JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Протокол для ex vivo роговицы орган культуры модель полезна для заживления ран исследований описано. Эта модель система может использоваться для оценки воздействия агентов для ускорения регенеративных заживления или токсичности препарата в организованной среде 3D многоклеточных.

Аннотация

Роговицы широко используется как модель системы для изучения заживление ран. Способность создавать и использовать основной mammalian клеток в двух размеров (2D) и три трехмерные (3D) культуры вызвало большой объем информации не только о роговицы биологии, но и о рану исцеление, Миофибробласт биологии и в целом рубцов . Целью протокола является системой пробирного для количественной оценки развития Миофибробласт, который характеризует рубцов. Мы демонстрируем роговицы орган культуры ex vivo модель с помощью свинья глаза. В этом передней кератэктомия раны с дисковой пилы, называемый трепаном являются ранения роговицы до сих пор в мире. Вилка примерно 1/3 передней роговицы удаляется, включая эпителия, базальной мембраны и передней частью стромы. После ранения, роговицу вырезанные из шара, смонтирован на базе коллагена/агар и культивируемых на две недели в дополнение сыворотка бесплатно средний с стабилизированный витамин C дополнить пролиферации клеток и внеклеточного матрикса секреции от резидентов фибробластов. Активация миофибробласты в передней стромы проявляется в исцелил роговицы. Эта модель может использоваться для анализа закрытия РАН, развитие миофибробласты и фиброзных маркеры и токсикологических исследований. Кроме того последствия малых молекул ингибиторов, а также липидов опосредованной siRNA трансфекции за нокдаун гена может испытываться в этой системе.

Введение

Рубцов в результате травмы, травмы или инфекции роговицы может привести к изнурительной помутнения и потере постоянного зрения. Таким образом есть острую необходимость определения путей, которые могут быть направлены для терапевтического вмешательства. Текущие параметры лечения ограничены и состоят в основном из операций по пересадке роговицы, которые не являются доступными для пациентов по всему миру. Человека (рис. 1) и животных роговицы может быть использован для 2D и 3D клеточной культуры исследования1,2. Не подходит для пересадки роговицы человека труп можно получить от глаз банков или централизованной тканевых банков (национальных болезни исследования обмена (НДРИ)), и животное глаза могут быть получены из скотобойни. Первичный роговицы эпителиальных клеток, фибробласты стромы и совсем недавно, эндотелиальные клетки, можно изолированные культивированный из этих тканей для заживления ран и токсикология изучает3,4,5. Помимо важности понимания молекулярные основы слепоте глазных болезней доступность ткани и способность к первичной культуре клеток сделал роговицы систему важной моделью для изучения. Роговицы идеально подходит для тестирования влияния агентов на рубцы, как нормальные роговицы является прозрачным и некоторых видов РАН создавать помутнения или фиброзных рубцов (обзор в6). Несколько в vivo роговицы рану исцеления модели широко использовались также для рубцов исследований1. Меньше использовать был ex vivo роговицы раны исцеления модель7,8 , опишите подробно здесь. Цель этого метода заключается в количественном определении рубцов результаты характеризуются фиброзных создателей в 3D многоклеточных роговицы ex vivo модели системы.

Роговицы эпителиальных ранения, которые не нарушают эпителиальных базальной мембраны обычно закрывается в течение 24-72 ч9. Вскоре после ранения, клетки на краю эпителия начать распространение и мигрируют в свободной поверхности эпителия, чтобы восстановить эпителиальные барьерную функцию. Эта деятельность последовательно следуют активации роговицы базально-клеточной пролиферации, первый и, в более поздней стадии, расположенные в зоне внешней послабляющие добиться восстановления эпителиальных клеток массы10,11клеток-предшественников. Часто эти раны заживают без рубцов. Однако рана, которая проникает стромы базальной мембраны часто приводит к шрам формирования1. После ранения роговицы стромы, строма заполняется с ячейками нескольких происхождения, включая дифференцированных резидентов стромальных клеток, а также костный мозг производные фиброциты12,,1314. Фиброзных рубцов характеризуется сохранением миофибробласты в заживления раны. Эти патологические миофибробласты продемонстрировать увеличение адгезии через накопление интегринов в фокуса спайки, сократительная α-гладких мышц актина (α-SMA) стресс волокон и локальная активация внеклеточного матрикса (ECM)-поглощенных латентный преобразование фактор роста бета (TGFβ). Дифференцировки эпителия производные клеток, известный как эпителиального мезенхимальных перехода (EMT), может также способствовать шрам формирования6.

