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要約

元のプロトコル vivo 角膜器官培養モデル創傷治癒の研究を説明に役立ちます。このモデル系は、再生治癒を促進するエージェントまたは整頓されていた 3 D 細胞環境で薬物の毒性の影響を評価するために使用できます。

要約

角膜は、創傷治癒過程を研究するモデル システムとして広く使用されています。生成し、2 次元 (2 D) および 3 次元 (3 D) 文化の主な哺乳類細胞を活用する能力は、角膜の生物学についてだけでなく、創傷治癒、myofibroblast 生物学と一般的に瘢痕についての情報の富を生成して.プロトコルの目的は、瘢痕を特徴づける myofibroblast 開発を定量化するための分析システムです。豚の目を使用してモデル前のヴィヴォ角膜オルガン文化を紹介します。この前方の角膜切除の傷、トレフィンと呼ばれる円形翼で世界中でまだ角膜を負傷しています。上皮、基底膜、実質の前方の部分など、前方の角膜の約 1/3 のプラグインが削除されます。負傷後、角膜が世界中からカットがコラーゲン/寒天ベースのマウントされ、居住者線維芽細胞細胞増殖と細胞外マトリックスの分泌を増やすために安定化ビタミン C と補われる血清の自由な媒体で 2 週間培養しました。前歯の間質の芽の活性化は、治癒後の角膜で明らかです。このモデルは、傷口の閉鎖、毒物学、芽や線維化マーカーの開発を試金するために使えます。さらに、遺伝子の打撃のための脂質を介した siRNA トランスフェクションと同様、小分子阻害剤の効果は、このシステムでテストできます。

概要

傷害、外傷、または感染症による角膜の瘢痕混濁と永久的な視力喪失を衰弱する可能性があります。従って、治療的介入の対象とすることができます経路を識別するために重要な必要性があります。現在の治療法の選択肢は限定されており、主に角膜移植、世界中で患者へのアクセスが。人間 (図 1) と動物角膜を 2次元のため活用し、3 D 細胞培養研究1,2。アイ ・ バンクや一元的な組織銀行 (国立病研究インターチェンジ (NDRI)) からひと死体角膜移植に適していないを取得でき、動物の目と畜場から入手できます。主な角膜上皮細胞、間質線維芽細胞、さらに最近、血管内皮細胞分離および創傷治癒のためのこれらの組織から培養でき、毒物学研究3,4,5。まばゆいばかりの眼疾患の分子基盤を理解することの重要性、組織および培養細胞機能のアクセシビリティが加え角膜に関する重要なモデル システム。角膜瘢痕通常の角膜は透明で、混濁や線維性瘢痕 (文献6) 傷の特定の種類を作成するようにエージェントの影響をテストに最適です。また、いくつか生体内で角膜創傷治癒モデルは、研究1の瘢痕のため広く用いられています。Ex より利用されている生体角膜創傷治癒のモデル7,8ここで詳細に記述します。このメソッドの目的は 3 D の細胞の線維化のメーカーによって特徴付けられる瘢痕の成果を定量化、ex vivo モデル システム角膜。

通常上皮基底膜を違反しない角膜上皮負傷 24 72 h9内を閉じます。負傷後すぐに端上皮の細胞は、拡散と上皮バリア機能を再確立するため、上皮自由表面に移行を開始します。このアクティビティは、最初と、上皮細胞質量10,11の回復を達成するために外側の輪部のゾーンに位置する前駆細胞の後の段階で順番に角膜基底細胞増殖の活性化が続きます。これらの傷はしばしば傷つかないで直る。しかし、しばしば間質に基底膜を貫通する傷は瘢痕形成1で結果します。角膜実質負傷後骨髄由来線維細胞12,13,14と同様、居住者間質細胞の分化を含む複数の起源の細胞質が表示されます。線維性瘢痕治癒創傷に芽の持続性が特徴です。これらの病理学的芽を示す焦点接着斑、収縮の α-平滑筋アクチン (α SMA) ストレスファイバーと細胞外マトリックス (ECM) の地域活性化におけるインテグリンの蓄積により粘着性が向上-隔離潜熱変換成長因子 β (TGFβ)。間葉転換 (EMT) 上皮として知られている上皮由来細胞の分化も瘢痕形成6に貢献するかもしれない。

