Geliştirme ve tavşan VX2 modeli anjiyografik kullanımı karaciğer kanseri için

Özet

Bu makalenin amacı kalkınma ve karaciğer kanseri için VX2 Karsinomu tavşan modeli kullanımını bir astar sağlamaktır.

Özet

Tavşan VX2 hepatosellüler karsinom (HCC) girişimsel radyoloji alanında ilgili translasyonel araştırma için yaygın olarak kullanılan bir hayvan modeli tümördür. Bu model bir Anaplastik Skuamöz Hücre Karsinomu kolayca ve güvenle nihai hasat ve homogreft implantasyonu karaciğer içine saf alıcılar için donör tavşan iskelet kas yayılır kullanır. Bu tümör greft alıcı tavşan karaciğer içinde uygun hypervascular kapsül tarafından çevrili nekrotik bir çekirdek ile karakterize bir angiographically olarak tanımlanabilir tümör içine hızla büyür. Tavşan anatomisi fiziksel boyutunu uygulama için izin ve çeşitli girişimsel teknikleri test vasküler araçları kolaylaştırmak yeterlidir. Bu avantajlar rağmen bir model ile çalışan araştırmacılar için somut bir referans olarak hareket etmek teknik kaynaklar yetersizliği bulunmaktadır. Burada, biz geliştirme, büyüme, yayma ve Anjiyografik kullanımı acemi ve tecrübeli araştırmacılar hem için tavşan VX2 tümör modelinin teknik özellikleri için kapsamlı bir görsel taslak mevcut.

Giriş

Tavşan VX2 tümör model gelişimi 1935^1,2beri deneysel Onkoloji bir rol oynamıştır. Bu bir virüs kaynaklı Anaplastik skuamöz hücreli hypervascularity, hızlı büyüme ve kolay yayılma iskelet kas^3,4ile karakterize karsinom tümördür. Tavşan VX2 tümör modeli çok sayıda kanser^5,6,7,8araştırmak için kullanılan süre; Bu yazının odak karaciğer kanseri⁹' dur.

Açıklanan yöntemin amacı primer karaciğer kanseri veya girişimsel radyologlar tarafından translasyonel araştırma için kullanılabilir hepatosellüler karsinom (HCC), için bir model sunmaktır. Farmakokinetik çalışmaları, terapötik araştırmalar ve ablatif yöntemi^{10,11,12,13,14,15}test için kullanılabilir.

Burada ayrıntılı yöntemi diğer modelleri fareler gibi kemirgen modelleri gibi aynı küre içinde birden çok avantajlar verimleri fareler ve dağ sıçanları veya daha büyük modelleri primatlar¹⁶gibi. Araştırmacılar ilk hind uzuv yayılma¹⁷bir ay içinde bir aktif tümör hattı kurmayı sağlayan hızlı ve güvenilir tümör büyüme birincil yararları biridir. Ayrıca, bu tümör basit ultrasonografik görünürlük ve transarterial lokal tedaviler ve ablatif tedaviler için izin veren bir hypervascular çevre var. Son olarak ve en önemlisi, tavşan damarlara boyutunu vasküler araçları¹⁸mümkün ve teknik olarak kolay kullanımı izin verir.

Protokol

Aşağıdaki iletişim kuralı tüm gereksinimleri ve University of Illinois - görevlendirilmiş yönergeleri Chicago izler. Bu gözden geçirildi ve yerel tarafından onaylı kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi önce yürütme.

