创面愈合研究的前活体角膜器官培养模型

摘要

介绍了一种适用于伤口愈合研究的体外角膜器官培养模型的方案。该模型系统可用于评估药物在有组织的3d 多细胞环境中促进再生愈合或药物毒性的效果。

摘要

角膜已被广泛用作研究伤口愈合的模型系统。在二维 (2d) 和三维培养中产生和利用原代哺乳动物细胞的能力, 不仅产生了大量关于角膜生物学的信息, 而且还产生了大量关于伤口愈合、肌成纤维细胞生物学和一般疤痕的信息。.该方案的目标是一个检测系统, 用于定量肌成纤维细胞的发展, 其特点是疤痕。我们展示了一个角膜器官培养的体外模型使用猪眼。在这个前角膜切除术伤口, 角膜仍然在地球上受伤的圆形刀片称为树状。大约 1, 1 的角膜前部的塞子被切除, 包括上皮, 基底膜, 和前部的间质。受伤后, 角膜从地球上被切割, 安装在胶原蛋白基地, 并在补充血清游离培养基中培养两周, 并具有稳定的维生素 c, 以增加细胞增殖和细胞外基质分泌的居住性成纤维细胞。肌成纤维细胞在角膜愈合中的激活是明显的。该模型可用于检测创面闭合、肌成纤维细胞和纤维化标志物的发育以及毒理学研究。此外, 小分子抑制剂以及脂介导的 sirna 转染对基因敲除的影响可以在该系统中进行测试。

引言

由于受伤、外伤或感染而导致的角膜损伤会导致虚弱的不平衡和永久性视力下降。因此, 迫切需要确定可针对治疗干预的途径。目前的治疗选择有限, 主要包括角膜移植, 世界各地的病人都无法获得角膜移植。人 (图 1) 和动物角膜都可用于2d 和3d 细胞培养研究^1,2。不适合移植的人体尸体角膜可以从眼库或中央组织库 (国家疾病研究相互交流 (ndri)) 获得, 动物眼睛可以从屠宰场获得。原代角膜上皮细胞、基质成纤维细胞以及最近的内皮细胞, 可以从这些组织中分离和培养, 用于伤口愈合和毒理学^{研究 3,4,5}。除了了解致盲眼病的分子基础、组织的可获得性和培养原代细胞的能力外, 角膜也是重要的研究模型系统。角膜是理想的测试剂对疤痕的影响, 因为正常角膜是透明的, 某些类型的伤口造成不透明或纤维化疤痕 (^{回顾在 6})。几种体内角膜伤口愈合模型也被广泛用于疤痕研究¹。利用较少的是体外角膜伤口愈合模型^7,8 , 这里详细描述。该方法的目的是量化在三维多细胞角膜外模型系统中由纤维化的制造商所特有的疤痕结局。

角膜上皮伤, 不违反上皮基底膜通常关闭在 24-72 h⁹。受伤后不久, 上皮边缘的细胞开始扩散并迁移到上皮自由表面, 以重建上皮屏障功能。这一活动随后依次激活角膜基底细胞增殖, 并在稍后阶段, 前驱细胞位于外缘膜区, 以实现上皮细胞质量^的恢复 10^,11.这些伤口往往愈合而没有疤痕。然而, 穿透基底膜进入间质的伤口往往会导致疤痕形成¹。角膜间质损伤后, 间质由多个来源的细胞组成, 包括分化的常驻间质细胞以及骨髓源性纤维^{细胞 12,13},¹⁴。纤维化疤痕的特点是肌成纤维细胞在愈合伤口的持久性。这些病理性肌成纤维细胞表现出增加的粘附通过整合整合在局灶性粘连, 收缩α-平滑肌肌动蛋白 (α-sma) 应力纤维, 并局部激活细胞外基质 (ecm) 隔离后期转化的生长因子-β (tgfβ)。上皮细胞的分化, 称为上皮间充质转变 (emt), 也可能有助于瘢痕的形成 6.

细胞分化和损伤后细胞凋亡之间存在微妙的平衡。由于基底膜的断裂, 生长因子, 如血小板衍生生长因子 (pdgf) 和 tgfβ的生长因子, 如血小板衍生生长因子 (pdgf) 和 tgfβ, 由于眼泪和上皮沐浴的间质, 诱导肌成纤维细胞分化, 一个持续的自体循环 tgfβ, 和分泌不组织的纤维化 ecm^15,16。肌成纤维细胞在愈合的伤口中的持续存在会促进角膜的雾霾和疤痕 (图 2)。然而, 在再生愈合的伤口, 虽然肌成纤维细胞的发展, 他们凋亡, 因此是缺席或明显减少的数量在愈合的组织 (回顾在参考^6,10)。因此, 对纤维化疤痕的研究至少在一定程度上集中在靶向分子上, 以防止肌成纤维细胞过度发育或肌成纤维细胞持久性^17,18。由于肌成纤维细胞的持久性在所有组织¹⁹中都有疤痕和纤维化疾病的特点, 角膜可能是研究纤维化的一般细胞机制的模型系统。