Существует тонкий баланс между дифференцировки клеток и апоптоз после ранения. Из-за нарушения в базальной мембраны, факторы роста, такие, как тромбоцитарный фактор роста (PDGF) и TGFβ от слез и эпителия купаться стромы, вызывая Миофибробласт дифференциации, устойчивый Аутокринный петля TGFβ активации и секрецию дезорганизованы фиброзных ECM15,16. Сохранением миофибробласты в зарубцевавшиеся раны способствует дымки и рубцов в роговице (рис. 2). Однако, в регенеративным зарубцевавшиеся раны хотя миофибробласты развиваются, они apoptose и таким образом отсутствуют или значительно сокращена в номер в зарубцевавшиеся ткани (обзор в ссылка6,10). Таким образом по крайней мере в части исследования по фиброзных рубцов уделялось ориентации молекул, которые препятствуют чрезмерной Миофибробласт развития или Миофибробласт сохранение17,18. Потому что Миофибробласт сохранение характеризует рубцов и фиброзных болезни всех тканей19, роговицы может быть полезным в качестве модельной системы для изучения общих клеточных механизмов фиброза.

В нашей модели системы с лезвием цилиндрические, называемый трепаном еще в мире ранения роговицы. Человека и свинья роговицы может быть ранен с либо 6 или 7 мм трепанации; для кролика роговицы трепаном 6 мм является предпочтительным. Свинья роговицы аналогичные по размеру человека роговицы. Потому что они являются экономически эффективным и легко доступны в больших количествах, свинья роговицы обычно используются для органной культуры. Кроме того антитела и малые интерферирующие РНК, сделал реагировать с человека последовательно cross-reacted с свинья7. После ранения, роговицы, вырезанные из шара с лимба нетронутыми и смонтирован на базы агар/коллагена. Роговицы культивировали в сыворотке свободных СМИ плюс стабилизированный витамин С для моделирования распространения фибробластов и ECM осаждения20. Добавлением сыворотки ни факторы роста необходимо побудить Миофибробласт формирования7. Роговицы обычно закрепляются и обрабатываются для гистологии после двух недель культуры. Нокдаун гена, или для проверки воздействия агента на заживление ран рану можно лечить с помощью малых интерферирующих РНК в рану после ранения7 или растворимые агента могут быть добавлены к средствам массовой информации, соответственно8.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. орган культура