1. VX2 Hind uzuv tümör gelişimi

1. VX2 tümör hücre kültürünü Ulusal Kanser Enstitüsü Division, kanser tedavi teşhis ve tedavi tümör/hücre satırı deposu tedarik.
   Not: Şu anda, aşağıdaki bağlantıdan sipariş kataloğu bulunabilir: https://dtp.cancer.gov/repositories/.
2. Enjeksiyon için hücre süspansiyon hazırlamak için onlar çözdürülen kadar donmuş VX2 örnek ve methylcellulose orta ılık suya koyun.
   1. 0.5\u20121 mL çözdürülen hücre süspansiyon ve çözülmüş methylcellulose orta eşit bir hacmi 5 mL şırınga Aspire edin.
      Not: Hücre süspansiyon Aspire için 21 ya da 22 G iğne ve methylcellulose orta Aspire için daha büyük bir ölçüm iğne kullanmak için yardımcı olabilir. Şırıngaları buza koyun.
3. Arka bacak tümör donör tavşan hücre süspansiyon, 1 mg/kg acepromazine ve 0,02 mg/kg buprenorfin intramüsküler verilen kullanarak sedasyon ile başlayan, aşılama için hazır olun. Aşı Makinası (arka kol) makasları ile tıraş ve temiz tıraşlı bir alkol veya iyot tabanlı aracı ile vardır.
   Not: Meloksikam 0.2 mg/kg doz subkutan analjezi için verilebilir. Tavşan kürk tıraş etmek zordur. Bu araştırmacı bir toplu kürk takas ve cilt karşı clippers basarak ve ters gidiyor ilk odaklanan birden çok geçiş yapmak tavsiye edilir.
4. 16 G iğne hücre süspansiyon içeren 5 mL şırınga ekleyin ve 1 mL süspansiyon arka bacak kas donör tavşan göbeğine kabaca 1 cm derin enjekte. Siyatik sinir uyluk boyunca elle tutulur bir oluk içinde çalışan korumak emin olun.
   Not: yalnızca saat^%1933 başarılı olsa da dondurulmuş ve çözülmüş VX2 taze VX2 başarıyla deneklerin % 88 inoculates.
   Dikkat: VX2 tümör hızla büyüyecek. Yan etkileri, tümör ilerledikçe olarak kaydetti olabilir: solunum hızı, uyuşukluk, azalan uyanıklığı ve/veya davranış değişiklikleri (Örneğin, sıradışı saldırganlık) arttı. Sonuç olarak, hayvanları yakından izlemek için ve tümör hasat için aşı sonra iki hafta içinde planlamak için öneriler vardır.

2. VX2 Hind uzuv tümör büyüme ve hasat

Not: başarılı aşılama varsayarsak, orada-meli var olmak bir elle tutulur (3\u20124 cm) tümör nodül 2 hafta içinde enjeksiyon yerinde. Genellikle, bu nodül yaklaşık 1 hafta aşikar olacaktır; Ancak, tümör yeterli doku toplama için izin vermek için büyümeye izin iyidir. Genellikle, bu nodül sağlam, sertlesmis ve kas seviyesinin üzerinde yükseltilmiş olacaktır. Eğer

1. İnoculated alan aşı üzerinden 2 hafta muayene et. Hiçbir tümör büyüme 2 haftalık algılanırsa, adım 1 yeniden uygulayın. Bkz: Şekil 1.
   Not: Tümör varlığı da ultrason ile tespit edilebilir. Ne zaman taze stok karşılaştırıldığında donmuş stoktan yayılma tümör büyüme ölçümleri arasındaki farkı değerlendirmek için hiçbir çalışmaları olmuştur iken, donmuş hisse senedi tümör biraz daha yavaş büyür bizim deneyim oldu ve sonra onun taze stok tespit olacak Counter bölümü. Ne olursa olsun, her iki yöntem harvestable bir tümör tarafından 2 hafta verim.
2. Arka bacak tümör donör tümör hasat için hazırlayın. Tavşan ile 45 mg/kg ketamin ve 5 mg/kg xylazine anestezi. Sodyum Fentobarbital 390 mg/kg aşan bir intravenöz (IV) dozu ile ötenazi.
3. Tavşan euthanized kez neşter araştırmacı uygun gördüğü bir hangi boyut bıçak kullanarak tümör nodül örten kutanöz ve subkutanöz doku kaldırarak tümör hasat başlar. Bkz: Şekil 2.
4. Bir kez tümör nodül hind bacak kas içinde olduğu belirlendi, geniş eğrisel kenar boşluklarını kullanmak tümör en bloc çıkarın. Bu, proksimal ve distal ucunda tendinous ek puan uygun kas ve sonra izleme neşter bıçak boyunca temel kemik. Tümör kapsülü ve nekrotik çekirdek ortaya explanted numune bisect. Şekil 3' e bakın.
   Not: Son derece nekrotik bir çekirdek VX2 tümör var. Tümör kapsülü herhangi bir hasar nekrotik enkaz yüksek basınç çýkartýlmasýný neden olabilir beri tümör, hasat zaman uygun göz koruma ve diğer kişisel koruyucu donanımları kullandığınızdan emin olun.
5. Yavaşça körelmiş (Örneğin forseps, hemostats) tümör temizlemek için nekrotik core kazı. Bu tümör kapsülü ve kapsül ve çevresindeki kas arasında geçiş noktası daha iyi görselleştirme için izin vermelidir. Bkz. Şekil 4.
6. Bu örnek, tümör gibi birkaç hasat yaklaşık 1\u20122 mm³ ve hemen oda sıcaklığında steril serum fizyolojik içeren bir kaba depolayabilirsiniz.
   Not: Bu tümör örnekler sonraki intrahepatic implantasyon için kullanılacaktır.
7. Kalan tümör steril Petri kabına yerleştirin ve Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) ile banyo. Bu örnek üzerinde buz soğuk tutuluyorsa, s 2\u20123 kadar daha sonra işleme için korunabilir.

3. karaciğer tümörü implantasyon laparotomi ile

1. Alıcı tavşan laparotomi için hazırlayın. 45 mg/kg ketamin ve 5 mg/kg xylazine kullanarak alıcı tavşan anestezi indüksiyon ardından entübasyon ve bakım % 1-% 3 isoflurane olarak gerekli. Ne zaman tavşan anestezi, saç kesme makineleri kullanarak cerrahi sitesi tıraş. İneklemek yıkama betadin bodur, % 70 etanol çözüm, betadin kullanarak ve çözüm ile kesi alanı temizleyin ve karın bir steril cerrahi moda asmak.
2. #15-bıçak kullanarak, laparotomi xiphoid işleminden başlayarak tavşan deri yoluyla bir küçük aşağı doğru dikey ensizyon yaparak başlatmak. Bu kolayca palpe ve kabaca bir Amerikan kuruş boyutunu olma eğilimindedir. Bkz. Şekil 5.
3. Cilt yansıtmak ve tanımlamak linea alba. Bu doku kasılır orta hat içinde seyahat bir yansıtıcı beyaz grup olmalıdır. Künt diseksiyon çapraz kullanmak linea alba ve karın zarını maruz. Bkz. Şekil 6.
   Not: doğrudan solunum ile hareket görülebilir bağırsak örten bu yana Karın zarını kolayca tanımlanır.
   Dikkat: Karın zarını olma eğilimindedir yüzey gerilimi nedeniyle temel bağırsak yapışık. Künt travma incelemek için kullanarak linea alba temel bağırsak perfore riski dağıtmak için yardımcı olur.
4. Karın zarını maruz sonra dikkatli bir şekilde bu periton boşluğuna girmek için incelemek. Karaciğer şimdi tespit edilebilir. Karın boşluğu daha iyi gezinmek için orta hat kesi 1\u20122 cm kasılır deri, kas ve karın zarını aracılığıyla genişletmek.
   Not: ensizyon uzanan kolayca ve güvenli bir şekilde dikkatle kavisli bir hemostat periton uzaya yüzeysel olarak Karın zarını doğru bakacak şekilde kavisli ucu ekleyerek yapılabilir. O zaman hemostat biraz açıp da hemostat iki kolu arasındaki doku şirin bir bıçak kullanın.
5. Karaciğer sol lob tümörü implantasyon için bir site seçin için tanımlayın. Sol lob infero-lateral orta hat içinde oturan orta lob için.
6. Karaciğer periton alanınız çizmek denemeden önce gazlı bez kuru bir parça belgili tanımlık kesme aşağı yönü de yerleştirin.
   Not: Gazlı bez karaciğer geri karın geri çeker önlemek için koymak için yapisan bir yüzey sağlar.
7. Atravmatik forseps veya ıslak gazlı bez parçası üzerinde parmaklarını kullanarak, dikkatle dışarı belgili tanımlık kesme yoluyla karın karaciğer sol lob çizmek ve kuru gazlı bez daha önce yerleştirilmiş uzan. Bkz. Şekil 7.
   Dikkat: Karaciğer kapsülü duyarlıdır ve -ebilmek kolayca yırtılması. Kapsüler taşma payı, karaciğer morarma, ve/veya nihai hemoperitoneum önlemek için bu organ ele alırken nazik olmak önemlidir.
