור 3 ג', 3D).
  4. חיתוך והסרת הקרנית מהגלוב
    1. מחזיק את העין עם הרקמות, עושים חתך קטן 1 מ מ מהקצה של הקרנית עם להב כך לימבוס כלול בתרבות איבר.
    2. שימוש קטן, מספריים חדות לגשת החתך יצרת בשלב הקודם לחתוך ברחבי העולם, ושמירה על שוליים מילימטר לאורך הקרנית לשמור את לימבוס ללא פגע.
    3. מניחים את הקרנית בצלחת 60 מ מ עם 1 מ"ל ל- PBS, פצע בצד למטה עד הרכבה.
  5. הרכבה
    1. ודא שאגר הגיע לטמפרטורה חמה (כ 25 ° C).
    2. עם שני זוגות של מלקחיים, ליצור כוס על ידי מעכב את שני הצדדים של הקרנית עם הצד אנדותל. להוסיף הפתרון אגר להמציא חימם הקרנית באמצעות פיפטה סטרילי העברה של עד זה מלא.
    3. לאחר אגר מתקשה (בדרך כלל 30-45 s) בזהירות להעיף את הקרנית עם אגר לתוך צלחת 60 מ מ (איור 3E). מכסים עם מכסה.
  6. אינקובציה של רגשות
    1. להוסיף 4 מיליליטר SSFM לצלחת, שמירה על הקרנית-ממשק אוויר נוזלי בגבול limbal ב 5% CO2 ב 37 º C. רענן מדיה לאחר 24 שעות, לאחר מכן כל יום אחר.
      הערה: אם ביצוע תרביות של תאים בתוך הפצע, להשמיט את האנטיביוטיקה עד אחרי תרביות תאים.
    2. רטוב על פני הקרנית פעם ביום על-ידי הוספת 1 טיפת SSFM מהתקשורת ממוזגים בצלחת כדי לשמור על לחות. בשביל זה, קח את הצלחת מתוך החממה, להניחה מתחת למכסה המנוע, להסיר את המכסה מאכל, להרטיב את המשטח עם המדיה מן המנה באמצעות פיפטה סטרילי, לכסות שוב ותחזיר אותו בחזרה בחממה.
    3. עבור ג'ין נוק-אאוט, תוכלו לפנק את הפצע עם פילוח ג'ין או לשלוט siRNA זה הוא ומורכבת שליחויות בתיווך השומנים לפי ההוראות של הספק (ראו להלן).
    4. מיקס 5 µL (50 pmol) של siRNA לתוך µL 50 אמצעי חיוני מינימום מופחת-סרום (למשל., Opti-מ). לערבב 2 µL של תרביות תאים ריאגנט לתוך µL 50 של מדיה מופחתת-סרום. . תן את זה לשבת במשך 5 דקות, ואז לערבב אותם.
    5. להוסיף 200 µL של התקשורת מינימום מופחת-סרום לתערובת ריאגנט/siRNA.
    6. פיפטה dropwise לתוך הפצע, תקופת דגירה של 3 שעות.
    7. לשטוף siRNA ממשטח הקרנית עם מדיה בצלחת. לשנות את המדיה דגירה SSFM + אנטיביוטיקה (ראה את הטבלה של חומרים). המשך הדגירה כפי שהוזכר קודם לכן (צעדים 1.6.1-1.6.2).

2. היסטולוגיה: שעוות פרפין סעיפים ו Immunostaining

  1. הכנת הרקמה
    1. לאחר שבועיים דגירה, אם באמצעות חלק מן הרקמה לניתוח כמותי בזמן אמת פולימראז תגובת שרשרת (לרביעיית-PCR), לפני תיקון, חיתוך הקרנית חצי דרך הפצע. החצי הזה או ¼ היחידה (הוא גם מספיק רקמה) לתוך ייצוב ריאגנט להגן על ה-RNA.
    2. באמצעות ערכת בידוד רגיל, לבודד את ה-RNA ולבצע לרביעיית-PCR.