  1. Подготовка
    1. Готовят раствор Агар следующим образом. В небольшой флакон, подготовить 1% агар и бычьего коллагена 1 мг/мл в среде DMEM-F12 до 20 мл. Доведите до кипения на горячей плите. Положите раствор в 50 мл Конические трубки. Место труб в водяной бане на горячей плите сохранить решение от застывающих.
    2. Подготовьте дополненный сыворотки свободных СМИ (SSFM) по составу, представлена в Таблице материалов.
      Примечание: Необходимое количество SSFM должен быть подготовлен зависит количество роговицы для обработки. 30 мл обычно достаточно средств массовой информации для 4 роговицы.
  2. Рассечение
    Примечание: Выполните этот шаг в рассечение капот или химические вытяжки. Глаза поставляются с крышками, по-прежнему придает в отдельные пакеты для защиты глобусы.
    1. Удалите глобусы с крышками с линейка хирургическое лезвие на разделочную доску, этанол очищены. Удалите избыток жировой ткани из глаз с помощью лезвия или маленькие ножницы (рис. 3A, 3B).
    2. После удаления шара из крышки, удерживайте миру кзади пинцетом и сразу окунуть глаз в фосфат амортизированное saline (PBS). Быстро окунуть его 3 x 10% йода (в 100 мл стакан). Быстро окуните 2 x в PBS (~ 100 мл в стакан, изменения PBS част).
    3. С помощью чистое полотенце или ткань, оберните глаз окружности с достаточное давление, чтобы иметь подтянутый поверхность роговицы отрезать с трепан.
      Примечание: позаботьтесь, чтобы предотвратить обращение роговицы полотенцем или салфеткой.
  3. Ранение
    1. Используйте 6 мм трепаном ранить центр роговицы. Проникать эпителия и передней стромы без делать полный толщина рану через весь роговицы.
      Примечание: Если проникли эндотелия, будет рассматриваться потеря давления и электролита. В этом случае глаз должен быть уничтожен.
    2. Место трепаном в центре роговицы, повернуть его на 180° по часовой стрелке и против часовой стрелки 5 x (каждый раз меняется направление будет считаться как один раз) при применении давления света углубить рану.
      Примечание: Раны теперь должно быть достаточно глубоко, чтобы позволить лоскут ткани будут отменены с помощью пары щипцов. Если это не дело повторите шаг 1.3.2.
    3. Поднимите откидную крышку от краев. В то же время с другой стороны или с вторым человеком, используйте лезвие, резка параллельна земной шар, чтобы отрезать ткани как щипцы продолжают подъема передней роговицы в полях рану. По завершении этого шага должна быть круговой рану, расположенный в центре роговицы (см. рис. 3 C, 3D).
  4. Вырезание и удаление роговицы из мира
    1. Держа глаз с ткани, Сделайте небольшой надрез 1 мм от края роговицы с лезвием, так что лимба включен в органной культуры.
    2. Использование малых, острые ножницы доступ разрез, созданный в предыдущем шаге сократить во всем мире, сохраняя миллиметр разницы во всем сохранить нетронутыми лимба роговицы.
    3. Место роговицы в 60 мм блюдо с 1 мл PBS, стороны раны вниз до монтажа.
  5. Монтаж
    1. Убедитесь, что агар пришел к теплой температуры (примерно 25 ° C).
    2. С двумя парами щипцы создайте чашку, удерживая обе стороны роговицы с эндотелиальной стороной. Добавьте агар подогретый раствор в роговицы с помощью пипетки стерильные передачи до тех пор, пока он полностью.
    3. После того, как агар затвердевает (обычно около 30-45 s) тщательно флип роговицы с агар в 60 мм пластины (рис. 3E). Накройте крышкой.
  6. Инкубация
    1. Добавить 4 мл SSFM к пластине, поддержание роговицы в воздухе жидкость интерфейс послабляющие в на границе 5% CO2 при 37 ° C. Обновите СМИ после 24 h и после этого каждый день.
      Примечание: Если эффективность трансфекции в рану, опустите антибиотики после transfection.
    2. Влажная поверхность роговицы, один раз в день, добавляя 1 капля SSFM с кондиционером СМИ в блюдо, чтобы сохранить влагу. Для этого возьмите блюдо из инкубатора, поместить его под капот, крышку блюдо, мокрой поверхности с СМИ от блюдо с помощью стерильной пипеткой, охватывают снова и положил его обратно в инкубаторе.
    3. Нокдаун гена лечить раны с таргетингом на ген или управлять siRNA complexed липидов опосредованной перевозчику согласно инструкциям поставщика (см. ниже).
    4. Mix 5 мкл (50 пмоль) интерферирующей РНК в 50 мкл сокращение сыворотке минимальных основных СМИ (например., Opti-MEM). Смешайте 2 мкл Реагента трансфекции в 50 мкл сокращение сыворотке средств массовой информации. Пусть это сидеть в течение 5 мин и затем смешивать их.
    5. Добавьте 200 мкл сокращение сыворотке минимальных средств массовой информации в смеси реагентов/siRNA.
    6. Пипетка каплям на рану и Инкубируйте 3 h.
    7. Промойте siRNA от поверхности роговицы с СМИ в блюдо. Измените инкубации СМИ SSFM + антибиотики (см. Таблицу материалов). Продолжать инкубации как упоминалось ранее (шаги 1.6.1-1.6.2).

