Desenvolvimento e uso angiográfico do modelo VX2 coelho para câncer de fígado

Resumo

O objetivo deste artigo é fornecer uma cartilha para o desenvolvimento e a utilização do modelo VX2 carcinoma coelho para câncer de fígado.

Resumo

O tumor de VX2 coelho é um modelo animal, comumente utilizado para a investigação de translação sobre carcinoma hepatocelular (HCC) no campo da radiologia intervencionista. Este modelo emprega um anaplásico carcinoma de células escamosas facilidade e confiabilidade propagada no músculo esquelético de coelhos de doador para eventual implantação colheita e aloenxerto em fígado de destinatários de ingênuo. Este enxerto tumor cresce rapidamente dentro do fígado de coelhos destinatários em um tumor angiographically identificável caracterizado por um núcleo necrótico cercado por uma cápsula de injetados viável. O tamanho físico da anatomia coelho é suficiente para facilitar a instrumentação vascular, permitindo a aplicação e teste de várias técnicas de intervenção. Apesar desses benefícios, existe uma escassez de recursos técnicos para atuar como uma referência concreta para pesquisadores que trabalham com o modelo. Neste documento, apresentamos um contorno visual abrangente para os aspectos técnicos do desenvolvimento, crescimento, propagação e utilização angiográfica do coelho VX2 tumor modelo para ser usado por novatos e experientes pesquisadores.

Introdução

O modelo de tumor VX2 coelho tem desempenhado um papel em Oncologia experimental desde seu desenvolvimento em 1935^1,2. Este tumor é um vírus-induzida anaplásico carcinoma espinocelular caracterizada por hypervascularity, crescimento rápido e fácil propagação no músculo esquelético^3,4. Enquanto o modelo de tumor coelho VX2 tem sido usado para investigar uma infinidade de cancros^5,6,7,8; o foco deste artigo é de câncer de fígado⁹.

O objetivo do método descrito é apresentar um modelo para câncer de fígado primário, ou carcinoma hepatocelular (HCC), que pode ser usado por radiologistas intervencionistas para investigação de translação. Ele pode ser usado para estudos farmacocinéticos, investigações terapêuticas e ablativo método testando^{10,11,12,13,14,15}.

O método detalhado neste documento produz várias vantagens sobre outros modelos dentro da mesma esfera tais como modelos de roedores como ratos, ratos e marmotas ou modelos maiores como primatas¹⁶. Um dos principais benefícios é o crescimento do tumor rápida e confiável que permite que os investigadores estabelecer uma linha de tumor ativo dentro de um mês do primeiro membro posterior propagação¹⁷. Além disso, este tumor tem visibilidade sonográfico simples e uma periferia de injetados que permite tanto transarterial locorregional de tratamentos e terapias ablativas. Finalmente e mais importante, o tamanho da vasculatura coelho permite utilização viável e tecnicamente fácil de instrumentação vascular¹⁸.

Protocolo

O seguinte protocolo segue todos os requisitos e diretrizes mandatadas pela Universidade de Illinois - Chicago. Ele foi revisado e aprovado pelo local institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização antes de sua execução.

