Ex Vivo modello di cultura di organo corneale per la guarigione delle ferite studi

Riepilogo

Un protocollo per un ex vivo modello di cultura di organo corneale utile per studi di guarigione della ferita è descritto. Questo sistema modello può essere utilizzato per valutare gli effetti degli agenti per promuovere la guarigione rigenerativa o tossicità della droga in un ambiente organizzato di pluricellulare 3D.

Abstract

La cornea è stata utilizzata ampiamente come sistema modello per studiare la guarigione della ferita. La capacità di generare ed utilizzare le cellule di mammifero primarie in due dimensioni (2D) e tridimensionali (3D) tre cultura ha generato una ricchezza di informazioni non solo sulla biologia della cornea, ma anche sulla ferita guarigione, biologia dei miofibroblasti e cicatrici in generale . L'obiettivo del protocollo è un sistema di test per quantificare lo sviluppo dei miofibroblasti, che caratterizza lo sfregio. Dimostriamo un organo corneale cultura ex vivo modello utilizzando maiale occhi. In questo keratectomy anteriore ferita, cornee ancora nel globo sono ferite con una lama circolare chiamata un trephine. Una spina di circa 1/3 della cornea anteriore viene rimosso compreso l'epitelio, la membrana dello scantinato e la parte anteriore dello stroma. Dopo il ferimento, cornee sono tagliate dal globo, montate su una base di collagene/agar e coltivate per due settimane in mezzo libero siero integrato con vitamina C stabilizzata per aumentare la proliferazione delle cellule e la secrezione extracellulare dai fibroblasti residente. Attivazione dei miofibroblasti nello stroma anteriore è evidente nella cornea guarita. Questo modello può essere utilizzato di saggiare la chiusura della ferita, lo sviluppo di miofibroblasti e fibrotici marcatori e per gli studi di tossicologia. Inoltre, gli effetti di piccole molecole inibitrici, come pure la transfezione di siRNA del lipido-mediata per atterramento di gene possono essere analizzati in questo sistema.

Introduzione

Cicatrici nella cornea derivanti da lesioni, traumi o infezione può portare a debilitante opacità e perdita permanente della vista. Così, c'è una necessità critica di individuare percorsi che possono essere oggetto di intervento terapeutico. Opzioni correnti di trattamento sono limitate e sono costituiti principalmente di trapianti corneali, che non sono accessibili ai pazienti in tutto il mondo. Sia umani (Figura 1) e cornee animale possono essere utilizzate per il 2D e coltura cellulare 3D studi^1,2. Non adatto per il trapianto di cornee cadavere umano possono essere ottenute da banche degli occhi o le banche di tessuti centralizzata (nazionale malattia ricerca Interchange (NDRI)), e gli occhi degli animali possono essere ottenuti da un mattatoio. Primarie di cellule epiteliali corneale e più recentemente, le cellule endoteliali, fibroblasti stromal può essere isolato e coltivato da questi tessuti per la guarigione della ferita e tossicologia studi^3,4,5. Oltre all'importanza di comprendere le basi molecolari di malattia dell'occhio di accecante, l'accessibilità del tessuto e la capacità di cellule primarie di cultura ha reso la cornea un importante sistema modello per lo studio. La cornea è ideale per testare gli effetti di agenti su cicatrici come la cornea normale è trasparente e certi tipi di ferite creano opacità o cicatrici fibrotiche (rivisto in⁶). Diversi in vivo della ferita corneale guarigione modelli inoltre sono stati utilizzati estesamente per cicatrici studi¹. Meno utilizzati è stato l'ex vivo cornea ferita guarigione modello^7,8 che è descrivere in dettaglio qui. L'obiettivo di questo metodo è quello di quantificare i risultati sfregio caratterizzati dai creatori fibrotiche in un 3D multicellulari corneale ex vivo modello di sistema.

