Entwicklung und angiographischen Umgang mit dem Kaninchen VX2 Modell für Leberkrebs

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Artikels ist eine Grundierung für die Entwicklung und Nutzung des Modells VX2 Karzinom Kaninchen für Leberkrebs zu.

Zusammenfassung

Die Kaninchen VX2 Tumor ist ein Tiermodell für translationale Forschung in Bezug auf das Leberzellkarzinom (HCC) auf dem Gebiet der interventionellen Radiologie häufig genutzt. Dieses Modell setzt ein Anaplastischer Squamous Zelle Krebsgeschwür, das einfach und zuverlässig in der Skelettmuskulatur Spender Kaninchen für die spätere Ernte und Allograft Implantation in die Leber der naive Empfänger weitergegeben wird. Dieser Tumor Transplantat wächst schnell in der Leber des Empfängers Kaninchen in eine angiographisch identifizierbaren Tumor zeichnet sich durch einen nekrotischen Kern, umgeben von einer lebensfähigen Hypervascular Kapsel. Die physische Größe der Kaninchen Anatomie ist ausreichend, vaskuläre Instrumentierung, die Anwendung und Erprobung verschiedener interventionelle Techniken zu erleichtern. Trotz dieser Vorteile gibt es einen Mangel an technischen Ressourcen als ein konkreter Verweis für Forscher, die mit dem Modell arbeiten dienen. Hier präsentieren wir Ihnen eine umfassende visuelle Gliederung für die technischen Aspekte der Entwicklung, Wachstum, Ausbreitung und angiographischen Verwendung des Kaninchen VX2 Tumor Modells für Anfänger und erfahrene Forscher gleichermaßen.

Einleitung

Das Kaninchen VX2 Tumor Modell spielte eine Rolle in der experimentellen Onkologie seit seiner Entwicklung im Jahre 1935^1,2. Dieser Tumor ist eine virusbedingte anaplastische Plattenepithelkarzinom gekennzeichnet durch Hypervascularity, schnelles Wachstum und einfache Vermehrung im skelettartigen Muskel^3,4. Während das Kaninchen VX2-Tumor-Modell verwendet worden ist, zu untersuchen, eine Vielzahl von Krebserkrankungen^5,6,7,8; der Schwerpunkt dieses Artikels ist Leberkrebs⁹.

Die beschriebene Methode soll präsentieren ein Modell für primären Leberkrebs oder hepatozellulären Karzinom (HCC), die von interventionellen Radiologen für die translationale Forschung genutzt werden kann. Es kann für ablative Methode testen^{10,11,12,13,14,15}pharmakokinetischen Studien und therapeutische Untersuchungen verwendet werden.

Die Methode hier detaillierte bringt mehrere Vorteile gegenüber anderen Modellen im gleichen Rahmen wie Nager-Modelle wie Ratten, Mäuse, und Waldmurmeltiere oder größere Modelle wie Primaten¹⁶. Einer der wichtigsten Vorteile ist die schnelle und zuverlässige Tumorwachstum ermöglicht es Forschern, eine aktiven Tumor-Linie innerhalb eines Monats nach der ersten Hind Gliedmaßen Ausbreitung¹⁷zu etablieren. Darüber hinaus hat dieser Tumor einfach sonographische Sichtbarkeit und eine Hypervascular-Peripherie die Transarterial locoregionaler Behandlungen und ablative Therapien ermöglicht. Schließlich, und vor allem erlaubt die Größe des Gefäßsystems Kaninchen möglich und technisch einfache Nutzung der vaskulären Instrumentierung¹⁸.

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Protokoll

Das folgende Protokoll folgt alle Anforderungen und Richtlinien, die den Auftrag von der University of Illinois - Chicago. Es wurde überprüft und genehmigt von den örtlichen institutionelle Animal Care und Use Committee vor der Ausführung.