      הערה: לחלופין, החלק הפצועים בלבד יכול להיות מבודד ונבדק על ביטוי גנים.
    3. המקום השני חצי של הקרנית לתוך רקמות פתולוגיה קלטות ויציפו לשבועיים (10% פורמלין) עבור 2-4 ימים בטמפרטורת החדר (RT).
    4. פרפין להטביע זה חצי של הקרנית הפצועים בטכניקות סטנדרטי.
      הערה: אוריינט הקרנית הפצועים כדי להבטיח כי רקמת חלוקתה יפיקו חתך רוחב של הקרנית.
  2. Immunostaining באמצעות 3, 3'-diaminobenzidine (DAB)
    1. יום 1
      1. תווית שקופיות כראוי באמצעות עיפרון. Paraffinize מבטל את הרקמה על ידי הצבת מגלשות לתוך צנצנת עם ניקוי הסוכן (2 שינויים, 10 דקות).
      2. נתרענן הרקמה על ידי העברת השקופיות לתוך אתנול בהפחתת ריכוזי (100%, 100%, 70%, 50%, dH2O, dH20, 5 דקות על כל שינוי).
      3. לבצע אחזור אנטיגן על ידי במיקרוגל את השקופיות בתוך צנצנת פלסטיק עם מאגר ציטראט (10 מ מ, pH 6.4) במשך 5 דקות. מחזור ראשון 5 דקות ב- 50% חשמל. ממלאים את הצנצנת עם מאגר ציטראט וחזור. להתקרר למשך 10 דקות.
      4. רחץ 3 x עם PBS, 2 דקות כל אחד. Permeabilize רקמה עם 1% טריטון X-100 PBS 10 דקות-בלוק RT. חלקים עם סרום עז רגיל 3% (הגדרות) עבור h 1 RT בחדר לחים.
      5. דגירה רקמות עם נוגדן ראשוני (בטחונות או כפי הספק מרמז) ב 3% המיתרים בין לילה ב 4 ° C (300 µL לכל שקופית).
    2. יום 2
      1. שטיפה שקופיות 3 x עם PBST (PBS פלוס 1% Tween 20), 2 דקות כל אחד. מקום שקופיות2O 3% H2 10 דקות לחסום peroxidase אנדוגני. רחץ 3 x עם PBST, 2 דקות כל אחד. דגירה מקטעים עם נוגדנים משניים HRP (1:250) ב- 3% הגדרות עבור 1 h RT (300 µL לכל שקופית).
      2. לשטוף את השקופיות 3 x PBST, 2 דקות כל אחד. פנקו שקופיות עם ערכת DAB. להוסיף 300 µL/שקופית במשך 3 דקות לשטוף שקופיות ב- dH2O 2 x (מטבלים מהירה).
      3. Counterstain עם Hematoxylin עבור שטיפת ס' 20 השקופית ב- dH2O 2 x (מטבלים מהירה). הכתם עם סוכן הכחלת שטיפה ס' 20 ב- dH2O עבור 20-ס' Dehydrate רקמות על-ידי הצבת מחליק לתוך הגדלת ריכוזי אתנול (50%, 70%, 100%, 100%, כל מטבלים מהירה).
      4. יבש שקופיות על מגבת נייר מתחת למכסה המנוע למשך 10-20 דקות.
      5. הר השקופיות באמצעות טיפה 1 של הרכבה מדיה, לכסות עם coverslip. התווית ואת החנות RT.
      6. תמונה של שקופיות תחת מיקרוסקופ ולכמת DAB האות עם ImageJ7 (ראו סעיף 4).
  3. Immunostaining: קרינה פלואורסצנטית
    1. 1 יום בצע את הפעולות המתוארות בשלב 2.2.1. בצע את השלבים הבאים ביום2.
    2. שטיפה שקופיות 3 x ב- PBST למשך 2 דקות. דגירה מקטעים עם נוגדנים משניים מתויג fluorophore ב 3% המיתרים (1:200) עבור h 1-RT.