負傷した後に細胞の分化とアポトーシスとの間の微妙なバランスがあります。基底膜の違反のための成長因子血小板由来成長因子 (PDGF) と涙から TGFβ と上皮入浴、実質 TGFβ の活性化、持続的な散逸 myofibroblast 分化誘導などとまとまりのない線維性 ECM15,16の分泌。治癒の傷で芽の永続性は、ヘイズと (図 2) 角膜に瘢痕化を促進します。しかしで再生治癒創芽を開発、彼ら apoptose したがって、不在であるまたは (参照6,10レビュー) 治癒組織で大幅に減少番号。したがって、線維性瘢痕に関する研究は、過剰な myofibroblast の開発や myofibroblast の永続性17,18を防ぐ分子をターゲットに少なくとも部分的にきました。Myofibroblast 永続化は、すべて組織19瘢痕および線維症を特徴として、ので角膜は線維化の一般的な細胞メカニズムを研究するモデル システムとして役に立つかもしれません。

モデル体制で世界でトレフィンと呼ばれる円筒形の刃を持つ角膜が負傷しました。人間と豚の角膜については、いずれか、6 または 7 mm トレフィン; で負傷してください。ウサギ角膜 6 mm トレフィンが適しています。豚角膜は、人間の角膜のサイズに近いです。コスト効果的かつ大量にすぐに利用できるので豚角膜、器官培養を日常的に使用されます。さらに、抗体と人間と反応させて Sirna の豚7交叉反応性が一貫しています。負傷後角膜カットされ角膜輪部と世界中からそのまま寒天/コラーゲン ベースにマウントされているとします。角膜は、メディアの無血清培養、さらに線維芽細胞増殖と ECM 蒸着20をシミュレートするためにビタミン C を安定化します。血清添加も成長因子7myofibroblast 形成を誘導するために必要です。角膜は定期的に固定し、文化の 2 週間後組織学のための処理します。遺伝子ノックダウンまたはエージェントの創傷治癒に及ぼす影響をテストするのには、7人が負傷した後傷口に siRNA の傷を扱うことができるまたはメディア、それぞれ8に可溶性のエージェントを追加できます。