   Not: Genellikle, karaciğer kendini görsel olarak periton boşluğu girdikten sonra ilan edecek; tavşan mide şişmiş, ancak, karaciğer cranially önünden itti olabilir. Bu durumda ise, yavaşça karın duvarı künt bir sonda kullanarak kaldırın. Bu senaryoda, karaciğer karaciğer künt bir sonda kullanarak diyafram yüzey gerilimi çok dikkatle ayrı nedeniyle ventral yönünü uygun eğilimindedir ve ayırmak. Sonra atravmatik forseps karaciğer ortaya çıkarmak için kullanın.
8. Bu noktada, tümör doku implantasyon için hazırlamak ve onu korumak için karaciğer üzerinde ıslak gazlı bez bir parça yerleştirin.
9. Adım 2.6 implantasyon için karaciğer sırasında oluşturulan tümör doku bir 1\u20122 mm³ parça seçin. Bkz. Şekil 8.
10. #11-bıçak kullanarak, karaciğer doku karaciğer kapsülü dorsal yönünü nüfuz değil dikkat çekici bir 0.5 cm derin cep yapma 45 ° açıyla delik. Bıçak ponksiyon yaptıktan sonra yerde bırakın. Bkz. Şekil 9.
11. Yavaşça bıçak küçük bir cep karaciğer yatakta oluşturmak için bir ventral yönde kaldırın. Forseps kullanarak tümör parça alın, tümör parça cebinde yerleştirin ve sonra bıçak kaldırın.
    Not: Bıçak-ebilmek var olmak çıkarmak tümör parça ekleyerek önce ancak, karaciğer kanayacak ve bunu tanımlamak üzere bir delik sitesi belirsiz.
    Uyarı: iletişim kasıtsız tümör tohum önlemek için diğer yapıları ile tümör en aza indirmek emin olun. Bu da bir kenara sonra implantasyon ile yardımcı olmak için kullanılan herhangi bir alet ayarlayarak önlenebilir.
12. Bu noktada, jel köpük gibi kan durdurucu sargı Aracısı bir parça tümör cep hemostaz teşvik etmek ve tümör parça çýkartýlmasýný önlemek için yerleştirin.
13. Hemostaz onayladıktan sonra karaciğer karında, dönün.
14. Karın duvarı ile 3-0 basit bir sürekli kullanarak konik bir iğne üzerinde polydioxanone dikiş dikiş ve 4-0 polyglactin 910 dikişler üzerinde sürekli subcuticular dikiş kullanarak kesme iğne ile cilt kapatın kapatın.
    Dikkat: karın duvarı kapatırken, omentumun veya diğer bir dikiş atmak bağırsak yapılarda zarar vermemeye özen.
    Not: Bu tümör röntgenlerle kesin olarak tanımlanabilir olması için en az 2 hafta alırken, bu 1.5\u20122 cm çapında bir boyutunu büyüme 3 haftalıkken ulaşır. Hepatik tümör tümör kitle ve agresif yerel olarak yayılmış bir exophytic oluşturacak bu yana 3.5\u20124 hafta büyümeye izin vermemek dikkatli olun.

4. VX2 Tümör süspansiyon hazırlama

1. Bir 40 µm süzgeç 50 mL konik propilen tüp ağız içine yerleştirin. Adım 2.7 tümöründen kullanarak, bir # 15'lik neşter uygun tümör toplamak ve bu parçaları süzgeç yerleştirmek için tümör yüzey kazımak için kullanın.
2. DMEM kullanarak bir süzgeç aracılığıyla uygun tümör vücut yıkama ve propilen tüp 1600 rpm 8 dk santrifüj kapasitesi.
3. Santrifüj tamamlandıktan sonra süpernatant kaldırmak ve o atın. Daha sonra methylcellulose 1:1 hacimsel oranı kalan hücre bloğunda ekleyin.
4. Bu süspansiyon aşağıdaki adımları 1.3\u20121.4 hind kol donör tavşan enjekte. 1 mL aliquots kriyojenik tüpler içinde kalan süspansiyon yerleştirin ve bunları daha sonra kullanmak için sıvı azot dondurmak.

5. anjiyografik VX2 kullanımı karaciğer tümörü

1. Tavşan 3.1. adımda açıklandığı şekilde hazırlayın.
2. Kasık femur oluk muayene et. Tanımlanan oluk, oluk boyunca bir 2\u20123 cm doğrusal kesi olun. Bkz: Şekil 10.
3. Künt diseksiyon kullanarak bulun ve femoral ven, damar ve sinir içeren femur paket yalıtmak. Bkz. Şekil 11.
4. Yine, künt diseksiyon femoral arter pakette bulunan yapıların geri kalanından ayırmak ve bir neşter tanıtıcı üstüne arter izole etmek için kullanın. Bkz. Şekil 12.
5. 3-Fransızca uygulayıcıya kiti ile bir iğne ile erişim için Seldinger tekniği kullanmak. Bir embolisinin ekleyip 3-Fransızca kılıf gemi ilerlemek için iğne kaldırabilirsiniz. Bkz. Şekil 13.
   Dikkat: Bu femoral arter transeksiyon içinde neden olabileceğinden 3-Fransızca kılıf ilerleyen aşırı güç kullanmaktan kaçının.
6. Floroskopik kılavuz ve kateter, embolisinin ve iohexol kontrast Aracısı kullanarak altında Çölyak bagajı için seçin — genellikle T12 düzeyinde bulunan — ve sonra kateter yolu ile ortak hepatik ve uygun sol hepatik arter önceden karaciğer.
7. Bu noktada, Ajan seçtiğiniz kateter aracılığıyla yönetmek. Aracı yönetilen sonra kateter kaldırın.
8. 3-0 ipek sütür kullanarak, femoral arter uzağından ve klemple kılıf ekleme noktasını ligate. Kanama önlemek için çekilmiş gibi için kılıf proksimal düğüm sıkın emin olun.
9. Kasık kesi ile 4-0 polyglactin 910 dikiş subcuticular dikiş kullanarak kesme iğne üzerine kapatın.
10. Standart ameliyat sonrası bakım ve monitör hayvan kurtarma korumak. Ötenazi gerçekleştirmek ve standart yöntemlerle gerektiği gibi necropsy.

Sonuçlar

Şekil 1' de ararken, tavşan uyluk genişletilir açıktır. Ayrıca, genellikle tümör büyüme ile fasya ile korele birden çok küçük ayrık nodüller görülebilir. Palpasyonla eklenen bacak sigara enjekte uzuv görüntülenmesi gerekir. Bir araştırmacı tümör varlığının daha kesin güvence gerektiriyorsa, ultrason görüntüleme kas içinde gömülü tümör tanımlamak için kullanılabilir. Bir tümör algılanmazsa, arka bacak bir tümör ...

Tartışmalar

İlk kritik adım VX2 tümör yöntembilim başarılı bir donör tavşan hind bacak bir tümör yayılması olduğunu. Bu adım hakkında daha fazla bilgi için "Temsilcisi sonuçlar" bölümünde ilk paragrafa bakın.

Sonraki kritik adım uygun tümör kapsülü düzgün tespit garanti etmektedir. Sadece bu tümör süspansiyon hazırlama için gerekli olacaktır, ama seçmek ve hepatik implantasyon için tümör adet üreten için önemlidir. Canlı tümör ve çevresindeki kas dokusu aras?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
MethoCult (Methycellulose)	Stemcell Technologies	M3134
VX2 Cell Line	NCI	VX-2
5 mL Syringe	BD	309646
16 G Needle	BD	305197
22 G Needle	BD	305155
Hair Clippers	Wahl	41870-0438
Foam Insulated Box	Mr. Box Online	10 x 10 x 4
Acepromazine	Henry Schein	003845
Buprenorphine	Par	42023-179-05
Meloxicam	Henry Schein	049755
Alcohol Pads	Covidien	5033
Ketamine	Henry Schein	056344
Xylazine	Akorn	59399-110-20
Pentobarbital (Fatal-Plus)	Vortech	9373
Sterile Petri Dish	Thermo Fisher	172931
DMEM	Gibco	11965092
Saline	Baxter	2F7124
15-Blade	Steris	02-050-015
Scalpel Handle x 2	Steris	22-2381
Curved Hemostat	WPI	501288
Atraumatic Forceps	Sklar	52-5077
Gauze	Medline	NON21430LF
11-Blade	Steris	02-050-011
Surgicel	Ethicon	1951
3-0 PDS / Taper	Ethicon	Z305H
4 - 0 Vicryl / Cutting	Ethicon	J392H
40 μm strainer	BD	352340
50 mL conical tube	Thermo Fisher	339652
plastic pipette	Thomas Scientific	HS206371B
Centrifuge	Sorvall	75004240
1.40 mL Tubes (Internal Thread)	Micronic	MP32131-Z20
3-F VSI Micro-HV Introducer Kit	Vascular Solutions	Custom Order (P15180391)
.018 45° angle glidewire	Terumo	RG*GA1818SA
Direxion bern-shape microcatheter	Boston Scientific	M001195230
Omnipaque	GE	Y510