1. VX2 membro posterior desenvolvimento do Tumor

1. Adquirir a linha de células de tumor VX2 da divisão Instituto Nacional câncer de câncer tratamento diagnóstico e tratamento de Tumor/célula linha repositório.
   Nota: Neste momento, o catálogo de ordem pode ser encontrado no seguinte link: https://dtp.cancer.gov/repositories/.
2. Para preparar a suspensão de eritrócitos para injeção, coloque o meio de amostra e metilcelulose VX2 congelado em água morna até que eles tenham derretido.
   1. Aspire 0.5\u20121 mL de suspensão de células descongeladas e igual volume de meio de metilcelulose descongelado em uma seringa de 5 mL.
      Nota: Pode ajudar a usar uma agulha 21 ou 22 de aspirar a suspensão de células e uma agulha de calibre maior para aspirar o meio de metilcelulose. Coloque as seringas no gelo.
3. Prepare o doador de tumor do membro posterior coelho para inoculação da suspensão de células, começando com sedação usando acepromazina 1 mg/kg e buprenorfina 0,02 mg/kg, dada por via intramuscular. Raspar o local de inoculação (membro posterior) com tosquiadeiras e limpos é a raspada com um agente ou iodo-à base de álcool.
   Nota: Meloxicam pode ser dado na dose de 0,2 mg/kg por via subcutânea para analgesia. Pele de coelho é difícil de fazer a barba. É recomendável que o pesquisador realizar várias passagens, focando primeiro limpando um volume do pelo e então pressionando o clippers contra a pele e indo na contramão.
4. Anexar uma agulha 16G para a seringa de 5 mL contendo a suspensão de eritrócitos e injectar 1 mL da suspensão a barriga do músculo do membro posterior do coelho de doadores, aproximadamente 1 cm de profundidade. Certifique-se de guardar o nervo ciático executando dentro de um sulco palpável ao longo do fêmur.
   Nota: VX2 fresco com êxito inocula 88% dos sujeitos enquanto congelado e descongelado VX2 é só sucesso 33% o tempo de¹⁹.
   Atenção: O tumor VX2 crescerá rapidamente. Efeitos secundários que pode-se notar como progride o tumor é: aumento da frequência respiratória, letargia, diminuição da vigilância, e/ou alterações comportamentais (por exemplo, agressividade incomum). Consequentemente, as recomendações são para acompanhar de perto os animais e planejar para colheita de tumor dentro de duas semanas após a inoculação.

2. VX2 membro posterior crescimento do Tumor e da colheita

Nota: Supondo que a inoculação de sucesso, deve haver um palpável nódulo de tumor (3\u20124 cm) no local da injeção dentro de 2 semanas. Geralmente, este nódulo será palpável cerca de 1 semana; no entanto, é melhor deixar o tumor crescer para permitir a coleta de tecido suficiente. Normalmente, este nódulo será firme, endurecido e elevada acima do nível do músculo. Se

1. Apalpar a área inoculada com 2 semanas da inoculação. Se não há crescimento do tumor é detectado em 2 semanas, execute a etapa 1 novamente. Veja a Figura 1.
   Nota: A presença de tumor também pode ser avaliada através de ultra-som. Enquanto não têm havido estudos para avaliar a diferença nos parâmetros de crescimento do tumor quando propagadas de estoque congelado em comparação com o estoque fresco, ele tem sido nossa experiência que o tumor estoque congelado cresce ligeiramente mais lento e será detectável após seu estoque fresco Counter-parte. Independentemente disso, qualquer método deve render um tumor harvestable por 2 semanas.
2. Prepare o doador de tumor do membro posterior para colheita de tumor. Anestesia o coelho com 45 mg/kg quetamina e 5 mg/kg de xilazina. Eutanásia com uma dose intravenosa de (IV) de pentobarbital de sódio superior a 390 mg/kg.
3. Uma vez que o coelho tem sido sacrificado, começa a colheita o tumor, removendo o tecido cutâneo e subcutâneo sobrejacente o nódulo de tumor usando um bisturi com qualquer tamanho de lâmina o pesquisador aprouver. Consulte a Figura 2.
4. Uma vez que o nódulo de tumor foi identificado dentro do músculo do membro posterior, remova o tumor em bloco com margens amplas curvilíneas. Para isso, corte os pontos de fixação tendinosa nas extremidades proximais e distais do do músculo e em seguida trace a lâmina de bisturi ao longo do osso subjacente. Bissetriz do espécime explantado expondo a cápsula do tumor e núcleo necrótico. Veja a Figura 3.
   Nota: O tumor VX2 tem um núcleo altamente necrótico. Não se esqueça de usar proteção apropriada para os olhos e outros equipamentos de proteção individual ao colher o tumor, uma vez que qualquer dano à cápsula do tumor pode resultar em expulsão de alta pressão de detritos necróticos.
5. Raspe suavemente o núcleo necrótico com um objeto pontiagudo (por exemplo, fórceps, hemostatos) para limpar o tumor. Isto deve permitir para melhor visualização da cápsula do tumor e o ponto de transição entre a cápsula e muscular circundante. Consulte a Figura 4.
6. Esta amostra, colher vários pedaços de tumor aproximadamente 1\u20122 mm³ e imediatamente armazená-los em um copo contendo solução salina estéril da temperatura ambiente.
   Nota: Estas amostras de tumor serão usadas para posterior implantação colestase.
7. Coloque o restante do tumor em uma placa de Petri estéril e banhá-lo com o médio modificado águia de Dulbecco (DMEM). Se este espécime é mantido frio no gelo, que pode ser preservado para manipulação até 2\u20123 h mais tarde.

3. fígado Tumor implantação através de laparotomia

1. Prepare o coelho destinatário para laparotomia. Anestesiar o coelho destinatário usando 45 mg/kg de ketamina e xilazina 5 mg/kg para indução seguida de intubação e manutenção com 1%... 3% de isoflurano como necessário. Quando o coelho é anestesiado, raspe o local cirúrgico usando a máquina de cortar cabelo. Limpar a área de incisão usando lavagem de três vias com betadine esfoliante, solução de etanol 70% e solução de betadine e armar o abdômen de forma cirúrgica estéril.
2. Usando uma lâmina #15, inicie a laparotomia por fazer uma pequena incisão vertical para baixo através da pele do coelho, a partir do processo xifoide. Isto deve ser palpado facilmente e tende a ser mais ou menos do tamanho de uma moeda americana. Consulte a Figura 5.
3. Refletir a pele e identificar o linea alba. Isto deve ser uma faixa reflexiva branca de tecido viajando inferiormente na linha média. Usar a dissecção romba para atravessar o linea alba e expor o peritônio. Veja a Figura 6.
   Nota: O peritônio é facilmente identificado desde que irá ser sobrejacente diretamente o intestino, que pode ser visto em movimento com a respiração.
   Atenção: O peritônio tende a ser aderente ao intestino subjacente devido à tensão superficial. Usando o trauma contuso de dissecar o linea alba ajuda a dissipar-se o risco de perfurar o intestino subjacente.
4. Uma vez que o peritônio é exposto, disse cuidadosamente através dele para entrar na cavidade peritoneal. O fígado pode agora ser identificado. Para melhor navegar o espaço abdominal, estenda a linha média incisão 1\u20122 cm inferiormente através da pele, músculo e peritônio.
   Nota: Estender a incisão pode ser facilmente e com segurança feito inserindo cuidadosamente uma pinça hemostática curva o espaço peritoneal com a ponta curva virada superficialmente para o peritônio. Em seguida, abra a pinça hemostática ligeiramente e usar uma lâmina que gira o tecido entre os dois ramos da pinça hemostática.
5. Identifica o lobo esquerdo do fígado a fim de selecionar um site para implantação de tumor. O lobo esquerdo é infero-lateral para o lóbulo que senta-se na linha média.
6. Antes de tentar desenhar o fígado fora do espaço peritoneal, coloque um pedaço seco de gaze na face inferior da incisão.
   Nota: A gaze irá fornecer uma superfície aderente para colocar o fígado para evitar que ele se retrai para o abdômen.
7. Usando Pinças atraumáticas ou um pedaço de gaze molhada sobre os dedos, cuidadosamente desenhar o lobo esquerdo do fígado fora do abdômen através da incisão e colocá-la na gaze seca colocado anteriormente. Veja a Figura 7.
   Atenção: A cápsula do fígado é sensível e pode facilmente ruptura. É fundamental para o cuidado ao manusear este órgão para evitar hemorragia capsular, hematomas hepática e/ou eventual hemoperitônio.
   Nota: Normalmente, o fígado irá declarar se visualmente ao entrar no espaço peritoneal; no entanto, se o estômago do coelho é distendido, o fígado pode ser empurrado cranialmente fora de vista. Se este for o caso, levante suavemente a parede abdominal, utilizando uma sonda sem corte. Nesse cenário, o fígado tende a aderir à face ventral do diafragma devido à tensão de superfície tão cuidadosamente separada do fígado usando uma sonda sem corte e isso deve desanexar. Em seguida, use Pinças atraumáticas para tirar o fígado.
8. Neste momento, a preparar o tecido do tumor para implantação e coloque um pedaço de gaze molhada sobre o fígado para protegê-lo.
9. Selecione uma 1\u20122 peça de³ mm de tecido do tumor que foi gerado durante a etapa de 2.6 para implantação no fígado. Consulte a Figura 8.
10. Usando uma #11-lâmina, perfure o tecido do fígado em um ângulo de 45°, fazendo um bolso profundo de 0,5 cm, tomando cuidado para não penetrar o aspecto dorsal da cápsula do fígado. Deixe a lâmina no lugar depois de fazer a punção. Consulte a Figura 9.
11. Levante suavemente a lâmina no sentido ventral para criar uma pequena bolsa no fígado. Pegue o pedaço de tumor usando fórceps, coloque o pedaço de tumor neste bolso e remover a lâmina.
    Nota: A lâmina pode ser removida antes de inserir o pedaço do tumor, no entanto, o fígado vai sangrar e isto pode obscurecer o local de punção, tornando difícil de identificar.
    Atenção: Certifique-se minimizar o contato do tumor com qualquer outras estruturas para evitar a propagação do tumor não intencional. Isto também pode ser evitado por deixando de lado todas as ferramentas utilizadas para auxiliar com implantação depois.
12. Neste ponto, coloque um pedaço de agente hemostático, tais como gel de espuma, sobre o bolso do tumor para promover hemostasia e prevenir a ejeção da peça tumor.
13. Retorne o fígado no abdômen, uma vez confirmada a hemostase.
14. Perto da parede abdominal com 3-0 polydioxanone sutura numa agulha cónica usando um simples contínuo suturar e fechar a pele com 4-0 Poliglactina 910 fios de sutura em uma agulha de corte usando ponto subcuticular contínua.
    Cuidado: Quando o fechamento da parede abdominal, tomar cuidado para não danificar o omento ou outras estruturas do intestino em um lance de sutura.
    Nota: Enquanto este tumor vai levar pelo menos 2 semanas para ser definitivamente radiograficamente identificáveis, atinge um tamanho de 1.5\u20122 cm de diâmetro com 3 semanas de crescimento. Tenha cuidado para não permitir que o tumor hepático que superar 3.5\u20124 semanas desde que o tumor irá formar uma exofíticas massa e agressivamente espalhar localmente.

4. VX2 Tumor suspensão preparação

1. Coloque um filtro de 40 µm para a boca de um tubo de propileno Erlenmeyer de 50 mL. Usando o tumor da etapa 2.7, use uma #15-lâmina para raspar a superfície do tumor para coletar tumor viável e coloque estes raspagens no filtro.
2. Lave as raspas de tumor viável através de um filtro usando DMEM e centrifugar o tubo de propileno a 1600 rpm por 8 min.
3. Após a centrifugação estiver concluída, retire o sobrenadante e descartá-lo. Em seguida, adicione metilcelulose para o bloco de celas restantes na proporção volumétrica de 1:1.
4. Injete esta suspensão em um coelho de doador do membro posterior seguindo passos 1.3\u20121.4. Coloque a restante suspensão em alíquotas de 1 mL em tubos criogênicos e congelá-los em nitrogênio líquido para uso posterior.

5. angiográfica utilização do VX2 Tumor no fígado

1. Prepare o coelho como descrito no passo 3.1.
2. Palpe o sulco femoral na virilha. Quando o sulco foi identificado, fazer uma incisão linear cm de 2\u20123 ao longo do sulco. Veja a Figura 10.
3. Com dissecção romba, localizar e isolar o fêmur bundle que contém o nervo, artéria e veia femoral. Veja a Figura 11.
4. Novamente, use a dissecção romba para separar a artéria femoral do resto das estruturas no pacote e isolar a artéria no topo de uma alça para bisturi. Veja a Figura 12.
5. Com um kit de 3-francês introdutor, utilizam a técnica de Seldinger para aceder com uma agulha. Introduza um fio-guia e remova a agulha para avançar a bainha 3-francês no vaso. Consulte a Figura 13.
   Atenção: Evite usar força excessiva no avanço da bainha 3-francês, pois isso pode resultar em transecção da artéria femoral.
6. Sob orientação fluoroscópica e usando um cateter, fio guia e agente de contraste de iohexol, selecionar para o tronco celíaco — normalmente localizado no nível T12 — e, em seguida, avance o cateter na artéria hepática esquerda via comum hepática e adequada hepática.
7. Neste ponto, administre o agente de escolha através do cateter. Uma vez que o agente é administrado, remova o cateter.
8. Usando sutura de seda 3-0, ligate a artéria femoral proximal e distal ao ponto de inserção da bainha. Não se esqueça de apertar o nó proximal da bainha, enquanto sua retirada para evitar sangramento.
9. Feche a incisão na virilha com 4-0 Poliglactina 910 fios de sutura em uma agulha de corte usando um ponto subcuticular.
10. Manter o padrão pós-operatória cuidados e monitor recuperação animal. Realizar eutanásia e necrópsia conforme necessário usando as técnicas padrão.

Resultados

Quando olhar para a Figura 1, é claro que o joelho do coelho é ampliado. Além disso, vários pequenos nódulos discretos, correlacionando-se com o crescimento do tumor através da fáscia, normalmente são visíveis. Após palpação, no membro injetado deve aparecer do que o membro não injectada. Se um pesquisador exige garantia mais definitiva da presença do tumor, a ultra-sonografia pode ser usada para identificar o tumor incorporado no músculo. Se n...

Discussão

O primeiro passo crítico na metodologia de tumor VX2 é propagação bem sucedida de um tumor no membro hind de um coelho de doador. Referem-se ao primeiro parágrafo na seção "Representante resultados" para obter mais informações sobre esta etapa.

O próximo passo crítico é assegurar que a cápsula do tumor viável é devidamente identificada. Não somente isto será necessário para a preparação de suspensão de tumor, mas também é importante para a seleção e gerando pedaços de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
MethoCult (Methycellulose)	Stemcell Technologies	M3134
VX2 Cell Line	NCI	VX-2
5 mL Syringe	BD	309646
16 G Needle	BD	305197
22 G Needle	BD	305155
Hair Clippers	Wahl	41870-0438
Foam Insulated Box	Mr. Box Online	10 x 10 x 4
Acepromazine	Henry Schein	003845
Buprenorphine	Par	42023-179-05
Meloxicam	Henry Schein	049755
Alcohol Pads	Covidien	5033
Ketamine	Henry Schein	056344
Xylazine	Akorn	59399-110-20
Pentobarbital (Fatal-Plus)	Vortech	9373
Sterile Petri Dish	Thermo Fisher	172931
DMEM	Gibco	11965092
Saline	Baxter	2F7124
15-Blade	Steris	02-050-015
Scalpel Handle x 2	Steris	22-2381
Curved Hemostat	WPI	501288
Atraumatic Forceps	Sklar	52-5077
Gauze	Medline	NON21430LF
11-Blade	Steris	02-050-011
Surgicel	Ethicon	1951
3-0 PDS / Taper	Ethicon	Z305H
4 - 0 Vicryl / Cutting	Ethicon	J392H
40 μm strainer	BD	352340
50 mL conical tube	Thermo Fisher	339652
plastic pipette	Thomas Scientific	HS206371B
Centrifuge	Sorvall	75004240
1.40 mL Tubes (Internal Thread)	Micronic	MP32131-Z20
3-F VSI Micro-HV Introducer Kit	Vascular Solutions	Custom Order (P15180391)
.018 45° angle glidewire	Terumo	RG*GA1818SA
Direxion bern-shape microcatheter	Boston Scientific	M001195230
Omnipaque	GE	Y510