プロトコル

1. 器官培養

  1. 準備
    1. 次に寒天液を準備します。小さなフラスコの準備 1% 寒天および DMEM f12 キーで 1 mg/mL コラーゲン 20 mL。ホット プレートで沸騰させます。50 mL の円錐管に、ソリューションを配置します。ソリューションが凝固するを防ぐためにホット プレート上の水槽に管を配置します。
    2. 材料表は、組成によって補われた血清無料メディア (SSFM) を準備します。
      注:SSFM 覚悟の必要量は、処理する角膜の数に依存します。通常 30 mL は 4 角膜の十分なメディアです。
  2. 郭清
    注:郭清のフードか化学のフードでこの手順を実行します。目は地球を保護するために個々 の袋にまだ接続されている蓋が同梱されています。
    1. エタノール洗浄まな板にストレート エッジ外科ブレードと蓋から地球儀を削除します。ブレードまたは小さなはさみ (図 3 a, 3 b) のいずれかを使用して目から余分な脂肪を削除します。
    2. 蓋から世界を取り出したら、世界後方鉗子を押しすぐにリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に目をつけます。すぐにそれをつける (100 mL ビーカー) で 10% ヨウ素の 3 倍。すぐに PBS (~ 100 mL ビーカー、頻繁変更 PBS) で 2 倍を浸しなさい。
    3. 清潔なタオルやティッシュを使用して、円周、トレフィンでカットにピンと張った角膜表面を持っている十分な圧力で目をラップします。
      注: は、角膜へのお問い合わせからタオルや組織に気をつけましょう。
  3. 負傷
    1. 角膜の中心部に 6 mm トレフィンを使用します。角膜全体を全層創傷にせず上皮と前歯間質に浸透します。
      注:血管内皮細胞は浸透圧と体液の漏れ損失が見られます。この場合は目を破棄しなければなりません。
    2. 角膜の中心に、トレフィンを置き、回転させて 180 ° 時計回りと反時計回りに 5 x (方向が変わるたびにそれとしてカウントされます 1 回) 傷を深めるために光の圧力を適用するとき。
      注:傷はピンセットのペアを使用して解除する組織のフラップを許可するように十分に深いはずです。これはリピートの場合ではない場合は、1.3.2 をステップします。
    3. 端からフラップを持ち上げます。同時にもう片方の手または 2 番目の人と鉗子が傷マージン内前方の角膜を持ち上げてするのにつれ、組織を切り取るために世界中に平行に切断刃を使用します。この手順の終了時に (参照してください図 3 C、 3 D) 角膜の中央にある円形の傷があります。
  4. 切断および世界中から角膜を削除
    1. 器官培養における角膜輪部が含まれるように、刃を持つ角膜小切開端から 1 mm を作る組織と眼を持ちます。
    2. シャープはさみ小さなを使用して、角膜輪部をそのまま維持する角膜全体ミリのマージンを維持する、世界中をカットする前のステップで作成した切開にアクセスします。
    3. 取り付けまで 1 ml の PBS、傷側の 60 mm ディッシュに角膜を置きます。
  5. 取付
    1. 寒天は、暖かい温度 (およそ 25 ° C) に来ていることを確認します。
    2. 鉗子の 2 つのペア角膜の内皮側の 2 つの側面を押しながらカップを作成します。それが完全になるまで無菌転送ピペットを使用して角膜にウォーミング ・ アップの寒天液を追加します。
    3. 寒天硬化後 (通常約 30-45 秒) 60 mm プレート (図 3E) に寒天と角膜を慎重に反転します。ふた付きカバーします。
  6. インキュベーション
    1. プレートは、37 ° C で 5% CO2輪部の国境での気液界面での角膜を維持する SSFM の 4 つの mL を追加します。24 h と一日おきにその後後メディアを更新します。
      注:傷にトランスフェクションを行う場合は、トランスフェクション後まで抗生物質を省略します。
    2. 水分を維持するために皿に調節されたメディアから SSFM の 1 滴を追加することで 1 日 1 回角膜表面を湿らせます。このため、インキュベーター外皿を取る、ボンネットの下に配置、皿のふたを削除、滅菌ピペットを使用して皿からメディアで表面が濡れている、再びふたをしてインキュベーターで戻します。
    3. 遺伝子ノックダウンの標的遺伝子に傷の治療またはサプライヤーの指示に従って (次に見なさい) 脂質を介したキャリアの複合体 siRNA を制御します。
    4. 減少血清最低限不可欠なメディアの 50 μ L に siRNA のミックス 5 μ L (50 pmol) (e.g。、オプティ MEM)。減少血清メディアの 50 μ L にトランスフェクション試薬のミックス 2 μ L。5 分間この坐るようにし、それらをミックスします。
    5. 試薬/siRNA 混合物に減少血清最小メディアの 200 μ L を追加します。
    6. 傷に滴下ピペットし、3 時間孵化させなさい。
    7. 皿にメディアを角膜表面から siRNA を洗い流します。培養メディアを変更すると、SSFM + 抗生物質 (材料の表を参照してください)。(手順 1.6.1-1.6.2) 前述の潜伏を続けます。

2. 組織学: パラフィン セクション及び免疫染色

  1. 組織の準備
    1. 後 2 週間潜伏、量的なリアルタイム ポリメラーゼの連鎖反応 (qRT PCR) 分析、修正、する前に角膜は傷を半分にカットの組織のいくつかを使用している場合。この半分や ¼ だけ (どちらかが十分な組織) RNA 保護試薬の安定に。
    2. 標準的な分離キットを使用して、RNA を隔離し、qRT PCR を実行します。
      注:また、傷の一部のみ分離でき遺伝子の発現のためにテストします。
    3. 他の組織病理学カセットに角膜の半分を配置し、室温 (RT) で 2-4 日間固定液 (10% ホルマリン) で水没します。
    4. パラフィンはこれを標準的な技術を使用して負傷した角膜の半分埋め込みます。
      注:ティッシュの区分、角膜の断面図を生成することを確保するため傷ついた角膜に合わせます。
  2. 3, 3'-ジアミノベンジジン (軽打) を用いた免疫染色
    1. 日 1
      1. ラベルは、鉛筆を正しく使用してスライドします。Jar ファイル エージェント (2 変更、10 分ずつ) をオフにスライドを配置することによって、組織を paraffinize ド。
      2. エタノール濃度 (100%、100%、70%、50%、dH2O、dH20、変更ごとに 5 分) を減らすのにスライドを転送することによって組織を水分補給します。
      3. 5 分のクエン酸バッファー (10 mM、pH 6.4) のプラスチック瓶でスライドをマイクロ波による抗原検索を実行します。初回サイクルの 50% の電力で 5 分。クエン酸バッファー付きの瓶を補充し、繰り返します。10 分間冷やします。
      4. 3 x、pbs 2 分を洗ってください。1% トリトン X-100 したブロックで PBS 10 分で湿気の多い室内で常温に 1 時間 3% ヤギ血清 (NGS) のセクションを持つ組織を permeabilize します。
      5. 一次抗体と組織を孵化させなさい (1: 100 またはサプライヤーの通り) 3% の NGS は 4 ° C (スライドあたり 300 μ L) で一晩します。
    2. 日 2
      1. リンス スライド pbst; 3 x (PBS プラス 1% Tween 20)、2 分。内因性ペルオキシダーゼをブロックする 10 分間 3% H2O2にスライドを配置します。3 x PBST、2 分を洗ってください。3% で HRP 二次抗体 (1: 250) とセクションをインキュベート RT で 1 h の NGS (スライドあたり 300 μ L)。
      2. スライド 3 を洗って x PBST、2 分。DAB キットとスライドを扱います。追加 300 μ L/スライド 3 分洗浄が dH2O 2 (クイック ディップ) x スライドします。
      3. 20 s. 洗浄のヘマトキシリンで counterstain dH2O 2 (クイック ディップ) × スライド。ブルーイング dH2O を置くことによって 20 の s. Dehydrate 組織で 20 s. リンス剤で汚れはエタノール (50%、70%、100%、100%、クイックのディップ) 濃度の増加にスライドします。
      4. 10-20 分のフードの下にペーパー タオルの上のスライドを乾燥させます。
      5. メディア、coverslip でカバーを取付の 1 滴を使用してスライドをマウントします。ラベル付けし、室温保存
      6. 顕微鏡でスライドをイメージして ImageJ7 (セクション 4 を参照) と DAB 信号を定量化します。
  3. 免疫染色: 蛍光
    1. 1 日目に 2.2.1 の手順で説明されている手順に従ってください。2日目には、次の手順を実行します。
    2. リンスはスライド pbst; で 2 分の 3 倍です。3% で二次抗体を蛍光タグ付きのセクションを孵化させなさい室温 1 時間 NGS (1: 200)
    3. PBST、2 分で 3 x を洗います。4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) メディアをマウントとカバーの 1 滴を用いた観察のスライドをマウントします。蛍光イメージングまで 4 ° C で暗闇の中 30 分店のフードの下にペーパー タオルで乾燥。
  4. 画像 J を使用して定量化
    1. ImageJ は、軽打の定量化を染色のために必要なプラグインが含まれての「フィジー」バージョンをダウンロードします。
    2. フィジーと選択で画像を開く画像 → 色 → 色デコンボリューション。
    3. 汚れとして「H を軽くたたく」を選択し、 [ok]をクリックします。3 つの新しい画像が表示されます。DAB 染色のみを含むイメージを選択します。
    4. のみ染色質を定量化、軽打のイメージから上皮を削除するのに ImageJ 消しゴム機能を使用します。
    5. 選択分析 → 対策(または Ctrl + M) と値を記録。

結果

免疫組織化学が利用されている主なアッセイの元の成功を分析する生体創傷治癒実験。図 4は、上皮と組織制御 (図 4 a, 4 b) 前歯間質を示しています。負傷後 6 時間上皮も欠席 (図 4、 4 D)。予想通り、負傷後 6 日上皮は (図 4 e、 4 階) 凹凸が?...