Ferendo epiteliale corneale che non violano la membrana basale epiteliale normalmente si chiude entro 24-72 h⁹. Presto dopo la ferita, le cellule al bordo dell'epitelio iniziare la diffusione e la migrazione in superficie epiteliale libera, per ristabilire la funzione di barriera epiteliale. Questa attività in sequenza è seguita dall'attivazione di proliferazione delle cellule basali corneale prima e, in una fase successiva, di cellule precursori situato presso la zona limbal esterna per ottenere il recupero di cellule epiteliali massa^10,11. Queste ferite spesso guariscono senza lasciare cicatrici. Tuttavia, una ferita che penetra la membrana dello scantinato dello stroma spesso comporta cicatrice formazione¹. Dopo la ferita corneale stromale, lo stroma è popolato con cellule di origini multiple tra cui differenziate cellule stromale residenti così come derivate da midollo osseo fibrociti^12,13,14. Cicatrici fibrotiche è caratterizzata dalla persistenza di myofibroblasts in una guarigione della ferita. Questi myofibroblasts patologico dimostrare adesione aumentata attraverso l'accumulo delle integrine nell'adesioni focali, fibre contrattili α-liscia del muscolo actina (α-SMA) stress e attivazione locale della matrice extracellulare (ECM)-sequestrato trasformazione di latente crescita fattore-beta (TGFβ). La differenziazione delle cellule epiteliali derivate, noto come epiteliale di transizione mesenchimale (EMT), può anche contribuire per cicatrice formazione⁶.

C'è un delicato equilibrio tra differenziazione cellulare e l'apoptosi dopo la ferita. A causa della violazione nella membrana dello scantinato, fattori di crescita come il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) e TGFβ da lacrime e l'epitelio si bagnano lo stroma, inducendo la differenziazione dei miofibroblasti, un loop autocrino sostenuta di attivazione del TGFβ e la secrezione di disorganizzato fibrotica ECM^15,16. La persistenza dei miofibroblasti nella ferita guarita promuove haze e cicatrici nella cornea (Figura 2). Tuttavia, in regeneratively guarito ferita anche se sviluppano miofibroblasti, essi apoptose e così sono assenti o significativamente ridotto in numero nel tessuto guarito (rivisto in riferimento^6,10). Così, ricerca su cicatrici fibrotiche si è concentrata, almeno in parte sul targeting molecole che impediscono lo sviluppo eccessivo dei miofibroblasti o myofibroblast persistenza^17,18. Perché myofibroblast persistenza caratterizza la malattia sia sfregio e fibrotica in tutti tessuti¹⁹, la cornea può essere utile come sistema modello per lo studio dei meccanismi cellulari generali di fibrosi.

Nel nostro sistema di modello, la cornea è ferita con una lama cilindrica chiamata un trephine mentre ancora nel globo. Umano e cornee di maiale possono essere ferite con entrambi un trephine 6 o 7 mm; per le cornee coniglio un trephine 6mm è preferito. La cornea di maiale è simile a quello della cornea umana. Perché essi sono efficaci e prontamente disponibili in gran numero, cornee di maiale sono abitualmente utilizzate per la coltura di organo. Inoltre, gli anticorpi e siRNA fatti reagire con umani hanno costantemente traversa-ha reagito con maiale⁷. Dopo il ferimento, cornee sono tagliate dal globo con il limbus intatte e montato su un base di agar/collagene. Le cornee sono coltivate in terreni privi di siero più stabilizzata di vitamina C per simulare la proliferazione dei fibroblasti e la deposizione di ECM²⁰. L'aggiunta di siero né fattori di crescita sono necessari per indurre myofibroblast formazione⁷. Le cornee sono ordinariamente fissa e trattate per istologia dopo due settimane di cultura. Per atterramento di gene, o per testare gli effetti di un agente sulla guarigione delle ferite, la ferita può essere trattata con siRNA nella ferita dopo che⁷ o un agente di purificazione può essere aggiunto ai media, rispettivamente⁸.