2. Гистология: Парафиновых срезах и иммуноокрашивания

  1. Подготовка ткани
    1. После инкубации две недели, если использовать некоторые из ткани для количественных реального времени полимеразной цепной реакции (qRT ПЦР) анализа, до фиксации, вырезать роговицы в половине через рану. Поместите эту половину или только ¼ (либо это достаточно ткани) в стабилизации РНК защищать реагента.
    2. Используя набор стандартных изоляции, изолировать РНК и выполнить qRT-PCR.
      Примечание: Кроме того часть раненых только может быть изолированы и проверяются на экспрессии генов.
    3. Поместите другой половины роговицы в ткань патологии кассеты и погружаться в фиксатор (10% формалин) для 2-4 дней при комнатной температуре (RT).
    4. Парафин внедрить это половина раненых роговицы с использованием стандартных методов.
      Примечание: Ориент раненых роговицы для обеспечения что разрезания ткани будет производить различных слоев роговицы.
  2. Иммуноокрашивания, с помощью 3, 3'-диаминобензидин (DAB)
    1. 1 день
      1. Лейбл скользит, должным образом с помощью карандаша. Исключения из paraffinize ткани, поместив слайды в банку с очистки агента (2 изменения, 10 мин).
      2. Увлажняет ткань путем передачи слайды в этанол на снижение концентрации (100%, 100%, 70%, 50%, dH2O, dH20, 5 минут для каждого изменения).
      3. Выполните поиск антигена, микроволновой печи слайды в пластиковый сосуд с буфера цитрата (10 мм, pH 6.4) за 5 мин. Первый цикл 5 минут при 50% мощности. Пополнение банка с буфера цитрата и повторить. Остыть в течение 10 мин.
      4. Вымойте 3 x с PBS, 2 мин. Разрушения тканей с 1% тритон X-100 в PBS 10 мин на RT. блок сечения с 3% нормальной козьего сыворотки (НГС) за 1 ч на RT в влажной камере.
      5. Инкубировать ткани с основного антитела (1: 100 или как поставщик предполагает) в 3% NGS на ночь при 4 ° C (300 мкл каждого слайда).
    2. День 2
      1. Промыть слайды 3 x с PBST (PBS плюс 1% анимации 20), 2 мин. Место слайды в 3% H2O2 за 10 минут, чтобы блокировать эндогенной пероксидазы. Вымойте 3 x с PBST, 2 мин. Инкубировать секции с ПХ вторичное антитело (1: 250) в 3% NGS за 1 час на RT (300 мкл каждого слайда).
      2. Вымойте слайды 3 x PBST, 2 мин. Лечить слайды с комплектом DAB. Добавить 300 мкл/слайд 3 мин мыть слайды с dH2O 2 x (быстрый провалы).
      3. Counterstain с гематоксилином для 20 s. мыть слайд с dH2O 2 x (быстрый провалы). Пятно с воронение агентом для 20 s. промыть в dH2O для 20 s. Dehydrate ткани, поместив слайды в повышение концентрации этанола (50%, 70%, 100%, 100%, все быстро провалы).
      4. Сухой слайды на бумажное полотенце под капотом на 10-20 мин.
      5. Смонтируйте слайды с помощью 1 капля монтажа СМИ, крышка с coverslip. Метка и магазина на RT.
      6. Изображения слайдов под микроскопом и количественно DAB сигнал с ImageJ7 (см. раздел 4).
  3. Иммуноокрашивания: флуоресцирования
    1. На 1 день выполните шаги, описанные в шаге 2.2.1. Выполните следующие шаги на день 2.
    2. Промыть слайды 3 x в PBST на 2 мин. Инкубировать секции с меткой Флюорофор вторичное антитело в 3% NGS (1: 200) за 1 ч на RT.
    3. Вымойте 3 x в PBST, 2 мин. Смонтируйте слайды с помощью 1 капля 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) монтажа СМИ и крышка с coverslip. Сухая на бумажном полотенце под капотом на 30 мин магазина в темноте при 4 ° C до флуоресценции изображений.
  4. Количественная оценка с использованием изображений J
    1. Скачайте версию «Фиджи» ImageJ, который включает в себя необходимые плагины для DAB, окрашивание количественной оценки.
    2. Открыть изображение в Фиджи и выберите изображение → цвета → цветовой деконволюция.
    3. Выберите «H DAB» как пятно и затем нажмите кнопку ОК. Появятся три новых изображений. Выберите изображение, которое содержит только ТЫКАТЬ пятнать.