    3. רחץ 3 x ב- PBST, 2 דקות כל אחד. הר שקופיות באמצעות טיפה 1 של 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) הרכבה מדיית ומכסים עם coverslip. יבש על נייר מגבת מתחת למכסה המנוע במשך 30 דקות החנות בחושך ב 4 ° C עד זריחה הדמיה.
  4. כימות באמצעות תמונה J
    1. הורד את הגירסה "פיג'י" של ImageJ, הכולל את התוספים הנחוצים עבור DAB מכתים כמת.
    2. פתח תמונה בפיג'י ובחר תמונה → צבע ← Deconvolution צבע.
    3. בחר "H כי אמחה קלות" כמו הכתם ולאחר מכן לחץ על אישור. שלוש תמונות החדש יופיע. בחר את התמונה המכיל רק DAB מכתים.
    4. כדי לכמת סטרומה מכתים בלבד, השתמש בפונקציה המחק ImageJ להסרת האפיתל מהתמונה DAB.
    5. בחר לנתח ← מידה (או Ctrl + M) ולהקליט את הערך.

תוצאות

אימונוהיסטוכימיה הוא ראשיות וזמינותו מנוצל כדי לנתח את ההצלחה של האקס vivo פצע ריפוי הניסוי. איור 4 מתאר את אפיתל ואת משתית הקדמי ברקמת שליטה (איור 4A, 4B). שש שעות לאחר פציעתו, האפיתל היה נעדר (איור 4C, 4 D). שישה י...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר מודל לימוד ריפוי הפצע בסביבה תלת-ממד מרובדת טבעית. השימוש של תרבות איברים כמו ביניים בין תרבית תאים ולימודי ויוו מפחיתה באופן משמעותי את עלויות, כמו גם הליכי הפחתת בבעלי חיים. דגמי תלת-ממד אחרים להיות היתרון הגדול לשדה כולל עצמי סינתזה קולגן ג'לים זני העיקרי fibroblasts הקרנית ה...

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי NIH-NEI R01 EY024942, מחקר כדי למנוע עיוורון, בצפון לרפואה אוניברסיטת בלתי מוגבלת וקרנות מחקר, ואת מחוז אריות 20-י' מיקרוסקופ וניתוח תמונה של פרפין סעיפים בוצעו בתוך ליבת מיקרוסקופ, הכנת שקופית היסטולוגית בוצעה Biorepository, פתולוגיה הליבה בבית הספר לרפואה של Icahn במעמד הר סיני.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
PBSGibco10-010-023
Pen Strep MP Biomedicals91670049
Bovine Collagen SolutionAdvance Biomatrix5005
Pig eyes with lids attached Pel-freeze, ArkansasN/A
6.0 mm trephine KatenaK28014
Surgical Blade Personna0.009
Small scissorFisher895110
ForcepsFisher08953-F
Kim Wipes Kimberly-Clark™ 3412006-666
60 mm cell culture dishes Falcon08-772B
Supplemented Serum- Free media (SSFM)Add all of the following components to DMEM/F-12:  ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. 
DMEM/F-12Gibco11330
ITS Liquid Media Supplement SigmaI3146100X
RPMI 1640 Vitamins Solution SigmaR7256100X
GlutathioneSigmaG6013Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.
1% L-glutamine solution Gibco25030-081100X
MEM Non-essential amino acids solution Gibco11140100X
MEM Sodium pyruvate solution Gibco113601 M Stocks (1000X) and freeze in single use aliquits.  Use from freezer each time media is made.
ABAM SigmaA7292100X
Gentamicin Sigma30-005-CR200X
Vitamin C Wako070-04832-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)
10% Iodine Fisher ChemicalSI86-1
Tissue Path Cassettes Fisher22-272416
Normal Goat Serum (NGS)Jackson Immuno Research005-000-121We use 3% NGS
Mounting Media Thermo ScientificTA-030-FM
Safe Clear Fisher314-629
Ethyl AlcoholUltra Pure200CSGP200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) 
Sodium citrate FisherBP32710mM, pH 6.4
HematoxylinEMD MilliporeM10742500
Bluing agent Ricca Chemical Company220-106
1% Triton X-100Fisher9002-93-1Diluted in PBS
0.1% Tween 20 FisherBP337Diluted in PBS
3% Hydrogen Peroxide FisherH324
DAB Kit Vector LaboratoriesSK-4100
Agar Fisher BP1423-500Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL
ParafilmBermis13-374-12
Moist ChamberUse any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.
Lipofectamine 2000
Qiagen RNAprotect Cell ReagentQiagen 76104
Ambion PureLink RNA Mini KitThermo Scientific12183018A
Anti-Fibronectin-EDA AntibodySigmaF61401:200 Diluted in  3% normal goat serum
Anti-alpha smooth muscle actin AntibodySigmaA2547 or C6198 (cy3 conjugated)1:200 Diluted in 3% normal goat serum
Permafluor Thermo ScientificTA-030-FM
DAPI InvitrogenP36931
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP Invitrogen62-65201:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)
Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP Thermo ScientificPA1-859991:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3 Jackson Immuno Research115-165-1461:200 Diluted in  3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)
 Zeiss Axioplan2 ZeissMicroscope
SPOT-2Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MichiganCCD camera

References

  1. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121C, 178-193 (2014).
  2. Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e228-e238 (2011).
  3. Ronkko, S., Vellonen, K. S., Jarvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
  4. Bernstein, A. M., Twining, S. S., Warejcka, D. J., Tall, E., Masur, S. K. Urokinase receptor cleavage: a crucial step in fibroblast-to-myofibroblast differentiation. Molecular Biology of the Cell. 18 (7), 2716-2727 (2007).
  5. Zhu, Y. T., et al. Knockdown of both p120 catenin and Kaiso promotes expansion of human corneal endothelial monolayers via RhoA-ROCK-noncanonical BMP-NFkappaB pathway. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1509-1518 (2014).
  6. Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: The dark force in ocular wound healing and fibrosis. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 44-65 (2017).
  7. Gillespie, S. R., Tedesco, L. J., Wang, L., Bernstein, A. M. The deubiquitylase USP10 regulates integrin beta1 and beta5 and fibrotic wound healing. Journal of Cell Science. 130 (20), 3481-3495 (2017).
  8. Yang, Y., et al. TRPV1 potentiates TGFbeta-induction of corneal myofibroblast development through an oxidative stress-mediated p38-SMAD2 signaling loop. PLoS One. 8 (10), e77300 (2013).
  9. Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. Disruption of the basement membrane after corneal debridement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (5), 1045-1053 (2000).
  10. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  11. Echevarria, T. J., Di Girolamo, N. Tissue-regenerating, vision-restoring corneal epithelial stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 256-268 (2011).
  12. Wilson, S. E., Mohan, R. R., Hong, J. W., Lee, J. S., Choi, R. The wound healing response after laser in situ keratomileusis and photorefractive keratectomy: elusive control of biological variability and effect on custom laser vision correction. Archives of Ophthalmology. 119 (6), 889-896 (2001).
  13. Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
  14. Lassance, L., Marino, G. K., Medeiros, C. S., Thangavadivel, S., Wilson, S. E. Fibrocyte migration, differentiation and apoptosis during the corneal wound healing response to injury. Experimental Eye Research. 170, 177-187 (2018).
  15. Jester, J. V., Ho-Chang, J. Modulation of cultured corneal keratocyte phenotype by growth factors/cytokines control in vitro contractility and extracellular matrix contraction. Experimental Eye Research. 77 (5), 581-592 (2003).
  16. Gallego-Munoz, P., et al. Effects of TGFbeta1, PDGF-BB, and bFGF, on human corneal fibroblasts proliferation and differentiation during stromal repair. Cytokine. 96, 94-101 (2017).
  17. Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biology Reports. 2, 78 (2010).
  18. Lagares, D., et al. Targeted apoptosis of myofibroblasts with the BH3 mimetic ABT-263 reverses established fibrosis. Science Translational Medicine. 9 (420), (2017).
  19. Hinz, B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair. Journal of Investigative Dermatology. 127 (3), 526-537 (2007).
  20. Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1382-1388 (2010).
  21. Henderson, N. C., et al. Targeting of alphav integrin identifies a core molecular pathway that regulates fibrosis in several organs. Nature Medicine. 19 (12), 1617-1624 (2013).
  22. Muro, A. F., et al. An essential role for fibronectin extra type III domain A in pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (6), 638-645 (2008).
  23. Shinde, A. V., et al. The alpha4beta1 integrin and the EDA domain of fibronectin regulate a profibrotic phenotype in dermal fibroblasts. Matrix Biology. 41, 26-35 (2014).
  24. White, E. S., Muro, A. F. Fibronectin splice variants: understanding their multiple roles in health and disease using engineered mouse models. IUBMB Life. 63 (7), 538-546 (2011).
  25. Walraven, M., Hinz, B. Therapeutic approaches to control tissue repair and fibrosis: Extracellular matrix as a game changer. Matrix Biology. , (2018).
  26. Rosenbloom, J., Ren, S., Macarak, E. New frontiers in fibrotic disease therapies: The focus of the Joan and Joel Rosenbloom Center for Fibrotic Diseases at Thomas Jefferson University. Matrix Biology. 51, 14-25 (2016).
  27. Liu, J., et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13. Cell. 147 (1), 223-234 (2011).
  28. Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2011).
  29. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  30. Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
  31. Miron-Mendoza, M., Graham, E., Kivanany, P., Quiring, J., Petroll, W. M. The Role of Thrombin and Cell Contractility in Regulating Clustering and Collective Migration of Corneal Fibroblasts in Different ECM Environments. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (3), 2079-2090 (2015).
  32. Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 262-272 (2010).
  33. Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-Met gene. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (4), 1970-1980 (2010).
  34. Kramerov, A. A., Saghizadeh, M., Ljubimov, A. V. Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells. Journal of Visualized Experiments. (110), e54058 (2016).
  35. Cho, S. Y., Kim, M. S., Oh, S. J., Chung, S. K. Comparison of synthetic glues and 10-0 nylon in rabbit lamellar keratoplasty. Cornea. 32 (9), 1265-1268 (2013).
  36. Sharma, A., Mehan, M. M., Sinha, S., Cowden, J. W., Mohan, R. R. Trichostatin a inhibits corneal haze in vitro and in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (6), 2695-2701 (2009).
  37. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Torricelli, A. A., Santhanam, A., Wilson, S. E. Corneal Molecular and Cellular Biology for the Refractive Surgeon: The Critical Role of the Epithelial Basement Membrane. Journal of Refractive Surgery. 32 (2), 118-125 (2016).
  38. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Santhanam, A., Torricelli, A. A. M., Wilson, S. E. Regeneration of Defective Epithelial Basement Membrane and Restoration of Corneal Transparency After Photorefractive Keratectomy. Journal of Refractive Surgery. 33 (5), 337-346 (2017).
  39. Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Experimental Eye Research. 161, 101-105 (2017).
  40. Janin-Manificat, H., et al. Development of ex vivo organ culture models to mimic human corneal scarring. Molecular Vision. 18, 2896-2908 (2012).
  41. Mohan, R. R., et al. Apoptosis, necrosis, proliferation, and myofibroblast generation in the stroma following LASIK and PRK. Experimental Eye Research. 76 (1), 71-87 (2003).
  42. Anumanthan, G., et al. KCa3.1 ion channel: A novel therapeutic target for corneal fibrosis. PLoS One. 13 (3), e0192145 (2018).
  43. Chandler, H. L., Colitz, C. M., Lu, P., Saville, W. J., Kusewitt, D. F. The role of the slug transcription factor in cell migration during corneal re-epithelialization in the dog. Experimental Eye Research. 84 (3), 400-411 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

144ScarringMyofibroblastEx vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved