تطوير واستخدام Angiographic من طراز VX2 أرنب لسرطان الكبد

Summary

والهدف من هذه المادة توفير تمهيدي لتطوير واستخدام نموذج أرنب سرطان VX2 لسرطان الكبد.

Abstract

ورم VX2 الأرنب نموذج حيوانية المستخدمة عادة للبحوث متعدية الجنسيات فيما يتعلق بسرطانه الخلية الكبدية (HCC) في مجال "الأشعة التداخلية". ويستخدم هذا النموذج المتحولة الخلايا الحرشفية التي يتم نشرها بسهولة وبشكل موثوق في العضلات الهيكلية من الأرانب المانحة لزرع الحصاد و allograft في نهاية المطاف في الكبد من السذاجة المستلمين. سرعة ينمو هذا الاختلاس الورم داخل كبد الأرانب المتلقية في ورم أنجيوجرافيكالي شخصية تتميز بنواة نخرية محاطة بكبسولة هايبرفاسكولار قابلة للحياة. الحجم الفعلي لتشريح الأرنب غير كافية لتيسير الأجهزة والأوعية الدموية يسمح بتطبيق واختبار مختلف التقنيات التداخلية. وعلى الرغم من هذه الفوائد، هناك ندرة في الموارد التقنية بمثابة إشارة ملموسة للباحثين العاملين مع النموذج. وهنا، نقدم مخطط بصرية شاملة للجوانب التقنية للتنمية والنمو، ونشر، واستخدام angiographic من طراز الورم VX2 أرنب للاستخدام من قبل المبتدئين والباحثين ذوي الخبرة على حد سواء.

Introduction

نموذج الورم VX2 أرنب لعبت دوراً في علاج الأورام التجريبية منذ تطويره في عام 1935^1،2. هذا الورم هو التي يسببها فيروس المتحولة الخلايا الحرشفية تتميز هايبرفاسكولاريتي، والنمو السريع، ونشر سهلة في الهيكل العظمى والعضلات^3،4. وفي حين استخدمت نموذج الورم الأرنب VX2 للتحقيق في عدد كبير من أنواع السرطان^5،6،،من⁷⁸؛ تركز هذه الورقة هو سرطان الكبد⁹.

وغرض الأسلوب الموصوفة هو تقديم نموذج لسرطان الكبد الأولية، أو سرطانه الخلية الكبدية (HCC)، التي يمكن أن يستخدمها "الأشعة التداخلية" للبحوث متعدية الجنسيات. يمكن استخدامه لدراسات الحرائك الدوائية والعلاجية التحقيقات والجر أسلوب اختبار^10،11،،من^1213،،من¹⁴¹⁵.

الطريقة بالتفصيل هنا غلة مزايا متعددة على نماذج أخرى داخل نفس المجال مثل نماذج القوارض مثل الفئران، الفئران، ووودتشوكس، أو نماذج أكبر مثل الرئيسات¹⁶. إحدى الفوائد الرئيسية هي نمو الورم السريع والموثوق بها التي يسمح للباحثين بإنشاء خط ورم نشط في غضون شهر من أطرافهم هند أول نشر¹⁷. بالإضافة إلى ذلك، يحتوي هذا الورم واضحة الرؤية سونوجرافيك وهامش هايبرفاسكولار الذي يسمح لكل من ترانسارتيريال لوكوريجيونال العلاجات والعلاجات الجر. وأخيراً، والأهم من ذلك، يسمح حجم المفرج أرنب استخدام مجدية وسهلة من الناحية التقنية للأجهزة والأوعية الدموية¹⁸.

Protocol

ويتبع البروتوكول التالي جميع المتطلبات والمبادئ التوجيهية التي أقرتها جامعة إلينوي-شيكاغو. أنه تم استعراض وموافقة المحلية رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة قبل التنفيذ.

1-VX2 أطرافهم هند الورم التنمية

1. شراء خط خلية الورم VX2 من الوطنية سرطان معهد شعبة لتشخيص مرض السرطان العلاج وعلاج الورم/الخلية خط المستودع.
   ملاحظة: في هذا الوقت، يمكن العثور على كتالوج النظام على الرابط التالي: https://dtp.cancer.gov/repositories/.
2. إعداد تعليق خلية للحقن، ضع المتوسطة العينة و methylcellulose VX2 المجمدة في ماء فاتر حتى أنها قد تحسنت.
   1. نضح مل 0.5\u20121 من تعليق خلية المذابة وحجم متساوية من المتوسطة methylcellulose المذابة في محقن 5 مل.
      ملاحظة: قد يساعد استخدام إبرة ز 21 أو 22 لنضح تعليق خلية وابرة قياس أكبر لنضح المتوسطة methylcellulose. ضع الحقن على الجليد.
3. تعد الجهة المانحة الورم أطرافهم هند أرنب لتطعيم تعليق خلية، بدءاً بالتخدير باستخدام أسيبرومازيني 1 مغ/كغ والبوبرينورفين 0.02 مغ/كغ تعطي عضليا. يحلق في موقع التلقيح (أطرافهم هند) مع لوس أنجليس كليبرز ونظيفة حلق مع وكيل القائم على الكحول أو اليود.
   ملاحظة: ميلوكسيكام يمكن أن تعطي بجرعة مقدارها 0.2 مغ/كغ تحت الجلد للتسكين. فرو أرنب من الصعب أن يحلق. من المستحسن أن الباحث بأداء مسارات متعددة، تركز أولاً على إزالة الجزء الأكبر من الفراء ثم الضغط على لوس أنجليس كليبرز ضد الجلد وتسير ضد التيار.
4. إرفاق إبرة ز 16 حقنه 5 مل تحتوي على تعليق خلية وحقن 1 مل التعليق في بطن العضلات أطرافهم هند الأرنب المانحين، تقريبا 1 سم عمق. من المؤكد أن حراسة العصب الوركي قيد التشغيل ضمن أخدود واضح على طول عظم الفخذ.
   ملاحظة: إينوكولاتيس VX2 جديدة بنجاح 88% من المواضيع حين VX2 المجمدة والمذابة فقط نجاح 33% من الساعة¹⁹.
   تنبيه: الورم VX2 سوف تنمو بسرعة. الآثار الجانبية التي قد لاحظت كما تقدم الورم: زيادة معدل التنفس والخمول وانخفاض اليقظة، التغيرات السلوكية (مثلاً، العدوانية غير عادية). ونتيجة لذلك، هي توصيات لمراقبة الحيوانات عن كثب والتخطيط للحصاد ورم في غضون أسبوعين بعد التلقيح.

2-VX2 أطرافهم هند نمو الورم والحصاد

ملاحظة: افتراض تلقيح ناجحة، يجب أن يكون هناك ملموس العقيدات الورم (3\u20124 سم) في موقع الحقن في غضون أسابيع 2. عادة، هذه العقيدات سيكون ملموسا حوالي أسبوع. ومع ذلك، فمن الأفضل السماح للورم ينمو للسماح لجمع الأنسجة كافية. عادة، تكون هذه العقيدات مرتفعة فوق مستوى عضلة مدورة والراسخ. إذا كان

1. جس منطقة الملقحين في 2 أسابيع من التطعيم. إذا تم الكشف عن أي نمو الورم في 2 أسابيع، تنفيذ الخطوة 1 مرة أخرى. انظر الشكل 1.
   ملاحظة: وجود ورم يمكن أيضا تقييم عبر الموجات فوق الصوتية. بينما كانت هناك أي دراسات لتقييم الفرق في مقاييس نمو الورم عند نشرها من الأوراق المالية المجمدة بالمقارنة مع الأسهم الطازجة، لقد كانت تجربتنا أن ينمو الورم الأرصدة المجمدة أبطأ قليلاً وسيتم كشفها بعد مخزونها الطازجة إطار مكافحة. بغض النظر، أما الأسلوب ينبغي أن تسفر عن وجود ورم يمكن قبل أسبوعين.
2. تعد الجهة المانحة الورم أطرافهم هند للحصاد الورم. تخدير الأرنب مع xylazine الكيتامين و 5 ملغ/كغ 45 مغ/كغ. Euthanize بجرعة (رابعا) عن طريق الحقن الوريدي من الصوديوم بينتوباربيتال تتجاوز 390 ملغ/كغ.
3. بمجرد قد تم euthanized الأرنب، يبدأ الحصاد الورم عن طريق إزالة الأنسجة الجلدية وتحت الجلد التي تغمر العقيدات الورم باستخدام مشرط مع بليد حجم أيهما تراه مناسباً الباحث. انظر الشكل 2.
4. مرة واحدة وقد تم تحديد العقيدات الورم داخل العضلات أطرافهم هند، إزالة الورم كتلة باستخدام هوامش واسعة المنحنية الخطوط. لذلك، خفض النقاط مرفق تيندينوس في نهايات الدانية والبعيدة العضلات ومن ثم تتبع شفرة المبضع على طول العظم الأساسي. تقسم العينة اكسبلانتيد تعريض الورم الكبسولة وكور نخرية. انظر الشكل 3.
   ملاحظة: قد الورم VX2 نواة نخرية عالية. تأكد من استخدام حماية العين السليمة وغيرها من معدات الحماية الشخصية عند الحصاد الورم، حيث يمكن أن يؤدي إلى أي ضرر يلحق بالكبسولة الورم في إخراج الضغط العالي من الحطام نخرية.
5. بلطف كشط الأساسية نخرية مع أداة غير حادة (مثل الملقط، هيموستاتس) لتنظيف الورم. يجب أن يسمح هذا لتصور أفضل من الكبسولة الورم ونقطة التحول بين الكبسولة والعضلات المحيطة بها. انظر الشكل 4.
6. من هذه العينة، حصاد عدة قطع من ورم 1\u20122 مم تقريبا³ وتخزينها مباشرة في كوب يحتوي على درجة حرارة الغرفة عقيمة المالحة.
   ملاحظة: سيتم استخدام هذه العينات الورم لغرس أحياناً اللاحقة.
7. مكان الورم المتبقية في طبق بتري معقم ويستحم فإنه مع المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو). إذا كان يتم الاحتفاظ هذه العينة الباردة على الجليد، أنه يمكن الحفاظ على التعامل مع ما يصل إلى 2\u20123 ح في وقت لاحق.

3. زرع الورم الكبد عن طريق فتح البطن

1. إعداد الأرنب المتلقية لفتح البطن. تخدير الأرنب المستلم باستخدام الكيتامين 45 مغ/كغ وإكسيلازيني 5 ملغ/كغ لتحريض تليها تنبيب والصيانة مع % 1-إيسوفلوراني 3% كاللازمة. عندما يتم تخديره الأرنب، يحلق الموقع الجراحي باستخدام مقص الشعر. تنظيف منطقة شق استخدام الغسيل ثلاث مع فرك تدين والحل الإيثانول 70% وحل تدين ومن ثني البطن بطريقة جراحية معقمة.
2. استخدام #15-شفرة، الشروع في فتح البطن بإجراء شق عمودي إلى أسفل خط الوسط صغيرة عن طريق الجلد أرنب بدءاً من عملية الرهابه. هذا ينبغي أن يكون جس بسهولة ويميل إلى أن يكون تقريبا حجم بيني الأمريكية. انظر الشكل 5.
3. يعكس الجلد والتعرف لينيا ألبا. وينبغي أن تعكس عصابة بيضاء من الأنسجة السفر إينفيريورلي في خط الوسط. استخدم تشريح صريحا لاجتياز لينيا ألبا وفضح الصفاق. انظر الشكل 6.
   ملاحظة: الصفاق يتم التعرف عليها بسهولة نظراً لأنها سوف تكون مباشرة تغمر الأمعاء، التي يمكن رؤيتها تتحرك مع التنفس.
   تنبيه: الصفاق تميل إلى أن تكون ملتصقة بالامعاء الكامنة بسبب التوتر السطحي. استخدام صدمات حادة إلى تشريح لينيا ألبا يساعد على تبديد خطر تثقيب الأمعاء الكامنة.
4. حالما يتم كشفها الصفاق، تشريح بعناية من خلال دخول التجويف الصفاقى. ويمكن الآن تحديد الكبد. لتحسين التنقل الفضاء البطن، تمديد سم 1\u20122 شق خط الوسط إينفيريورلي عن طريق الجلد والعضلات، والصفاق.
   ملاحظة: تمديد شق خط الوسط يمكن بسهولة وأمان القيام به عن طريق إدراج بعناية هيموستات منحنية في الفضاء البريتوني مع طرف منحنى تواجه ظاهرياً نحو الصفاق. ثم افتح هيموستات قليلاً واستخدام شفرة للطيف الأنسجة بين اثنين من الأسلحة هيموستات.
5. تحديد الفص الأيسر من الكبد من أجل تحديد موقع لغرس الورم. الفص الأيسر إينفيرو الجانبية للفص الآنسي الذي يجلس في خط الوسط.
6. قبل محاولة لرسم الكبد نفاد مساحة البريتوني، ضع قطعة جافة من الشاش في الجانب السفلي من الشق.
   ملاحظة: سوف توفر الشاش سطح ملتصقة على إرساء الكبد لمنعها من التراجع إلى الوراء في البطن.
7. استخدام الملقط أتروماتيك أو قطعة من الشاش الرطب على الأصابع، رسم الفص الأيسر من الكبد من البطن من خلال الشق بعناية والاستلقاء على شاش الجافة التي وضعت في وقت سابق. انظر الشكل 7.
   تنبيه: الكبسولة الكبد حساسة ويمكن بسهولة تمزق. من المهم أن يكون لطيف عند التعامل مع هذا الجهاز لمنع التسييل الحافظة وكدمات الكبد، و/أو هيموبيريتونيوم في نهاية المطاف.
   ملاحظة: عادة، الكبد وسوف تعلن نفسها بصريا عند دخول الفضاء البريتوني؛ ومع ذلك، إذا كان يتم منتفخة المعدة للأرنب، الكبد يمكن أن يدفع cranially بعيداً عن الأنظار. إذا كان هذا هو الحال، بلطف رفع جدار البطن باستخدام مجس كليلة. في هذا السيناريو، الكبد يميل إلى الانضمام إلى الجانب البطني للحجاب الحاجز بسبب التوتر السطحي بعناية منفصلة في الكبد باستخدام مجس كليلة وأنه ينبغي فصل. ثم استخدم الملقط أتروماتيك لاستخلاص الكبد.
8. عند هذه النقطة، يعد ورم الأنسجة لغرس وضع قطعة من الشاش الرطب على الكبد لحمايتها.
9. حدد قطعة 1\u20122³ مم من ورم الأنسجة التي تم إنشاؤها أثناء الخطوة 2.6 لغرس في الكبد. انظر الشكل 8.
10. استخدام #11-شفرة، ثقب في أنسجة الكبد بزاوية 45 درجة مما يجعل جيب عميق 0.5 سم، مع الحرص على عدم اختراق الجانب الظهرية الكبسولة الكبد. ترك بليد في المكان بعد الثقب. انظر الشكل 9.
11. أرفع الشفرة برفق في اتجاه البطني لخلق جيب صغير في السرير الكبد. تأخذ قطعة الورم باستخدام الملقط، ضع قطعة ورم في هذا الجيب ثم قم بإزالة الشفرة.
    ملاحظة: يمكن إزالة الشفرة قبل إدراج قطعة الورم، بيد سوف تنزف الكبد وهذا يمكن أن يحجب موقع الثقب مما يجعل من الصعب تحديد.
    تنبيه: تأكد من تقليل الاتصال للورم مع أي هياكل أخرى لمنع بذر الورم غير مقصود. يمكن تجنب هذا أيضا بتخصيص أي أدوات تستخدم للمساعدة في غرس بعد ذلك.
12. عند هذه النقطة، ضع قطعة من عامل مرقئ, مثل هلام الرغوة، على جيب الورم لتعزيز الأرقاء ومنع قذف قطعة الورم.
13. عودة الكبد إلى البطن، مجرد تأكيد الأرقاء.
14. إغلاق جدار البطن مع 3-0 خياطة بوليديوكسانوني في إبرة تفتق بسيط مستمر باستخدام الإبرة وإغلاق الجلد بخياطة الجروح 910 بوليجلاكتين 4-0 في إبرة قطع استخدام غرزة سوبكوتيكولار المستمر.
    تنبيه: عند إغلاق جدار البطن، رعاية لا للتلف في الثرب أو غيرها من الهياكل الأمعاء في رمي خياطة الجروح.
    ملاحظة: بينما سيستغرق هذا الورم يمكن التعرف عليها نهائياً راديوجرافيكالي ما لا يقل عن 2 أسابيع، فإنه يصل حجم قطره سم 1.5\u20122 في 3 أسابيع نمو. احرص على عدم السماح للورم الكبدي تنمو 3.5\u20124 الأسابيع الماضية حيث ستشكل الورم اكسوفيتيك انتشار الدمار وقوة محلياً.