    4. Для количественного определения стромальные окрашивание только, используйте функцию ImageJ Ластик для удаления эпителия из образа DAB.
    5. Выберите анализировать → мера (или Ctrl + M) и запишите значение.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Иммуногистохимия является основным методом используются для анализа успех ex vivo раны исцеления эксперимент. Рисунок 4 изображает эпителия и передней стромы в управления ткани (рис. 4A, 4B). Шесть часов после ранения, эпителий отсу?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот протокол описывает модель для изучения заживления ран в природных слоистых 3D-среде. Использование органной культуры в качестве посредника между клеточной культуры и в естественных условиях исследования значительно снижает затраты, а также сокращения процедуры на живых животных...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана NIH-неи R01 EY024942, исследования, чтобы предотвратить слепоту, Upstate медицинского университета неограниченный исследовательских фондов, и львы район 20-ю. микроскопия и анализ изображений парафиновых срезах были исполнены на ЯДРЕ микроскопии и Гистологические слайд подготовка была исполнена на Biorepository и основной патологии в школе медицины Icahn на горе Синай.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
PBSGibco10-010-023
Pen Strep MP Biomedicals91670049
Bovine Collagen SolutionAdvance Biomatrix5005
Pig eyes with lids attached Pel-freeze, ArkansasN/A
6.0 mm trephine KatenaK28014
Surgical Blade Personna0.009
Small scissorFisher895110
ForcepsFisher08953-F
Kim Wipes Kimberly-Clark™ 3412006-666
60 mm cell culture dishes Falcon08-772B
Supplemented Serum- Free media (SSFM)Add all of the following components to DMEM/F-12:  ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. 
DMEM/F-12Gibco11330
ITS Liquid Media Supplement SigmaI3146100X
RPMI 1640 Vitamins Solution SigmaR7256100x
GlutathioneSigmaG6013Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.
1% L-glutamine solution Gibco25030-081100x
MEM Non-essential amino acids solution Gibco11140100x
MEM Sodium pyruvate solution Gibco113601 M Stocks (1,000x) and freeze in single use aliquits.  Use from freezer each time media is made.
ABAM SigmaA7292100x
Gentamicin Sigma30-005-CR200x
Vitamin C Wako070-04832-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)
10% Iodine Fisher ChemicalSI86-1
Tissue Path Cassettes Fisher22-272416
Normal Goat Serum (NGS)Jackson Immuno Research005-000-121We use 3% NGS
Mounting Media Thermo ScientificTA-030-FM
Safe Clear Fisher314-629
Ethyl AlcoholUltra Pure200CSGP200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) 
Sodium citrate FisherBP32710 mM, pH 6.4
HematoxylinEMD MilliporeM10742500
Bluing agent Ricca Chemical Company220-106
1% Triton X-100Fisher9002-93-1Diluted in PBS
0.1% Tween 20 FisherBP337Diluted in PBS
3% Hydrogen Peroxide FisherH324
DAB Kit Vector LaboratoriesSK-4100
Agar Fisher BP1423-500Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL
ParafilmBermis13-374-12
Moist ChamberUse any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.
Lipofectamine 2000
Qiagen RNAprotect Cell ReagentQiagen 76104
Ambion PureLink RNA Mini KitThermo Scientific12183018A
Anti-Fibronectin-EDA AntibodySigmaF61401:200 Diluted in  3% normal goat serum
Anti-alpha smooth muscle actin AntibodySigmaA2547 or C6198 (cy3 conjugated)1:200 Diluted in 3% normal goat serum
Permafluor Thermo ScientificTA-030-FM
DAPI InvitrogenP36931
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP Invitrogen62-65201:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)
Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP Thermo ScientificPA1-859991:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3 Jackson Immuno Research115-165-1461:200 Diluted in  3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)
 Zeiss Axioplan2 ZeissMicroscope
SPOT-2Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MichiganCCD camera

Ссылки

  1. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121C, 178-193 (2014).
  2. Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e228-e238 (2011).
  3. Ronkko, S., Vellonen, K. S., Jarvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
  4. Bernstein, A. M., Twining, S. S., Warejcka, D. J., Tall, E., Masur, S. K. Urokinase receptor cleavage: a crucial step in fibroblast-to-myofibroblast differentiation. Molecular Biology of the Cell. 18 (7), 2716-2727 (2007).
  5. Zhu, Y. T., et al. Knockdown of both p120 catenin and Kaiso promotes expansion of human corneal endothelial monolayers via RhoA-ROCK-noncanonical BMP-NFkappaB pathway. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1509-1518 (2014).
  6. Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: The dark force in ocular wound healing and fibrosis. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 44-65 (2017).
  7. Gillespie, S. R., Tedesco, L. J., Wang, L., Bernstein, A. M. The deubiquitylase USP10 regulates integrin beta1 and beta5 and fibrotic wound healing. Journal of Cell Science. 130 (20), 3481-3495 (2017).
  8. Yang, Y., et al. TRPV1 potentiates TGFbeta-induction of corneal myofibroblast development through an oxidative stress-mediated p38-SMAD2 signaling loop. PLoS One. 8 (10), e77300(2013).
  9. Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. Disruption of the basement membrane after corneal debridement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (5), 1045-1053 (2000).
  10. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  11. Echevarria, T. J., Di Girolamo, N. Tissue-regenerating, vision-restoring corneal epithelial stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 256-268 (2011).
  12. Wilson, S. E., Mohan, R. R., Hong, J. W., Lee, J. S., Choi, R. The wound healing response after laser in situ keratomileusis and photorefractive keratectomy: elusive control of biological variability and effect on custom laser vision correction. Archives of Ophthalmology. 119 (6), 889-896 (2001).
  13. Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
  14. Lassance, L., Marino, G. K., Medeiros, C. S., Thangavadivel, S., Wilson, S. E. Fibrocyte migration, differentiation and apoptosis during the corneal wound healing response to injury. Experimental Eye Research. 170, 177-187 (2018).
  15. Jester, J. V., Ho-Chang, J. Modulation of cultured corneal keratocyte phenotype by growth factors/cytokines control in vitro contractility and extracellular matrix contraction. Experimental Eye Research. 77 (5), 581-592 (2003).
  16. Gallego-Munoz, P., et al. Effects of TGFbeta1, PDGF-BB, and bFGF, on human corneal fibroblasts proliferation and differentiation during stromal repair. Cytokine. 96, 94-101 (2017).
  17. Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biology Reports. 2, 78(2010).
  18. Lagares, D., et al. Targeted apoptosis of myofibroblasts with the BH3 mimetic ABT-263 reverses established fibrosis. Science Translational Medicine. 9 (420), (2017).
  19. Hinz, B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair. Journal of Investigative Dermatology. 127 (3), 526-537 (2007).
  20. Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1382-1388 (2010).
  21. Henderson, N. C., et al. Targeting of alphav integrin identifies a core molecular pathway that regulates fibrosis in several organs. Nature Medicine. 19 (12), 1617-1624 (2013).
  22. Muro, A. F., et al. An essential role for fibronectin extra type III domain A in pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (6), 638-645 (2008).
  23. Shinde, A. V., et al. The alpha4beta1 integrin and the EDA domain of fibronectin regulate a profibrotic phenotype in dermal fibroblasts. Matrix Biology. 41, 26-35 (2014).
  24. White, E. S., Muro, A. F. Fibronectin splice variants: understanding their multiple roles in health and disease using engineered mouse models. IUBMB Life. 63 (7), 538-546 (2011).
  25. Walraven, M., Hinz, B. Therapeutic approaches to control tissue repair and fibrosis: Extracellular matrix as a game changer. Matrix Biology. , (2018).
  26. Rosenbloom, J., Ren, S., Macarak, E. New frontiers in fibrotic disease therapies: The focus of the Joan and Joel Rosenbloom Center for Fibrotic Diseases at Thomas Jefferson University. Matrix Biology. 51, 14-25 (2016).
  27. Liu, J., et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13. Cell. 147 (1), 223-234 (2011).
  28. Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2011).
  29. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  30. Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
  31. Miron-Mendoza, M., Graham, E., Kivanany, P., Quiring, J., Petroll, W. M. The Role of Thrombin and Cell Contractility in Regulating Clustering and Collective Migration of Corneal Fibroblasts in Different ECM Environments. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (3), 2079-2090 (2015).
  32. Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 262-272 (2010).
  33. Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-Met gene. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (4), 1970-1980 (2010).
  34. Kramerov, A. A., Saghizadeh, M., Ljubimov, A. V. Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells. Journal of Visualized Experiments. (110), e54058(2016).
  35. Cho, S. Y., Kim, M. S., Oh, S. J., Chung, S. K. Comparison of synthetic glues and 10-0 nylon in rabbit lamellar keratoplasty. Cornea. 32 (9), 1265-1268 (2013).
  36. Sharma, A., Mehan, M. M., Sinha, S., Cowden, J. W., Mohan, R. R. Trichostatin a inhibits corneal haze in vitro and in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (6), 2695-2701 (2009).
  37. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Torricelli, A. A., Santhanam, A., Wilson, S. E. Corneal Molecular and Cellular Biology for the Refractive Surgeon: The Critical Role of the Epithelial Basement Membrane. Journal of Refractive Surgery. 32 (2), 118-125 (2016).
  38. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Santhanam, A., Torricelli, A. A. M., Wilson, S. E. Regeneration of Defective Epithelial Basement Membrane and Restoration of Corneal Transparency After Photorefractive Keratectomy. Journal of Refractive Surgery. 33 (5), 337-346 (2017).
  39. Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Experimental Eye Research. 161, 101-105 (2017).
  40. Janin-Manificat, H., et al. Development of ex vivo organ culture models to mimic human corneal scarring. Molecular Vision. 18, 2896-2908 (2012).
  41. Mohan, R. R., et al. Apoptosis, necrosis, proliferation, and myofibroblast generation in the stroma following LASIK and PRK. Experimental Eye Research. 76 (1), 71-87 (2003).
  42. Anumanthan, G., et al. KCa3.1 ion channel: A novel therapeutic target for corneal fibrosis. PLoS One. 13 (3), e0192145(2018).
  43. Chandler, H. L., Colitz, C. M., Lu, P., Saville, W. J., Kusewitt, D. F. The role of the slug transcription factor in cell migration during corneal re-epithelialization in the dog. Experimental Eye Research. 84 (3), 400-411 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

144Ex vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены