פיתוח ושימוש Angiographic של המודל VX2 הארנב של סרטן הכבד

Summary

מטרת מאמר זה היא לספק פריימר עבור פיתוח והשתמש בדגם ארנב קרצינומה VX2 של סרטן הכבד.

Abstract

הגידול VX2 הארנב הוא במודל חיה בדרך כלל מנוצל עבור המחקר translational לגבי קרצינומה hepatocellular (HCC) בשטח לרדיולוגיה התערבותית. מודל זה מעסיקה של אנפלסטית קרצינומה של תאים קשקשיים זה בקלות ובאמינות הופץ בשריר השלד ארנבים תורם בסופו של דבר הקציר, להשתלת השרשת לתוך הכבד תמים נמענים. שתל זה הגידול גדל במהירות בתוך הכבד של ארנבים הנמען לתוך גידול angiographically לזיהוי מאופיין על ידי גרעין נמק מוקף קפסולה hypervascular קיימא. הגודל הפיזי של האנטומיה ארנב מספיקה להקל על כלי הדם מכשור המאפשר היישום ובדיקה של טכניקות שונות התערבותית. למרות יתרונות אלו, קיימת במחסור של משאבים טכניים לפעול כהפניה בטון לחוקרים לעבוד עם המודל. במסמך זה, אנו מציגים קו מיתאר חזותי מקיף על ההיבטים הטכניים של התפתחות, צמיחה, הפצת ניצול angiographic של המודל גידול ארנב VX2 לשימוש על ידי טירון וחוקרים מנוסים כאחד.

Introduction

הדגם גידול ארנב VX2 שיחק תפקיד באונקולוגיה ניסיוני מאז הפיתוח ב- 1935^1,2. הגידול הזה הוא וירוס-induced אנפלסטית קרצינומה של תאים קשקשיים המאופיינת hypervascularity, צמיחה מהירה, קלה הפצת שרירי השלד^3,4. ואילו הדגם גידול ארנב VX2 שימש לחקור מספר רב של סוגי סרטן^5,6,7,8; המוקד של מאמר זה היא סרטן הכבד⁹.

מטרת השיטה המתוארת היא להציג מודל עבור סרטן כבד ראשוני, או קרצינומה hepatocellular (HCC), זה יכול להיות בשימוש על ידי רדיולוגים התערבותית המחקר translational. זה יכול לשמש עבור מחקרים פרמוקוקינטיים, חקירות טיפולית, ושיטת פולשני בדיקות^{10,11,12,13,14,15}.

השיטה מפורט בזאת מניבה מספר יתרונות על פני דגמים אחרים בתוך מעגל אותו כגון מודלים מכרסמים כמו חולדות, עכברים, סנאים, או דגמים גדולים כמו יונקים¹⁶. אחד היתרונות העיקריים הוא צמיחת הגידול מהירה ואמינה אשר מאפשר לחוקרים לקבוע קו פעיל הגידול תוך חודש של הגפיים האחוריות הראשון הפצת¹⁷. בנוסף, הגידול הזה יש ראות sonographic פשוטה של הפריפריה hypervascular אשר מאפשר טיפולים locoregional transarterial וגם טיפולים פולשני. לבסוף, והכי חשוב, בגודל של להערכת הארנב מאפשרת ניצול ריאלי וקל טכנית של כלי דם ומכשור¹⁸.

Protocol

להלן כללי התנהגות עוקב אחר כל דרישות והנחיות המנדט על ידי אוניברסיטת אילינוי - שיקגו. היא נבדקה, אושרה תושבים המקומיים אכפת לי חיה המוסדית והוועדה לשימוש לפני ביצוע.

1. VX2 התפתחות גידולים של הגפיים האחוריות

1. להשיג את שורת התאים של גידול VX2 הלאומית המכון חלוקה של סרטן טיפול אבחון סרטן, טיפול הגידול תא קו במאגר.
   הערה: בשלב זה, הקטלוג סדר ניתן למצוא בקישור הבא: https://dtp.cancer.gov/repositories/.
2. כדי להתכונן התליה תא הזרקה, הנח קפוא VX2 methylcellulose ולדגום המדיום במים פושרים עד שהם יש הקרת.
   1. האחות 0.5\u20121 מ"ל של התליה תא המופשרים ואמצעי אחסון שווה methylcellulose המופשרים בינוני לתוך מזרק 5-mL.
      הערה: היא עשויה לסייע השימוש מחט G 21 או 22 מחוק לגמרי התליה תא ו מחט מד גדול יותר מחוק לגמרי המדיום methylcellulose. במקום תארגן את הדברים על קרח.
3. להכין התורם הגידול של הגפיים האחוריות ארנב חיסון של השעיה תא, החל הרגעה באמצעות איזופרומאזין 1 מ"ג/ק"ג ו- 0.02 נקודות מ"ג/ק"ג. הבופרנורפין בהתחשב intramuscularly. לגלח את האתר חיסון (הינד האיבר). עם מספריים, נקיים מגולח עם סוכן או יוד-בסיס אלכוהול.
   הערה: Meloxicam יכול להינתן במינון של 0.2 מ"ג/ק"ג subcutaneously על שיכוך כאבים. ארנב פרווה קשה להתגלח. מומלץ כי החוקר לבצע מעברים מרובים, תחילה התמקדות ניקוי בכמויות גדולות של הפרווה ואז לחיצה והסכין על העור, הולך נגד התבואה.
4. מחט 16 גרם לצרף המזרק 5-mL המכיל התליה תא ולהזריק 1 מ"ל של ההשעיה לתוך הבטן של השריר הגפיים האחוריות של הארנב התורם, בערך 1 ס מ עמוקה. הקפד לשמור בעצב פועל במסגרת groove מוחשי לאורך עצם הירך.
   הערה: VX2 טריים inoculates 88% מהנושאים בהצלחה בזמן VX2 מוקפאים ומופשרים הוא רק מוצלח 33% של הזמן¹⁹.
   התראה: הגידול VX2 יגדל במהירות. תופעות הלוואי עשוי לציין התקדמות הגידול הם: גדל קצב נשימה, עייפות, ירידה בערנות, ו/או שינויים התנהגותיים (למשל, תוקפנות יוצאת דופן). כתוצאה מכך, ההמלצות הן כדי לפקח על החיות מקרוב וכדי לתכנן לקציר הגידול בתוך שבועיים לאחר חיסון.

2. VX2 הגפיים האחוריות הגידול והקציר

הערה: בהנחה חיסון מוצלח, צריך להיות מוחשי גולה הגידול (3\u20124 ס מ) במקום ההזרקה בתוך 2 שבועות. בדרך כלל, גולה זו יהיה מוחשי בסביבות 1 בשבוע; עם זאת, עדיף לתת את הגידול לגדול כדי לאפשר לאיסוף רקמות מספיקות. בדרך כלל, גולה זה יהיה המשרד המתועב, מוגבה מעל הרמה של השריר. אם

1. ימשש את האזור חוסנו ב 2 שבועות של חיסון. אם הגידול לא מזוהה ב 2 שבועות, בצע שוב את שלב 1. ראה איור 1.
   הערה: הנוכחות של הגידול יכול גם להיות מוערך באמצעות אולטרסאונד. ואילו היו אין מחקרים כדי להעריך את ההבדל בין מדדי צמיחה הגידול כאשר הופץ במלאי קפוא לעומת מניות טריים, זה היה הניסיון שלנו שגדלה הגידול במלאי קפוא מעט לאט יותר, יהיה לזיהוי אחרי המניות טריים נגד חלק. בכל מקרה, אחת מהשיטות אמור להניב גידול harvestable על ידי 2 שבועות.
2. הכינו את התורם הגידול של הגפיים האחוריות לקציר הגידול. עזים ומתנגד הארנבת עם 45 מ"ג/ק"ג קטמין ו- 5 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים. המתת חסד עם מנה (IV) תוך ורידי של סודיום פנטוברביטל העולה על 390 מ"ג/ק"ג.
3. לאחר יש כבר מורדמים הארנב, להתחיל לקצור את הגידול על-ידי הסרת הרקמה עורית ו התת-עורית המכסים גולה הגידול באמצעות אזמל עם להב משנה גודל החוקר שיראה לנכון. ראה איור 2.
4. לאחר הגידול גולה זוהתה בתוך השריר הגפיים האחוריות, להסיר את הגידול en bloc באמצעות לאכסדרות רחב שוליים. בשביל זה, לחתוך את הנקודות המצורף tendinous בקצות לקרע, של השריר ולאחר מכן מעקב הלהב האזמל לאורך העצם שמתחת. קטיעות הדגימה explanted לחשוף את הגידול הקפסולה ואת ליבה נמק. ראו איור 3.
   הערה: הגידול VX2 יש גרעין מאוד נמק. הקפד להשתמש עיניים נאות הגנה אחרים ציוד מגן אישי בעת הקטיף הגידול, מאז כל נזק הקפסולה הגידול יכול לגרום הוצאה בלחץ גבוה של פסולת נמק.
5. לגרד בעדינות את ליבת נמק עם חפץ קהה (למשל מלקחיים, ועוצרי דימום) כדי לנקות את הגידול. זה אמור לאפשר כאחראית של הקפסולה הגידול, נקודת המעבר בין כמוסה שריר שמסביב. ראה איור 4.
6. מאת הדוגמא, הקציר כמה חתיכות של גידול בערך 1\u20122 מ מ³ מיד לאחסן אותם בתוך כוס המכילה מלח סטרילית בטמפרטורת החדר.
   הערה: דגימות הגידול אלה ישמש להשתלה intrahepatic עוקבות.
7. מקום הגידול שנותרו בצלחת פטרי סטריליות, רוחצים את זה עם בינוני (DMEM ששינה הנשר Dulbecco). אם שכזו נשמרת קר על קרח, זה יכול להישמר לטיפול עד 2\u20123 h מאוחר יותר.

3. גידול בכבד ההשתלה באמצעות פתיחת בטן

1. להכין את הארנב הנמען פתיחת בטן. עזים ומתנגד הארנב נמען באמצעות 45 מ"ג/ק"ג קטמין ו- 5 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים עבור אינדוקציה ואחריו צנרור ותחזוקה עם 1% - 3% איזופלוריין כפי הצורך. כאשר הארנב הוא מורדם, לגלח את האתר כירורגית בעזרת קוצץ שיער. לנקות את אזור החתך באמצעות שטיפת triplicate עם betadine לשפשף, 70% אתנול פתרון, והפתרון betadine, לעטוף את הבטן בצורה סטרילית כירורגי.
2. באמצעות #15-להב, ליזום את פתיחת בטן על ידי ביצוע חתך קטן קו האמצע האנכי דרך עורו של הארנב החל הסרעפת. זה צריך להיות palpated בקלות, נוטה להיות בערך בגודל של פני אמריקאי. ראה איור 5.
3. לשקף את העור ולזהות לינאה אלבה. זה צריך להיות להקה לבנה רעיוני של רקמות שנסע נלסון האמצע. השתמש עמום כדי לחצות לינאה אלבה ולחשוף את הצפק. ראה איור 6.
   הערה: הצפק מזוהה בקלות מאז זה להיות ישירות המכסים המעי הגס, אשר ניתן לראות לנוע עם נשימה.
   התראה: הצפק נוטה להיות חסיד אל המעי כבסיס עקב מתח. באמצעות פגיעת לנתח לינאה אלבה מסייעת להפיג את הסיכון של ניקוב המעי הגס המשמש כבסיס.
4. ברגע הצפק חשוף, לנתח בזהירות דרך כניסה חלל הצפק. עכשיו ניתן לזהות את הכבד. כדי לנווט טוב יותר את חלל הבטן, להרחיב את קו האמצע החתך 1\u20122 ס מ נלסון דרך העור, השרירים, הצפק.
   הערה: הרחבת קו האמצע החתך יכול בקלות ובבטחה להיעשות על-ידי הוספת בקפידה עוצר דימום מעוקל לחלל הצפק עם קצה מעוגל הפונה באופן שטחי לכיוון הצפק. לאחר מכן לפתוח את עוצר דימום מעט, להשתמש בלהב חמודות הרקמה בין שתי הזרועות עוצר דימום.
5. לזהות האונה השמאלית של הכבד על מנת לבחור אתר להשתלה הגידול. האונה השמאלית היא infero-לרוחב כדי האונה המדיאלי אשר יושב האמצע.
6. לפני מנסים לצייר את הכבד את כל המקום הצפק, למקם פיסת יבשה גאזה ההיבט נחות של החתך.
   הערה: הגזה תספק של משטח חסיד להניח את הכבד על בניסיון למנוע את היציבה בחזרה לתוך הבטן.
7. באמצעות מלקחיים atraumatic או פיסת גזה רטוב על האצבעות, בזהירות לצייר האונה השמאלית של הכבד מתוך הבטן דרך החתך, תניח על הגזה יבש להציב קודם לכן. ראה איור 7.
   התראה: הקפסולה הכבד הוא רגיש והוא יכול בקלות קרע. זה חיוני כדי להיות עדין בעת טיפול איבר זה כדי למנוע דימום דרכים, שטפי דם בכבד, ו/או hemoperitoneum בסופו של דבר.
   הערה: בדרך כלל, הכבד יצהיר עצמה מבחינה ויזואלית עם כניסתו של חלל הצפק; עם זאת, אם בטן הארנב נפוחה, הכבד יכול להיות דחף cranially למראית עין. אם זה המקרה, הרם בעדינות לקיר הבטן באמצעות בדיקה בוטה. בתרחיש זה, הכבד נוטה לדבוק ההיבט הגחון של הסרעפת עקב מתח נפרד בקפידה רבה את הכבד באמצעות בדיקה בוטה, זה צריך לנתק. Atraumatic מלקחיים להשתמש כדי למשוך את הכבד.
8. בשלב זה, להכין את רקמת הגידול השרשה ומניחים פיסת גזה רטוב על הכבד כדי להגן עליו.
9. בחר קטע³ מ"מ 1\u20122 של רקמת הגידול שנוצר במהלך שלב 2.6 להשתלה לתוך הכבד. ראה איור 8.
10. באמצעות #11-להב, לנקב רקמת הכבד בזווית של 45 מעלות ביצוע כיס עמוק 0.5 ס מ, מטפל לא לחדור את ההיבט הגבי של הקפסולה בכבד. להשאיר את הלהב במקום לאחר ביצוע הניקוב. ראה איור 9.
11. הרם בעדינות את הלהב כיוון הגחון כדי ליצור כיס קטן במיטה בכבד. תירה את הגידול באמצעות מלקחיים, למקם את החתיכה הגידול בכיס, ואז מוציא את הסכין.
    הערה: ניתן להסיר את הלהב לפני הוספת היצירה הגידול, אולם, הכבד ידמם, זה ניתן להסתיר את החדירה ולכן קשה לזהות.
    התראה: הקפד למזער מגע של הגידול עם כל מבנה אחר כדי למנוע גידול לא מכוונת זריעה. זה יכול להמנע גם על-ידי הגדרת הצידה כל הכלים המשמשים כדי לסייע עם ההשתלה לאחר מכן.
12. בשלב זה, מניחים חתיכת סוכן hemostatic, כגון ג'ל קצף מעל הכיס הגידול כדי לקדם את hemostasis וכדי למנוע הוצאה של היצירה הגידול.
13. להחזיר הכבד אל הבטן, וברגע hemostasis הוא אישר.
14. קרוב לקיר הבטן עם 3-0 polydioxanone תפר על מחט להתחדד באמצעות פשוטה רציפה לתפור ולסגור את העור עם התפרים 910 polyglactin 4-0 על מחט חיתוך באמצעות תפר רציף subcuticular.
    התראה: בעת סגירת לקיר הבטן, תדאג שלא יגרמו נזק את omentum או מבנים אחרים המעי זריקה תפר.
    הערה: בזמן הגידול הזה ייקח לפחות 2 שבועות להיות באופן מוחלט radiographically המאפשר זיהוי, זה מגיע בגודל של 1.5\u20122 ס מ קוטר אחת ב 3 שבועות של צמיחה. יש להיזהר לא לאפשר את הגידול הכבד לגדול מעבר 3.5\u20124 שבועות מאז הגידול יהוו exophytic של המוני ובתקיפות התפשטות מקומית.

4. VX2 הגידול ההשעיה הכנה

1. מניחים מסננת מיקרומטר 40 לתוך הפה של שפופרת 50-mL פרופילן חרוט. באמצעות הגידול מהשלב 2.7, השתמש #15-להב לגרד את פני השטח של הגידול כדי לאסוף את הגידול קיימא ומניחים את שערות אלו לתוך מסננת.
2. לשטוף את הגידול קיימא מהציפורניים שלו כדי למצוא דרך מסננת באמצעות DMEM, ואז centrifuge את הצינור פרופילן ב 1600 סיבובים במשך 8 דקות.
3. בתום לצנטריפוגה, להסיר את תגובת שיקוע וזורקים אותו. לאחר מכן להוסיף methylcellulose לבלוק התאים הנותרים ביחס נפח של 1:1.
4. להזריק ההשעייה לתוך ארנב תורם האיבר הינד בעקבות צעדים 1.3\u20121.4. למקם את המתלים הנותרים 1 מ"ל aliquots צינורות קריוגני ולהקפיא אותן בחנקן נוזלי לשימוש מאוחר יותר.

5. angiographic ניצול VX2 גידול בכבד

1. הכינו את הארנב כפי שמתואר בשלב 3.1.
2. ימשש את הקצב הירך במפשעה. כאשר החריץ זוהתה, עושים 2\u20123 ס מ ליניארי חתך לאורך החריץ. ראה איור 10.
3. באמצעות עמום, אתר ולחץ לבודד את הצרור הירך המכיל את עורק הירך עורק, עצב. ראה איור 11.
4. שוב, השתמש עמום כדי להפריד בין עורק הירך לבין שאר מבני הצרור ולבודד את העורק על גבי ידית ומהדקים. ראה איור 12.
5. בעזרת ערכת introducer 3-צרפתית, לנצל את הטכניקה Seldinger כדי לקבל גישה עם מחט. הוספת guidewire ולהסיר את המחט כדי להתקדם מהנרתיק 3-צרפתית לתוך הכלי. ראה איור 13.
   זהירות: הימנעו משימוש בכוח מופרז בקידום נדן 3-צרפתית, התוצאה יכולה להיות חיתוך של עורק הירך.
6. תחת fluoroscopic והכוונה באמצעות קטטר, guidewire, iohexol חדות הסוכן, בחר עבור המטען צליאק – בדרך כלל ממוקם ברמת טי12 — ואז לקדם הקטטר לתוך עורק הכבד השמאלי דרך המשותף הכבד ונכון הכבד.
7. בשלב זה, לנהל את הסוכן של בחירה דרך הקטטר. פעם הסוכן מנוהלת, להסיר את הצנתר.
8. באמצעות תפרים משי 3-0, מאתרים ומפסיקים את עורק הירך הציר הקרוב, יש את נקודת הכניסה של נדן. יש להקפיד להדק את הקשר proximal כדי נדן כפי זה נסוגה כדי למנוע דימום.
9. סגירת החתך במפשעה עם התפרים 910 polyglactin 4-0 על מחט חיתוך באמצעות תפר subcuticular.
10. לשמור על תקן שלאחר הניתוח צג והטיפול בבעלי חיים שחזור. קס, necropsy לפי הצורך באמצעות טכניקות סטנדרטי.

תוצאות

כאשר מסתכלים על איור 1, ברור כי quadricep של הארנב הוא מוגדל. בנוסף, מספר גושים דיסקרטית קטן, בדרך כלל מתאם עם הגידול דרך fascia, גלויים. בעת מישוש, האיבר מוזרק אמור להופיע יותר האיבר שאינם המוזרק. אם חוקר דורשת אבטחת מוחלטים יותר נוכחות הגידול, אולטראסאונד הדמיה ני?...

Discussion

השלב הקריטי הראשון המתודולוגיה הגידול VX2 היא הפצת מוצלחת של הגידול בתוך האיבר האחוריות של ארנבת התורם. עיין בפסקה הראשונה בסעיף "נציג תוצאות" לקבלת מידע נוסף על שלב זה.

השלב הקריטי הבא זה להבטיח כי הקפסולה הגידול קיימא מזוהים כהלכה. לא רק זה יהיה צורך להכנה ההשעיה הגידול, אלא ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MethoCult (Methycellulose)	Stemcell Technologies	M3134
VX2 Cell Line	NCI	VX-2
5 mL Syringe	BD	309646
16 G Needle	BD	305197
22 G Needle	BD	305155
Hair Clippers	Wahl	41870-0438
Foam Insulated Box	Mr. Box Online	10 x 10 x 4
Acepromazine	Henry Schein	003845
Buprenorphine	Par	42023-179-05
Meloxicam	Henry Schein	049755
Alcohol Pads	Covidien	5033
Ketamine	Henry Schein	056344
Xylazine	Akorn	59399-110-20
Pentobarbital (Fatal-Plus)	Vortech	9373
Sterile Petri Dish	Thermo Fisher	172931
DMEM	Gibco	11965092
Saline	Baxter	2F7124
15-Blade	Steris	02-050-015
Scalpel Handle x 2	Steris	22-2381
Curved Hemostat	WPI	501288
Atraumatic Forceps	Sklar	52-5077
Gauze	Medline	NON21430LF
11-Blade	Steris	02-050-011
Surgicel	Ethicon	1951
3-0 PDS / Taper	Ethicon	Z305H
4 - 0 Vicryl / Cutting	Ethicon	J392H
40 μm strainer	BD	352340
50 mL conical tube	Thermo Fisher	339652
plastic pipette	Thomas Scientific	HS206371B
Centrifuge	Sorvall	75004240
1.40 mL Tubes (Internal Thread)	Micronic	MP32131-Z20
3-F VSI Micro-HV Introducer Kit	Vascular Solutions	Custom Order (P15180391)
.018 45° angle glidewire	Terumo	RG*GA1818SA
Direxion bern-shape microcatheter	Boston Scientific	M001195230
Omnipaque	GE	Y510