Развития и ангиографическое использование модели VX2 кролика для рака печени

Кролик VX2 опухоли является модель животных, обычно используемых для трансляционного исследования относительно гепатоцеллюлярной карциномой (HCC) в области интервенционной радиологии. Эта модель использует анапластическая плоскоклеточный рак, легко и надежно передаются в скелетных мышцах доноров кроликов для возможного урожая и аллотрансплантата имплантации в печени наивно получателей. Эта опухоль трансплантата быстро перерастает в печени получателей кроликов в ангиографически идентифицируемой опухоли, характеризуется некротические ядро, окруженный жизнеспособной гиперва капсулу. Физический размер кролика анатомии является достаточным для облегчения сосудистой инструментирования позволяет для приложения и тестирование различных лечебных методов. Несмотря на эти преимущества существует нехватка технических ресурсов в качестве конкретной ссылки для исследователей, работающих с моделью. Здесь мы представляем всеобъемлющий план визуальные для технических аспектов развития, роста, размножения и ангиографические использование кролик VX2 опухоли модели для начинающих и опытных исследователей, так.

Введение

Кролик VX2 опухоли модель играет роль в экспериментальной онкологии с момента ее разработки в 1935 году¹^,². Эта опухоль является вирус индуцированной анапластическая плоскоклеточный рак характеризуется hypervascularity, быстрый рост и легко распространение в скелетных мышцах³^,⁴. В то время как кролик VX2 опухоли модель использовалась для изучения множества рака⁵^,⁶^,^,⁷⁸; в центре внимания этого документа является рак печени⁹.

Цель метода, описанного – представить модель для первичного рака печени, или гепатоцеллюлярной карциномой (HCC), который может использоваться интервенционных радиологов для трансляционного исследования. Он может использоваться для фармакокинетические исследования, терапевтические исследования и абляционного метод тестирования¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵.

Метод, изложенных в настоящем документе дает несколько преимуществ над другими моделями в той же сфере таких грызунов модели, как крыс, мышей и сурки или больших моделей, как приматов¹⁶. Одним из основных преимуществ является быстрое и надежное опухолевого роста, который позволяет исследователям установить линию Активные опухоли в течение месяца первого задние конечности распространения¹⁷. Кроме того эта опухоль имеет простой сонографические видимости и гиперва периферии, которая позволяет для лечения локорегионарных transarterial и абляционного лечения. Наконец и самое главное размер кролика сосудистую позволяет целесообразно и технически легко использования сосудистых инструментария¹⁸.

протокол

Следующий протокол следует всех требований и руководящих принципов, утвержденных в университете штата Иллинойс - Чикаго. Он был рассмотрен и одобрен местный институциональный уход животных и использование Комитета до выполнения.

1. VX2 Задних конечностей опухоли

Закупать VX2 опухолевых клеток линии от национального института отдела от рака лечения диагноз рака и лечения опухоли/мобильные линии репозитория.
Примечание: В настоящее время, заказать каталог можно найти в следующей ссылке: https://dtp.cancer.gov/repositories/.
Подготовить суспензию клеток для инъекций, место замороженные среднего образца и метилцеллюлоза VX2 в теплой воде до тех пор, пока они растаяло.
1. Аспирационная 0.5\u20121 мл суспензии талой клеток и равным объемом талой метилцеллюлоза среды в 5-мл шприц.
  Примечание: Это может помочь использовать 21 или 22 G иглы для аспирационная суспензию клеток и больше иглы для аспирационная метилцеллюлоза среднего. Место шприцы на льду.
Подготовьте задних конечностей опухоли доноров кролик для модифицирования суспензии клеток, начиная с седативный эффект, используя acepromazine 1 мг/кг и бупренорфина 0,02 мг/кг внутримышечно с учетом. Бриться сайт прививка (задние конечности) с Клипперс и чистого побрился с агентом на основе спирт или йод.
Примечание: Мелоксикам может быть предоставлена в дозе 0,2 мг/кг подкожно анальгезии. Кролик очень трудно бриться. Рекомендуется, что исследователь выполнить несколько проходов, сначала упором на очистка основную часть мех и затем нажав Клипперс против кожи и идет вразрез с зерном.
Прикрепить 16 G иглу в шприц 5 мл, содержащего суспензию клеток и вставляют 1 мл взвеси живот мышцы задние конечности кролика доноров, примерно 1 см в глубину. Убедитесь в том охранять седалищного нерва, запущенные в паз ощутима вдоль правой бедренной кости.
Примечание: Свежие VX2 успешно прививает 88% испытуемых, в то время как замороженные и талой VX2 только успешных 33% время¹⁹.
Предупреждение: Опухоль VX2 будут расти быстро. Побочные эффекты, которые могут быть отмечены как прогрессирует опухоли являются: увеличение частоты дыхания, вялость, снижение бдительности или поведенческие изменения (например, необычная агрессивность). Следовательно рекомендации являются внимательно следить за животными и планировать опухоли урожай в течение двух недель после вакцинации.