4-VX2 الورم إعداد تعليق

1. وضع مصفاة 40 ميكرومتر في مصب أنبوب 50 مل البروبيلين مخروطية الشكل. استخدام الورم من الخطوة 2.7، استخدام #15-شفرة كشط سطح الورم لجمع الورم قابلة للبقاء ووضع هذه الكشاطه إلى المصفاة.
2. أغسل كشاطه الورم قابلة للتطبيق من خلال مصفاة استخدام دميم وثم الطرد المركزي الأنبوب البروبيلين 1600 لفة في الدقيقة لمدة 8 دقائق.
3. بعد اكتمال أجهزة الطرد المركزي إزالة المادة طافية وتجاهل ذلك. قم بإضافة ميثيلسيلولوسي إلى كتلة الخلايا المتبقية بنسبة حجمية 1:1.
4. حقن هذا التعليق في أرنب مانحة أطرافهم هند بعد 1.3\u20121.4 الخطوات. ضع تعليق المتبقية إلى مختبرين 1 مل في الأنابيب المبردة وتجميدها في نيتروجين سائل لاستخدامها في وقت لاحق.

5-أنجيوجرافيك استخدام VX2 ورم في الكبد

1. إعداد الأرنب كما هو موضح في الخطوة 3، 1.
2. جس الاخدود الفخذ في الفخذ. عندما تم التعرف على الاخدود، جعل شق خطية سم 2\u20123 على طول الاخدود. انظر الشكل 10.
3. استخدام تشريح كليلة، تحديد وعزل فخذي الحزمة التي تحتوي على فخذي الوريد والشريان والعصب. انظر الشكل 11.
4. مرة أخرى، استخدام تشريح غير حادة لفصل شريان فخذي من بقية الهياكل في الرزمة وعزل الشريان فوق مقبض مشرط. انظر الشكل 12.
5. مع مجموعة مقدم 3-الفرنسية، الاستفادة من تقنية Seldinger للوصول بإبرة. أدخل جويديويري وإزالة الإبرة للنهوض غمد 3-الفرنسية إلى السفينة. انظر الشكل 13.
   تحذير: تجنب استخدام القوة المفرطة في النهوض غمد 3-الفرنسية، كما يمكن أن ينتج عن هذا ترانسيكشن شريان فخذي.
6. تحت إرشاد الفلوري واستخدام القسطرة، جويديويري، وعامل تباين iohexol، حدد الجذع الزلاقي – يقع عادة على مستوى T12 – وثم تقدم القسطرة في الشريان الكبدي الأيسر عبر المشتركة الكبد والسليم الكبد.
7. عند هذه النقطة، إدارة وكيل للاختيار عن طريق القسطرة. بمجرد إدارته الوكيل، قم بإزالة القسطرة.
8. استخدام خياطة الحرير 3-0، سد شريان فخذي بروكسيمالي وديستالي إلى نقطة الإدراج من غمده. من المؤكد أن تشديد عقده الدانية إلى غمده كما يتم سحبه لمنع النزيف.
9. إغلاق شق الفخذ مع خياطة الجروح 910 بوليجلاكتين 4-0 في إبرة قطع استخدام غرزة سوبكوتيكولار.
10. الحفاظ على معيار الانتعاش الحيوان مراقبة والرعاية بعد العمليات الجراحية. تنفيذ القتل الرحيم ونيكروبسي حسب الحاجة باستخدام التقنيات القياسية.

النتائج

عند النظر إلى الشكل 1، فمن الواضح أن كوادريسيب الأرنب هو الموسع. بالإضافة إلى ذلك، متعددة العقيدات الصغيرة المنفصلة، ربط عادة مع نمو الورم عن طريق اللفافة، مرئية. عند ملامسة، يجب أن تظهر أطرافهم حقن من أطرافهم غير مدخلة. إذا كان باحث يتطلب تأكيد نهائي أكثر...

Discussion

الخطوة الأولى الحاسمة في منهجية الورم VX2 نشر ناجحة لورم في أطرافهم هند أرنب المانحين. الرجوع إلى الفقرة الأولى في المقطع "النتائج ممثلة" لمزيد من المعلومات بشأن هذه الخطوة.

الخطوة الحاسمة التالية، هو ضمان أن الكبسولة الورم قابلة للتطبيق يتم التعرف بشكل صحيح. سوف يكون هذا ضرو...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MethoCult (Methycellulose)	Stemcell Technologies	M3134
VX2 Cell Line	NCI	VX-2
5 mL Syringe	BD	309646
16 G Needle	BD	305197
22 G Needle	BD	305155
Hair Clippers	Wahl	41870-0438
Foam Insulated Box	Mr. Box Online	10 x 10 x 4
Acepromazine	Henry Schein	003845
Buprenorphine	Par	42023-179-05
Meloxicam	Henry Schein	049755
Alcohol Pads	Covidien	5033
Ketamine	Henry Schein	056344
Xylazine	Akorn	59399-110-20
Pentobarbital (Fatal-Plus)	Vortech	9373
Sterile Petri Dish	Thermo Fisher	172931
DMEM	Gibco	11965092
Saline	Baxter	2F7124
15-Blade	Steris	02-050-015
Scalpel Handle x 2	Steris	22-2381
Curved Hemostat	WPI	501288
Atraumatic Forceps	Sklar	52-5077
Gauze	Medline	NON21430LF
11-Blade	Steris	02-050-011
Surgicel	Ethicon	1951
3-0 PDS / Taper	Ethicon	Z305H
4 - 0 Vicryl / Cutting	Ethicon	J392H
40 μm strainer	BD	352340
50 mL conical tube	Thermo Fisher	339652
plastic pipette	Thomas Scientific	HS206371B
Centrifuge	Sorvall	75004240
1.40 mL Tubes (Internal Thread)	Micronic	MP32131-Z20
3-F VSI Micro-HV Introducer Kit	Vascular Solutions	Custom Order (P15180391)
.018 45° angle glidewire	Terumo	RG*GA1818SA
Direxion bern-shape microcatheter	Boston Scientific	M001195230
Omnipaque	GE	Y510