ディスカッション

このプロトコルでは、成層の 3 D 環境の創傷治癒過程を研究するためのモデルについて説明します。コストだけでなく、生きている動物を減らす手順器官培養の細胞培養と生体内での研究の間中間物としての使用を大幅に削減します。他の 3 D モデル自己主ひと角膜線維芽細胞2またはこれらの同じ細胞から作られたコラーゲン ・ ゲルの合成を含むフィールドに大きな恩恵を...

開示事項

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

この作品は、ネイ NIH R01 EY024942、失明を防ぐため、北部医療大学無制限研究資金に研究によって支えられたおよびパラフィン切片の画像解析およびライオンズ地区 20, 顕微鏡顕微鏡コアで行われた、Biorepository シナイ山で、Icahn 医学部病理コアでの組織学的のスライドの準備を行った。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
PBSGibco10-010-023
Pen Strep MP Biomedicals91670049
Bovine Collagen SolutionAdvance Biomatrix5005
Pig eyes with lids attached Pel-freeze, ArkansasN/A
6.0 mm trephine KatenaK28014
Surgical Blade Personna0.009
Small scissorFisher895110
ForcepsFisher08953-F
Kim Wipes Kimberly-Clark™ 3412006-666
60 mm cell culture dishes Falcon08-772B
Supplemented Serum- Free media (SSFM)Add all of the following components to DMEM/F-12:  ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. 
DMEM/F-12Gibco11330
ITS Liquid Media Supplement SigmaI3146100X
RPMI 1640 Vitamins Solution SigmaR7256100X
GlutathioneSigmaG6013Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.
1% L-glutamine solution Gibco25030-081100X
MEM Non-essential amino acids solution Gibco11140100X
MEM Sodium pyruvate solution Gibco113601 M Stocks (1000X) and freeze in single use aliquits.  Use from freezer each time media is made.
ABAM SigmaA7292100X
Gentamicin Sigma30-005-CR200X
Vitamin C Wako070-04832-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)
10% Iodine Fisher ChemicalSI86-1
Tissue Path Cassettes Fisher22-272416
Normal Goat Serum (NGS)Jackson Immuno Research005-000-121We use 3% NGS
Mounting Media Thermo ScientificTA-030-FM
Safe Clear Fisher314-629
Ethyl AlcoholUltra Pure200CSGP200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) 
Sodium citrate FisherBP32710mM, pH 6.4
HematoxylinEMD MilliporeM10742500
Bluing agent Ricca Chemical Company220-106
1% Triton X-100Fisher9002-93-1Diluted in PBS
0.1% Tween 20 FisherBP337Diluted in PBS
3% Hydrogen Peroxide FisherH324
DAB Kit Vector LaboratoriesSK-4100
Agar Fisher BP1423-500Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL
ParafilmBermis13-374-12
Moist ChamberUse any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.
Lipofectamine 2000
Qiagen RNAprotect Cell ReagentQiagen 76104
Ambion PureLink RNA Mini KitThermo Scientific12183018A
Anti-Fibronectin-EDA AntibodySigmaF61401:200 Diluted in  3% normal goat serum
Anti-alpha smooth muscle actin AntibodySigmaA2547 or C6198 (cy3 conjugated)1:200 Diluted in 3% normal goat serum
Permafluor Thermo ScientificTA-030-FM
DAPI InvitrogenP36931
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP Invitrogen62-65201:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)
Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP Thermo ScientificPA1-859991:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3 Jackson Immuno Research115-165-1461:200 Diluted in  3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)
 Zeiss Axioplan2 ZeissMicroscope
SPOT-2Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MichiganCCD camera

参考文献

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