2. VX2 Задних конечностей опухолевого роста и сбора урожая

Примечание: При условии успешной прививки, должно быть ощутима конкреций опухоли (3\u20124 см) в месте инъекции в течение 2 недель. Обычно этот конкреций будет ощутима около 1 недели; Однако лучше пусть опухоли расти для достаточно ткани коллекции. Как правило этот конкреций будет твердо и вулканизированных повышенных над уровнем данных мышц. Если

Ощупывайте области привитых на 2 недели от прививки. Если не рост опухоли обнаружены на 2 недели, снова выполните шаг 1. Смотрите Рисунок 1.
Примечание: Наличие опухоли могут также оценить через УЗИ. Хотя не было никаких исследований оценить разницу в метриках роста опухоли при наследовании из замороженных запасов по сравнению с свежие фондовой, он был наш опыт, что замороженные запасов опухоль растет чуть медленнее и будет обнаружить после его свежие фондовой борьбе с часть. Несмотря на это либо метод должен принести заготовки опухоли на 2 недели.
Подготовьте доноров задних конечностей опухоли опухоль урожая. Анестезировать кролика с кетамином и 5 мг/кг Ксилазина 45 мг/кг. Усыпить внутривенного (IV) доза Пентобарбитал натрия, более 390 мг/кг.
После того, как были умерщвлены кролика, начните уборки опухоли, удалив кожной и подкожной ткани вышележащих опухоли конкреций с помощью скальпеля с какой размер лезвия, исследователь считает нужным. Смотрите Рисунок 2.
После того, как была обнаружена опухоль конкреций в пределах мышц задних конечностей, удалите опухоль комплектно с использованием широкой криволинейных поля. Для этого, вырезать тендиноза крепления на концах проксимальных и дистальных мышцы, а затем след лезвие скальпеля вдоль основной кости. Пополам explanted образца, подвергая опухолью капсулы и некротические ядро. Смотрите Рисунок 3.
Примечание: VX2 опухоль имеет весьма некротические ядро. Не забудьте использовать защиты надлежащего глаз и других средств индивидуальной защиты при уборке опухоли, поскольку любое повреждение капсулы опухоли может привести к высокого давления отстрела некротические мусора.
Аккуратно почистить некротические ядро с тупым предметом (например щипцы, hemostats), чтобы очистить опухоли. Это должно позволить для лучшей визуализации опухолью капсулы и точки перехода между капсулой и прилегающих мышц. Смотрите Рисунок 4.
Из этого примера, урожай несколько кусков опухоли около 1\u20122 мм³ и немедленно хранить их в чашку, содержащие комнатной температуре стерильного физиологического раствора.
Примечание: Эти опухоли образцов будет использоваться для последующих внутрипеченочных имплантации.
Поместите оставшиеся опухоли в стерильных Петри и купаться с среднего Дульбекко изменение орла (DMEM). Если этот образец хранится холодная на льду, она может быть сохранена для обработки до 2\u20123 ч позже.

3. печени опухоли имплантация через лапаротомия

Подготовка получателей кролик лапаротомии. Анестезировать получателя использованием кетамина 45 мг/кг и 5 мг/кг Ксилазина кролика для индукции, следуют интубации и техническое обслуживание с 1% - 3% изофлюрановая как необходимо. Когда наркоз кролика, брить хирургической сайта с помощью стрижки. Чистота области разреза с помощью трех экземплярах мыть с скраб Бетадин, 70% этанола раствор и Бетадин-раствор и драпировка живота в стерильные хирургические моды.
С помощью #15-лезвие, инициировать лапаротомия, делая небольшой надрез вниз вертикальной средней линии через кожу кролика, начиная от мечевидного отростка. Это должно быть легко пальпируется и стремится быть примерно размер американский Пенни. Смотрите Рисунок 5.
Отражать кожи и идентифицировать linea alba. Это должно быть Светоотражающий белая полоса ткани, книзу путешествия в средней линии. Для обхода использовать тупой рассечение linea alba и разоблачить брюшины. Смотрите Рисунок 6.
Примечание: Брюшины легко определить, поскольку он будет непосредственно вышележащих кишечника, который можно увидеть перемещение с дыханием.
Предупреждение: Брюшины клонит быть сторонником основной кишечника из-за поверхностного натяжения. Использование тупой травмы вскрыть linea alba помогает рассеять риск перфорации кишечника базовой.
После того, как подвергается брюшины, тщательно анализировать через него вступить в брюшной полости. Печень, теперь могут быть определены. Лучше перемещаться пространства в брюшной полости, расширьте срединной линии разреза 1\u20122 см книзу через кожи, мышц и брюшины.
Примечание: Расширение срединной линии разреза можно легко и безопасно сделать вставив тщательно изогнутые кровоостанавливающий перитонеального пространства с изогнутой кончиком, поверхностно, обращенной к брюшине. Затем откройте зажим слегка и использовать лезвие милый ткани между двумя ветвями кровоостанавливающий.
Определите левой доли печени, для того чтобы выбрать сайт для имплантации опухоли. Левой доли infero латеральнее медиального лепесток, который сидит в средней линии.
Прежде чем пытаться привлечь печени из перитонеального пространства, место сухой кусок Марли на нижней аспект разрез.
Примечание: Марля обеспечит адэрентных поверхность заложить печени, чтобы предотвратить его от втягивания обратно в брюшную полость.
С помощью атравматической щипцами или кусок влажной марлевой пальцы, тщательно обратить левой доли печени из брюшной полости через разрез и заложить его на сухой марлей, ранее. Смотрите Рисунок 7.
Предупреждение: Печени капсулы чувствительны и могут легко разрыва. Важно, чтобы быть нежным, при обработке этого органа для предотвращения капсульной кровоточить, печени синяков или возможного hemoperitoneum.
Примечание: Обычно, печень будет объявить себя визуально войдя перитонеального пространства; Однако если растянутый живот кролика, печени может быть толкнул краниально Долой. Если это так, осторожно поднимите брюшной стенки с помощью тупого зонда. В этом случае печени, как правило, придерживаться вентральной аспект диафрагмы из-за поверхностного натяжения так тщательно отдельный печени с помощью тупого зонда, и его следует отсоединить. Затем используйте атравматической щипцы для вытянуть печени.
На данный момент подготовить опухолевой ткани для имплантации и поместите кусок влажной марлевой печени, чтобы защитить его.
Выберите фрагмент³ мм 1\u20122 опухолевой ткани, который был создан во время шага 2.6 для имплантации в печени. Смотрите Рисунок 8.
С помощью #11-лезвие, проколы тканей печени под углом 45°, делая глубокий карман 0,5 см, стараясь не проникают в спинной печени капсулы. Оставьте лезвие на месте после делать прокол. Смотрите Рисунок 9.
Аккуратно поднимите лезвие в вентральной направлении, чтобы создать небольшой карман в печени кровати. Возьмите кусок опухоли с помощью щипцов, поместите кусок опухоли в этом кармане и затем удалите лезвие.
Примечание: Лезвия могут быть удалены перед установкой часть опухоли, однако, печень будет кровоточить и это может заслонить прокол сайт, что делает его трудно определить.
Предупреждение: Не забудьте свести к минимуму контакт опухоли с другими структурами для предотвращения непреднамеренного опухоли посева. Это можно также избежать путем отмены любых инструментов, используемых для оказания помощи после имплантации.
На данный момент Поместите кусок гемостаза агента, такие как Гель-пена, опухоли карман для содействия гемостаза и предотвращения выброса части опухоли.
Возвращение печени в живот, после подтверждения гемостаз.
Закройте брюшной стенки с 3-0 полидиоксанон шов на конус иглы с помощью простой непрерывный стежок и закрыть кожи с 4-0 полиглактин 910 швы на игле резки с помощью непрерывной subcuticular стежка.
Предупреждение: При закрытии брюшной стенки, заботиться чтобы не повредить сальника или других структур кишечника в шов броска.
Примечание: Хотя эта опухоль займет по меньшей мере 2 недели, чтобы окончательно рентгенологически идентифицироваться, достигает размера 1.5\u20122 см в диаметре в 3 недели роста. Будьте осторожны, чтобы не позволить печени опухоли расти последних недель 3.5\u20124, поскольку опухоль будет формировать экзофитный массы и активно распространяются локально.

4. VX2 Опухоли подвеска подготовка

Место стрейнер 40 мкм в горловину трубки 50 мл конические пропилена. С помощью опухоль из шага 2.7, используйте #15-лезвие для царапать поверхность опухоли для сбора жизнеспособных опухоли и поместить эти соскобы в сетчатый фильтр.
Вымойте соскобы жизнеспособных опухоли через сито с помощью DMEM и затем центрифуга пропилена трубки при 1600 об/мин за 8 мин.
После завершения центрифуги, удалить супернатант и отменить его. Затем добавьте метилцеллюлоза оставшийся блок клеток в объемном соотношении 1:1.
Inject Эта подвеска в задние конечности кролика доноров следующие шаги 1.3\u20121.4. Поместите оставшиеся подвеска в 1 мл аликвоты в криогенных трубы и заморозить их в жидком азоте для последующего использования.

5. Ангиографическая использование VX2 опухоли печени

Подготовьте кролика, как описано в пункте 3.1.
Ощупывайте бедренной паз в пах. Когда была обнаружена паз, сделайте 2\u20123 см линейный разрез вдоль паза. Смотрите Рисунок 10.
Использование тупой рассечение, найдите и изолировать бедренной комплект, содержащий бедренной вены, артерии и нервов. Смотрите Рисунок 11.
Опять же используйте тупой рассечение отделить бедренной артерии от остальной части структур в пакете и изолировать артерии на вершине дескриптор скальпель. Смотрите Рисунок 12.
С 3-французский интродьюсер комплект используйте метод Seldinger для получения доступа с помощью иглы. Вставьте проволочного проводника и извлеките иглу для продвижения оболочка 3-Французский в сосуд. Смотрите Рисунок 13.
Предостережение: Избегайте использования чрезмерной силы в продвижении оболочка 3-французский, как это может привести к перерезка бедренной артерии.
Под руководством рентгеноскопические и с помощью катетера, проволочного проводника и йогексол контраст агента, выберите для брюшнополостной ствол — обычно находится на уровне T12 — и затем продвигать катетер в левой печёночной артерии через общего печени и надлежащего печеночной.
На данный момент Администрирование агента выбора через катетер. Как только агент администрируется, удалите катетер.
С помощью 3-0 Шелковый шов, перевязать бедренная артерия пометив проксимальный и дистальный центры в точку вставки оболочки. Не забудьте затянуть узел проксимальнее ножны, как он снимается для предотвращения кровотечения.
Закройте пах разрез с 4-0 полиглактин 910 швы на игле резки с помощью subcuticular стежка.
Поддерживать стандартные послеоперационного ухода и монитор животных восстановления. Выполняют эвтаназии и necropsy, при необходимости, с использованием стандартных методов.

Результаты

Глядя на Рисунок 1, становится ясно, что quadricep кролика расширяется. Кроме того несколько небольших дискретных конкреций, обычно корреляция с ростом опухоли через фасции, видны. При пальпации вводят конечности должны появиться чем не вводили конечности. ...

Обсуждение

Первым важным шагом в методологии VX2 опухоли является успешное распространение опухоли в задние конечности кролика доноров. Обратитесь к первый абзац в разделе «Представитель результатов» для получения дополнительной информации об этом шаге.

Следующим важнейшим шагом...

Раскрытие информации

Работа, изображенные в этом докладе было поддержано исследовательский грант от ООО Guerbet.

Благодарности

Мы хотели бы признать ветеринарного персонала в университете Иллинойс - Чикаго, биологических ресурсов лаборатории.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
MethoCult (Methycellulose)	Stemcell Technologies	M3134
VX2 Cell Line	NCI	VX-2
5 mL Syringe	BD	309646
16 G Needle	BD	305197
22 G Needle	BD	305155
Hair Clippers	Wahl	41870-0438
Foam Insulated Box	Mr. Box Online	10 x 10 x 4
Acepromazine	Henry Schein	003845
Buprenorphine	Par	42023-179-05
Meloxicam	Henry Schein	049755
Alcohol Pads	Covidien	5033
Ketamine	Henry Schein	056344
Xylazine	Akorn	59399-110-20
Pentobarbital (Fatal-Plus)	Vortech	9373
Sterile Petri Dish	Thermo Fisher	172931
DMEM	Gibco	11965092
Saline	Baxter	2F7124
15-Blade	Steris	02-050-015
Scalpel Handle x 2	Steris	22-2381
Curved Hemostat	WPI	501288
Atraumatic Forceps	Sklar	52-5077
Gauze	Medline	NON21430LF
11-Blade	Steris	02-050-011
Surgicel	Ethicon	1951
3-0 PDS / Taper	Ethicon	Z305H
4 - 0 Vicryl / Cutting	Ethicon	J392H
40 μm strainer	BD	352340
50 mL conical tube	Thermo Fisher	339652
plastic pipette	Thomas Scientific	HS206371B
Centrifuge	Sorvall	75004240
1.40 mL Tubes (Internal Thread)	Micronic	MP32131-Z20
3-F VSI Micro-HV Introducer Kit	Vascular Solutions	Custom Order (P15180391)
.018 45° angle glidewire	Terumo	RG*GA1818SA
Direxion bern-shape microcatheter	Boston Scientific	M001195230
Omnipaque	GE	Y510