Protocollo

1. organo cultura

1. Preparazioni
   1. Preparare la soluzione di agar come segue. In un piccolo pallone, preparare 1% agar e il collagene bovino 1 mg/mL in DMEM-F12 fino a 20 mL. Portare ad ebollizione su un piatto caldo. Mettere la soluzione in una provetta conica da 50 mL. Posizionare il tubo in un bagno di acqua su una piastra calda per mantenere la soluzione da solidificarsi.
   2. Preparare i supporti senza siero completati (SSFM) secondo la composizione fornito in Tabella materiali.
      Nota: La quantità necessaria di SSFM essere preparati dipende dal numero delle cornee da elaborare. 30 mL è solitamente abbastanza media per 4 cornee.
2. Dissezione
   Nota: Eseguire questo passaggio in una cappa di dissezione o una cappa chimica. Gli occhi vengono spediti con coperchi ancora attaccati in singoli sacchetti per proteggere i globi.
   1. Rimuovere globi da coperchi con una lama chirurgica retti su un tagliere pulito di etanolo. Rimozione di tessuto adiposo in eccesso dall'occhio utilizzando una lama o un piccolo paio di forbici (Figura 3A, 3B).
   2. Dopo aver rimosso il globo dal coperchio, tenere il mondo posteriormente con il forcipe e immergere immediatamente l'occhio in tampone fosfato salino (PBS). Rapidamente si tuffo 3x in 10% di iodio (in un becher da 100 mL). Immergere rapidamente 2x in PBS (~ 100 mL in un becher da PBS cambia frequentemente).
   3. Utilizzando un asciugamano pulito o tessuto, avvolgere l'occhio lungo la circonferenza con una pressione sufficiente per avere una superficie cornea tesa a tagliare con il trapano.
      Nota: fare attenzione per evitare l'asciugamano o tessuto dal contatto con la cornea.
3. Ferendo
   1. Utilizzare un trephine 6mm per ferita al centro della cornea. Penetrare l'epitelio e lo stroma anteriore senza fare una ferita di pieno-spessore attraverso l'intera cornea.
      Nota: Se è penetrato l'endotelio, una perdita di pressione e liquido sarà visibili. In questo caso l'occhio deve essere eliminata.
   2. Posizionare il trephine al centro della cornea, ruotarla di 180° in senso orario e antiorario 5 x (ogni volta che il senso è cambiato conterà come una volta) esercitando una leggera pressione per approfondire la ferita.
      Nota: La ferita dovrebbe essere abbastanza profonda da consentire un lembo di tessuto da sollevare utilizzando un paio di pinze. Se questo non è il caso ripetere il punto 1.3.2.
   3. Sollevare la linguetta dai bordi. Allo stesso tempo, con l'altra mano o con una seconda persona, utilizzare una lama, taglio parallelo al globo per tagliare il tessuto come il forcipe continuano a sollevare la cornea anteriore all'interno del margine della ferita. A conclusione di questa fase ci dovrebbe essere una ferita circolare situata al centro della cornea (Vedi Figura 3 C, 3D).
4. Taglio e rimozione di Cornea dal globo
   1. Tenendo l'occhio con il tessuto, praticare una piccola incisione 1 mm dal bordo della cornea con una lama affinché il limbus è incluso nella coltura di organo.
   2. Utilizzando piccoli, forbici affilate accedere l'incisione creata nel passaggio precedente per tagliare intorno al globo, mantenendo un margine di millimetro in tutta la cornea per mantenere intatto il limbus.
   3. Posizionare la cornea in un piatto di 60 mm con 1 mL di PBS, ferita laterale verso il basso fino al montaggio.
5. Montaggio
   1. Assicurarsi che l'agar è venuto a una temperatura calda (circa 25 ° C).
   2. Con due paia di pinze, creare una tazza con il sollevare i due lati della cornea con il lato endoteliale. Aggiungere la soluzione di agar riscaldato nella cornea utilizzando una pipetta sterile fino a quando è pieno.
   3. Dopo l'agar si indurisce (solitamente circa 30-45 s) Capovolgere attentamente la cornea con l'agar nella piastra di 60 mm (Figura 3E). Coprire con un coperchio.
6. Incubazione
   1. Aggiungere 4 mL di SSFM alla piastra, mantenendo le cornee ad un'interfaccia aria-liquido al confine limbal in 5% CO₂ a 37 ° C. Aggiornamento media dopo 24 h e da allora in poi ogni altro giorno.
      Nota: Se si esegue una trasfezione nella ferita, omettere gli antibiotici fino a dopo la trasfezione.
   2. Bagnare la superficie cornea, una volta al giorno aggiungendo 1 goccia di SSFM dal media condizionati nel piatto per mantenere l'umidità. Per questo, prendere il piatto fuori l'incubatrice, posizionarlo sotto il cofano, togliere il coperchio piatto, bagnare la superficie con i media da piatto utilizzando una pipetta sterile, coprire nuovamente e rimetterlo a posto presso l'incubatore.
   3. Per atterramento di gene, trattare la ferita con gene-targeting o controllo siRNA che è complessato ad un elemento portante del lipido-mediata seguendo le istruzioni del fornitore (Vedi sotto).
   4. Mix 5 µ l (50 pmol) di siRNA in 50 µ l di siero ridotto minimo essenziale media (ad es., Opti-MEM). Mescolare 2 µ l di reagente di transfezione in 50 µ l di siero ridotto media. Lasciate che questo sedersi per 5 min e poi mescolare.
   5. Aggiungere 200 µ l di siero ridotto minimo media alla miscela reagente/siRNA.
   6. Pipettare goccia a goccia sulla ferita e incubare per 3 h.
   7. Lavare siRNA dalla superficie corneale con media nel piatto. Modificare i media di incubazione SSFM + antibiotici (Vedi la Tabella materiali). Continuare l'incubazione come accennato in precedenza (punti 1.6.1-1.6.2).