在我们的模型系统中, 角膜在地球上的时候被一个称为树状的圆柱形刀片击伤。人和猪角膜可以用6或7毫米的头孢菌伤;对于兔角膜是首选6毫米树状。猪角膜的大小与人角膜相似。因为猪角膜具有成本效益, 而且数量广泛, 因此通常用于器官培养。此外, 与人发生反应的抗体和 sirna 一直与猪⁷交叉反应。伤人后, 角膜被切割出地球与石灰完整, 并安装在琼脂胶原蛋白基地。角膜在无血清介质中培养, 并加入稳定的维生素 c, 以模拟成纤维细胞增殖和 ecm 沉积²⁰。诱导肌成纤维细胞形成均不需要血清的添加和生长因子^.在经过两周的培养后, 角膜定期固定和处理组织学。对于基因敲除, 或测试药物对伤口愈合的影响, 伤口可在伤后用 sirna 治疗, 伤后7人, 或可在培养基中添加可溶性剂, 分别^{为 8}。

研究方案

1. 器官文化

1. 准备
   1. 准备琼脂解决方案, 如下所示。在一个小烧瓶中, 在 dmem-f12 中制备1% 琼脂和 1 mgml 牛胶原蛋白, 最高可达20毫升。在热盘上煮沸。将溶液放入50毫升的锥形管中。将管子放在热水澡中的热板上, 以防止溶液凝固。
   2. 根据材料表中提供的成分准备补充的无血清介质 (ssfm)。
      请注意:要准备的 ssfm 的必要数量取决于要处理的角膜数量。通常30毫升是足够的4角膜的介质。
2. 夹层
   请注意:在解剖罩或化学罩中执行此步骤。眼睛上装着仍然贴在单独袋子里的盖子, 以保护球体。
   1. 在乙醇清洗的切菜板上使用直边手术刀片去除盖子上的球体。使用刀片或小剪刀从眼睛中取出多余的脂肪组织 (图 3 a, 3A)。
   2. 从盖子上取下地球后, 用钳子向后固定地球, 并立即将眼睛浸入磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中。快速将其浸入10% 碘的 3倍 (100 毫升烧杯)。在 pbs 中快速下降 2倍 (在烧杯中约100毫升, 频繁更换 pbs)。
   3. 使用干净的毛巾或组织, 用足够的压力环视包裹眼睛, 使角膜表面紧绷, 以便用皮下平切割。
      注: 注意防止毛巾或组织接触角膜。
3. 伤
   1. 使用6毫米的树状水缠绕角膜的中心。穿透上皮和前间质, 而不使整个角膜完全厚度的伤口。
      请注意:如果内皮被穿透, 将看到压力损失和泄漏液体。在这种情况下, 眼睛应该丢弃。
   2. 将树状液放置在角膜中心, 顺时针旋转180°和逆时针旋转 5倍 (每次方向改变时, 它将计入一次), 同时施加光压加深伤口。
      请注意:伤口现在应该足够深, 可以用一对钳子解除组织瓣。如果不是这种情况, 请重复步骤1.3.2。
   3. 从边缘提起皮瓣。同时, 无论是与另一只手或与第二个人, 使用刀片, 切割平行于地球, 以切断组织, 因为钳子继续解除前角膜在伤口边缘。在这一步结束时, 角膜中心应该有一个圆形伤口 (见图 3c, 3C)。
4. 从地球上切割和去除角膜
   1. 用纸巾抱着眼睛, 用刀片在离角膜边缘1毫米远的地方做一个小切口, 这样, 利姆布就包括在器官培养中。
   2. 使用小的, 尖锐的剪刀进入在前一步创建的切口切割全球, 保持毫米边缘整个角膜, 以保持石灰完整。
   3. 将角膜放入60毫米的盘子中, 带1毫升的 pbs, 伤口侧向下, 直到安装。
5. 安装
   1. 确保琼脂的温度达到了温暖 (约 25°c)。
   2. 用两对钳子, 通过将角膜的两侧与内皮侧向上固定, 创建一个杯。使用无菌转移移液器将加热后的琼脂溶液加入角膜, 直到其充满。
   3. 琼脂变硬 (通常约 30-45秒) 后, 用琼脂小心地将角膜翻转成60毫米板 (图 3e)。盖上盖子。
6. 孵化
   1. 在板上加入4毫升 ssfm, 在37°c 的情况下, 在 5% co2 的角膜缘保持角膜.24小时后刷新媒体, 此后每隔一天刷新一次。
      请注意:如果对伤口进行转染, 在转染后省略抗生素。
   2. 每天将角膜表面弄湿一次, 在盘子中的调理介质中加入1滴 ssfm, 以保持水分。为此, 将盘子从孵化器中取出, 放置在引擎盖下, 取出盘子盖, 用无菌移液器从盘子中用介质弄湿表面, 再次盖上盖子, 放回孵化器。
   3. 对于基因敲除, 请按照供应商的指示 (见下文), 用基因靶向或控制 sirna 来治疗伤口, sirna 与脂质介导的载体相复合 (见下文)。
   4. 将 5μl (50 pmol) sirna 混合到50μl 的血清最低必要培养基 (例如, opti-mem) 中。将转染试剂的2μl 混合到50μl 的降血血清培养基中。让这个坐 5分钟, 然后混合它们。
   5. 在 reagents/sirna 混合物中加入200μl 的降血最低培养基。
   6. 移液器滴在伤口上, 孵育3小时。
   7. 用盘子里的介质从角膜表面洗出 sirna。将培养介质更改为 ssfm + 抗生素 (请参阅材料表)。如前所述 (步骤 1.6.1-1.6.2) 继续孵育。

2. 组织学: 石蜡切片和免疫染色

1. 准备组织
   1. 经过两周的培养, 如果使用部分组织进行定量实时聚合酶链反应 (qrt-pcr) 分析, 在固定之前, 通过伤口将角膜切割成一半。将这一半或只有---------------------------------------------------------------
   2. 使用标准的隔离试剂盒, 分离 rna 并执行 qrt-pcr。
      请注意:或者, 受伤的部分只能被分离并进行基因表达测试。
   3. 将角膜的另一半放入组织病理盒, 并在室温下 (rt) 下 2天 (10% 福尔拉林) 淹没在固定剂中2-4。
   4. 石蜡用标准技术嵌入了这一半的角膜受伤。
      请注意:将受伤的角膜定向, 以确保组织切片将产生角膜的横截面。
2. 使用 3, 3 '-二氨基苯并嗪 (dab) 进行免疫保存
   1. 第1天
      1. 使用铅笔正确地标记幻灯片。将滑块放入带清除剂的罐子中, 使组织脱焦 (2个变化, 每次 10分钟)。
      2. 通过将滑块转移到乙醇中, 以降低浓度 (100%、100%、70%、50%、dh 2o、dh₂o, 每次变化5分钟) 将组织补充水分。
      3. 用柠檬酸缓冲液 (10 mm, ph 6.4) 在塑料罐中对幻灯片进行5分钟的抗原回收。第一周期 5分钟, 50% 的功率。用柠檬酸缓冲液填充罐子, 然后重复。冷却10分钟。
      4. 用 pbs 清洗 3倍, 每次2分钟。在 rt. 块切片中, 用 1% triton x-100 在 rt 块切片中, 在湿腔用3% 的正常山羊血清 (ngs) 进行1小时的渗透。
      5. 在 4°c (每张幻灯片 300μl) 下, 用原生抗体 (1:100 或供应商建议) 隔夜在3% 的 ngs 中培养组织。
   2. 第2天
      1. 用 pbst (pbs 加 1% tween 20) 冲洗幻灯片 3x, 每次2分钟。将滑块放入 3% h2o2 10分钟, 以阻断内源性过氧化物酶.用 pbst 清洗 3倍, 每次2分钟。用 hrp 二级抗体 (1:250) 在3% 的 ngs 中培养部分, 在 rt (每张幻灯片 300μl) 下1小时。
      2. 清洗幻灯片 3x pbst, 每张2分钟。使用 dab 工具包处理幻灯片。加入 300μl/幻灯片 3分钟, 用 dh 2x 2x(快速浸渍) 清洗幻灯片。
      3. 用血红素进行20次染色, 用 dh2o2x (快速浸渍) 清洗幻灯片。用蓝剂染色 20秒, 用 dh2o_{冲洗 20秒}, 通过将滑块放入不断增加的乙醇浓度 (50%、70%、100%、100%, 所有快速浸渍) 中脱水组织。
      4. 在引擎盖下的纸巾上擦干滑块10-20。
      5. 使用1滴安装介质安装幻灯片, 盖上盖板。在 rt 标签和存储。
      6. 在显微镜下对幻灯片进行成像, 并使用 imagej7^量化dab 信号 (见第4节)。
3. 免疫染色: 荧光
   1. 第1天, 请按照步骤2.2.1 中描述的步骤进行操作。在第2天执行以下步骤。
   2. 在 pbst 中冲洗 3 x, 每次2分钟。在3% 的 ngs (1:200) 中用荧光标记的二级抗体培养一段, 在 rt 中培养1小时。
   3. 在 pbst 中清洗 3倍, 每次2分钟。使用1滴 4 ', 6-二胺-2-苯丙二醇 (dapi) 安装介质和盖板覆盖。在引擎盖下擦干纸巾 30分钟, 在4°c 的黑暗中储存, 直到荧光成像。
4. 使用图像 j 进行量化
   1. 下载 imagej 的 "斐济" 版本, 其中包括 dab 染色定量所需的插件。
   2. 在斐济中打开图像, 然后选择"图像→颜色→颜色反褶积"。
   3. 选择 "h dab" 作为污渍, 然后单击 "确定"。将出现三个新图像。选择仅包含 dab 染色的图像。
   4. 要只量化间质染色, 请使用 imagej 橡皮擦功能从 dab 图像中去除上皮。
   5. 选择"分析" → "测量" (或 ctrl + m) 并记录值。