2. istologia: Sezioni della paraffina e Immunostaining

1. Preparare il tessuto
   1. Dopo un'incubazione di due settimane, se usare il tessuto per quantitativa della polimerasi reazione a catena (qRT-PCR) analisi in tempo reale, prima del fissaggio, tagliata la cornea nella metà attraverso la ferita. Posizionare questa metà o solo ¼ (o è abbastanza tessuto) in RNA-proteggere reagente di stabilizzazione.
   2. Utilizzando un kit di isolamento standard, RNA di isolare ed eseguire qRT-PCR.
      Nota: In alternativa, la parte ferita solo può essere isolata e testata per l'espressione genica.
   3. Inserire l'altra metà della cornea in cassette di patologia di tessuti e immergere nel fissativo (formalina al 10%) per 2-4 giorni a temperatura ambiente (TA).
   4. Paraffina incorporare questa metà della cornea ferita utilizzando tecniche standard.
      Nota: Orientare la cornea ferita per garantire che il tessuto sezionamento produrrà una sezione trasversale della cornea.
2. Immunostaining usando 3, 3'-diaminobenzidina (DAB)
   1. 1 ° giorno
      1. Etichetta scorre correttamente utilizzando una matita. De-paraffinize il tessuto inserendo diapositive in un barattolo con intermedium (2 cambi, 10 min. ciascuno).
      2. Reidratare il tessuto trasferendo i vetrini in etanolo a diminuire le concentrazioni (100%, 100%, 70%, 50%, dH₂O, dH₂0, 5 min per ogni modifica).
      3. Eseguire ricupero dell'antigene di microwaving le diapositive in un barattolo di plastica con tampone citrato (10 mM, pH 6.4) per 5 min. Primo ciclo di 5 min a 50% di potenza. Riempire il vaso con tampone citrato e ripetere. Raffreddare per 10 minuti.
      4. Lavare 3 volte con PBS, 2 min ciascuno. Permeabilize tessuto con 1% Triton X-100 in PBS 10 min a RT. blocco sezioni con siero di capra normale 3% (NGS) per 1 h a temperatura ambiente in camera umida.
      5. Incubare il tessuto con l'anticorpo primario (1: 100 o come suggerisce il fornitore) nel 3% NGS durante la notte a 4 ° C (300 µ l per vetrino).
   2. 2 ° giorno
      1. Risciacquo diapositive 3 volte con PBST (PBS più 1% Tween 20), 2 min ciascuno. Posizionare le diapositive nel 3% H₂O₂ per 10 min bloccare perossidasi endogena. Lavare 3 volte con PBST, 2 min ciascuno. Incubare le sezioni con anticorpo secondario HRP (1: 250) nel 3% NGS per 1h a RT (300 µ l per vetrino).
      2. Lavare i vetrini 3 x PBST, 2 min ciascuno. Trattamento di diapositive con il kit DAB. Aggiungere 300 µ l/scorrevole per 3 min lavaggio degli acquascivoli con dH₂O 2 x (rapido DIP).
      3. Colorante di contrasto con ematossilina per 20 s. lavare il vetrino con dH₂O 2 x (rapido DIP). Macchia con agente azzurrante per 20 s. risciacquo in dH₂O per 20 s. disidratare tessuto inserendo diapositive in aumento delle concentrazioni di etanolo (50%, 70%, 100%, 100%, tutte le salse rapidi).
      4. A secco di diapositive su un tovagliolo di carta sotto il cofano per 10-20 min.
      5. Montare diapositive utilizzando 1 goccia di montanti, coprire con vetrino coprioggetto. Etichetta e memorizzare a TA.
      6. I vetrini con un microscopio di immagine e quantificare il segnale DAB con ImageJ⁷ (vedere paragrafo 4).
3. Immunostaining: fluorescenza
   1. Il giorno 1 seguire la procedura descritta al punto 2.2.1. Il giorno 2procedere come segue.
   2. Risciacquo diapositive 3x in PBST per 2 minuti ciascuno. Incubare le sezioni con anticorpo secondario fluorophore-etichetta in 3% NGS (1: 200) per 1 h a TA.
   3. Lavare 3x in PBST, 2 min ciascuno. Montare diapositive utilizzando 1 goccia di 4 ′, mezzi di montaggio 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e coprire con un vetrino coprioggetti. Asciugare su carta assorbente sotto il cofano per 30 min. Store al buio a 4 ° C fino a fluorescenza.
4. Quantificazione mediante immagine J
   1. Scaricare la versione di "Fiji" di ImageJ, che include i plugin necessari per quantificazione di colorazione DAB.
   2. Aprire un'immagine in Fiji e selezionare immagine → colore → deconvoluzione di colore.
   3. Selezionare "H DAB" come la macchia e quindi fare clic su OK. Tre nuove immagini appariranno. Selezionare l'immagine che contiene solo DAB macchiatura.
   4. Per quantificare stromal macchiatura solo, è necessario utilizzare la funzione di gomma ImageJ per rimuovere l'epitelio dall'immagine DAB.
   5. Selezionare analizzare → misura (o Ctrl + M) e registrare il valore.

Risultati

Immunohistochemistry è il test primario utilizzato per analizzare il successo dell'ex vivo ferita guarigione esperimento. Figura 4 raffigura l'epitelio e stroma anteriore in tessuto di controllo (Figura 4A, 4B). Sei ore dopo la ferita, l'epitelio era assente (Figura 4, 4D). Sei giorni dopo la ferita come previsto, l'epitelio aveva ricresciuti (F...

Discussione

Questo protocollo descrive un modello di studio della guarigione della ferita in un ambiente naturale di 3D stratificato. Uso della cultura di organo come intermedio tra coltura cellulare e gli studi in vivo riduce significativamente i costi, nonché riducendo le procedure sugli animali vivi. Altri modelli 3D sono stati di grande beneficio per il campo tra cui self-sintetizzazione gel di collagene in fibroblasti corneali umano primario² o queste stesse cellule incorporati in gel fatto da collageni...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Gibco	10-010-023
Pen Strep	MP Biomedicals	91670049
Bovine Collagen Solution	Advance Biomatrix	5005
Pig eyes with lids attached	Pel-freeze, Arkansas	N/A
6.0 mm trephine	Katena	K28014
Surgical Blade	Personna	0.009
Small scissor	Fisher	895110
Forceps	Fisher	08953-F
Kim Wipes	Kimberly-Clark™ 34120	06-666
60 mm cell culture dishes	Falcon	08-772B
Supplemented Serum- Free media (SSFM)			Add all of the following components to DMEM/F-12:  ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C.
DMEM/F-12	Gibco	11330
ITS Liquid Media Supplement	Sigma	I3146	100X
RPMI 1640 Vitamins Solution	Sigma	R7256	100X
Glutathione	Sigma	G6013	Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.
1% L-glutamine solution	Gibco	25030-081	100X
MEM Non-essential amino acids solution	Gibco	11140	100X
MEM Sodium pyruvate solution	Gibco	11360	1 M Stocks (1000X) and freeze in single use aliquits.  Use from freezer each time media is made.
ABAM	Sigma	A7292	100X
Gentamicin	Sigma	30-005-CR	200X
Vitamin C	Wako	070-0483	2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)
10% Iodine	Fisher Chemical	SI86-1
Tissue Path Cassettes	Fisher	22-272416
Normal Goat Serum (NGS)	Jackson Immuno Research	005-000-121	We use 3% NGS
Mounting Media	Thermo Scientific	TA-030-FM
Safe Clear	Fisher	314-629
Ethyl Alcohol	Ultra Pure	200CSGP	200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%)
Sodium citrate	Fisher	BP327	10mM, pH 6.4
Hematoxylin	EMD Millipore	M10742500
Bluing agent	Ricca Chemical Company	220-106
1% Triton X-100	Fisher	9002-93-1	Diluted in PBS
0.1% Tween 20	Fisher	BP337	Diluted in PBS
3% Hydrogen Peroxide	Fisher	H324
DAB Kit	Vector Laboratories	SK-4100
Agar	Fisher	BP1423-500	Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL
Parafilm	Bermis	13-374-12
Moist Chamber			Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.
Lipofectamine 2000
Qiagen RNAprotect Cell Reagent	Qiagen	76104
Ambion PureLink RNA Mini Kit	Thermo Scientific	12183018A
Anti-Fibronectin-EDA Antibody	Sigma	F6140	1:200 Diluted in  3% normal goat serum
Anti-alpha smooth muscle actin Antibody	Sigma	A2547 or C6198 (cy3 conjugated)	1:200 Diluted in 3% normal goat serum
Permafluor	Thermo Scientific	TA-030-FM
DAPI	Invitrogen	P36931
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Invitrogen	62-6520	1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)
Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP	Thermo Scientific	PA1-85999	1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3	Jackson Immuno Research	115-165-146	1:200 Diluted in  3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)
Zeiss Axioplan2	Zeiss		Microscope
SPOT-2	Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan		CCD camera