结果

免疫组织化学是分析体外创面愈合实验成功的主要方法。图 4显示对照组织中的上皮和前间质 (图 4a, 4A)。受伤6小时后, 上皮无 (图 4c, 4C)。如预期的伤势后六天, 上皮已重新生长 (图 4e, 4E)。该组织对α-平滑肌肌动蛋白 (α-sma) 进行免疫抑制, 其表达...

讨论

该协议描述了一个模型, 用于研究在自然分层三维环境中的伤口愈合。使用器官培养作为细胞培养和体内研究之间的中间体, 大大降低了成本, 也减少了活体动物的程序。其他3d 模型对该领域有很大的好处, 包括由原代人类角膜成纤维细胞 2^或这些相同的细胞嵌入在由动物衍生胶原蛋白31制成的凝胶中的自合成胶原蛋白凝胶^.器官培养模型系统对于测试假定的治疗剂...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Gibco	10-010-023
Pen Strep	MP Biomedicals	91670049
Bovine Collagen Solution	Advance Biomatrix	5005
Pig eyes with lids attached	Pel-freeze, Arkansas	N/A
6.0 mm trephine	Katena	K28014
Surgical Blade	Personna	0.009
Small scissor	Fisher	895110
Forceps	Fisher	08953-F
Kim Wipes	Kimberly-Clark™ 34120	06-666
60 mm cell culture dishes	Falcon	08-772B
Supplemented Serum- Free media (SSFM)			Add all of the following components to DMEM/F-12:  ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C.
DMEM/F-12	Gibco	11330
ITS Liquid Media Supplement	Sigma	I3146	100X
RPMI 1640 Vitamins Solution	Sigma	R7256	100X
Glutathione	Sigma	G6013	Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.
1% L-glutamine solution	Gibco	25030-081	100X
MEM Non-essential amino acids solution	Gibco	11140	100X
MEM Sodium pyruvate solution	Gibco	11360	1 M Stocks (1000X) and freeze in single use aliquits.  Use from freezer each time media is made.
ABAM	Sigma	A7292	100X
Gentamicin	Sigma	30-005-CR	200X
Vitamin C	Wako	070-0483	2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)
10% Iodine	Fisher Chemical	SI86-1
Tissue Path Cassettes	Fisher	22-272416
Normal Goat Serum (NGS)	Jackson Immuno Research	005-000-121	We use 3% NGS
Mounting Media	Thermo Scientific	TA-030-FM
Safe Clear	Fisher	314-629
Ethyl Alcohol	Ultra Pure	200CSGP	200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%)
Sodium citrate	Fisher	BP327	10mM, pH 6.4
Hematoxylin	EMD Millipore	M10742500
Bluing agent	Ricca Chemical Company	220-106
1% Triton X-100	Fisher	9002-93-1	Diluted in PBS
0.1% Tween 20	Fisher	BP337	Diluted in PBS
3% Hydrogen Peroxide	Fisher	H324
DAB Kit	Vector Laboratories	SK-4100
Agar	Fisher	BP1423-500	Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL
Parafilm	Bermis	13-374-12
Moist Chamber			Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.
Lipofectamine 2000
Qiagen RNAprotect Cell Reagent	Qiagen	76104
Ambion PureLink RNA Mini Kit	Thermo Scientific	12183018A
Anti-Fibronectin-EDA Antibody	Sigma	F6140	1:200 Diluted in  3% normal goat serum
Anti-alpha smooth muscle actin Antibody	Sigma	A2547 or C6198 (cy3 conjugated)	1:200 Diluted in 3% normal goat serum
Permafluor	Thermo Scientific	TA-030-FM
DAPI	Invitrogen	P36931
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Invitrogen	62-6520	1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)
Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP	Thermo Scientific	PA1-85999	1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3	Jackson Immuno Research	115-165-146	1:200 Diluted in  3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)
Zeiss Axioplan2	Zeiss		Microscope
SPOT-2	Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan		CCD camera