(1) VX2 Hind Gliedmaßen Tumorentwicklung

1. VX2 Tumor-Zell-Linie aus der National Cancer Institut Division der Behandlung Krebsdiagnose und Behandlung Tumorzelle/Linie Repository zu beschaffen.
   Hinweis: Zu diesem Zeitpunkt die Bestellung Katalog finden Sie unter folgendem Link: https://dtp.cancer.gov/repositories/.
2. Um die Zellsuspension Injektion vorzubereiten, legen Sie das gefrorene VX2 Probe und Methylcellulose Medium in lauwarmem Wasser bis sie aufgetaut haben.
   1. Aspirieren Sie 0.5\u20121 mL die aufgetauten Zellsuspension und ein gleiches Volumen der aufgetauten Methylcellulose Medium in eine 5 mL Spritze.
      Hinweis: Es kann helfen, ein 21 oder 22 G Nadel aspirieren Sie die Zellsuspension und eine größere Gauge-Nadel aspirieren Sie die Methylcellulose-Medium verwenden. Legen Sie die Spritzen auf Eis.
3. Vorbereiten des hinteren Gliedmaßen Tumor Spenders Kaninchen Inokulation der Zellsuspension, beginnend mit Sedierung mit 1 mg/kg Acepromazine und 0,02 mg/kg Buprenorphin intramuskulär gegeben. Rasieren Sie die Impfung Website (Hind Gliedmaßen) mit Klipper und sauber, die mit einem Alkohol oder Jod-basierten Agenten die rasiert sind.
   Hinweis: Meloxicam kann bei einer Dosis von 0,2 mg/kg subkutan für Analgesie gegeben werden. Kaninchenfell ist schwierig zu rasieren. Es wird empfohlen, dass die Forscher mehrere Durchgänge, führen Sie zunächst mit Schwerpunkt auf clearing ein Großteil des Fells die Clippers gegen die Haut drücken und gegen den Strich gehen.
4. Die 5-mL-Spritze mit der Zellsuspension beimessen Sie eine 16 G-Nadel und Spritzen Sie 1 mL der Suspension in den Bauch der hinteren Gliedmaßen Muskulatur das Spender-Kaninchen, etwa 1 cm tief. Achten Sie darauf, den Ischiasnerv läuft in eine tastbare Nut entlang der Oberschenkel zu schützen.
   Hinweis: Frische VX2 inoculates 88 % der Patienten erfolgreich, während eingefroren und aufgetaut VX2 nur erfolgreiche 33 % der Zeit¹⁹.
   Achtung: Der VX2 Tumor wächst schnell. Nebenwirkungen, die beachtet werden können, da im Laufe des Tumors sind: erhöhte Atemfrequenz, Lethargie, verminderte Aufmerksamkeit und/oder Verhaltensänderungen (z.B., ungewöhnliche Aggressivität). Infolgedessen sind Empfehlungen, die Tiere genau zu überwachen und für Tumor Ernte innerhalb von zwei Wochen nach der Inokulation zu planen.

(2) VX2 Hind Gliedmaßen Tumorwachstum und Ernte

Hinweis: Angenommen, erfolgreiche Impfung, es soll eine spürbar (3\u20124 cm) Tumor Knötchen an der Einstichstelle innerhalb von 2 Wochen. In der Regel wird diese Knötchen spürbar etwa 1 Woche sein; Es ist jedoch besser, wenn den Tumor wachsen, um ausreichend Gewebe Sammlung zu ermöglichen. In der Regel werden diese Knötchen fest, indurierte und erhaben über das Niveau des Muskels. If

1. Ertasten der inokulierten Bereich in 2 Wochen nach Impfung. Wenn kein Tumorwachstum in 2 Wochen erkannt wird, führen Sie Schritt 1 erneut. Siehe Abbildung 1.
   Hinweis: Das Vorhandensein des Tumors kann auch per Ultraschall beurteilt werden. Zwar gibt es keine Studien zur Bewertung des Unterschied im Tumor Wachstum Metriken aus gefrorenen bestand im Vergleich zu frischer Vorrat weitergegeben noch, es ist unsere Erfahrung, die der gefrorenen Lager Tumor etwas langsamer wächst gewesen und werden nach ihrer frischer Vorrat nachweisbar Gegenstück. Unabhängig davon, sollte entweder-Methode einen erntereifen Tumor von 2 Wochen liefern.
2. Vorbereiten des hinteren Gliedmaßen Tumor Spenders für Tumor-Ernte. Die Kaninchen mit 45 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin zu betäuben. Mit eine intravenöse (IV) Dosis von mehr als 390 mg/kg Natrium-Pentobarbital einschläfern.
3. Sobald die Kaninchen eingeschläfert worden, beginnen Sie Ernte des Tumors durch das Entfernen der kutanen und subkutanen Gewebes über dem Tumor Knötchen mit einem Skalpell mit welcher Größe Klinge der Forscher für richtig hält. Siehe Abbildung 2.
4. Nachdem der Tumor-Knoten innerhalb der hinteren Gliedmaßen Muskel identifiziert wurde, der Tumor en bloc mit weit geschwungenen Ränder entfernen. Hierzu schneiden die sehnige Befestigungspunkte an den proximalen und distalen Enden der den Muskel und dann Spur der Skalpellklinge entlang den darunter liegenden Knochen. Halbieren der explantierten Probe Tumor Kapsel und nekrotischen Kern aufzudecken. Siehe Abbildung 3.
   Hinweis: Die VX2 Tumor hat einen höchst nekrotischen Kern. Achten Sie darauf, richtige Augenschutz und sonstige persönliche Schutzausrüstung verwenden, wenn den Tumor zu ernten, da Schäden an den Tumor Kapsel Hochdruck Auswurf des nekrotischen Ablagerungen führen kann.
5. Reiben Sie sanft die nekrotischen Kern mit einem stumpfen Gegenstand (z. B. Pinzetten, Hämostatika), um den Tumor zu reinigen. Dies sollte zur besseren Visualisierung der Tumor Kapsel und den Übergangspunkt zwischen Kapsel und umliegenden Muskel ermöglichen. Siehe Abbildung 4.
6. Aus diesem Beispiel Ernte mehrere Stücke des Tumors ca. 1\u20122 mm³ und sofort in eine Tasse mit Raumtemperatur sterile Kochsalzlösung aufbewahren.
   Hinweis: Diese Tumorproben werden für die nachfolgenden intrahepatischen Implantation verwendet werden.
7. Legen Sie die verbleibenden Tumor in eine sterile Petrischale und Baden sie mit Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM). Wenn dieses Exemplar auf Eis kalt gehalten wird, kann es für den Umgang mit bis zu 2\u20123 h später beibehalten werden.

(3) Lebertumor Implantation über Laparotomie

1. Bereiten Sie die Empfänger Kaninchen für Laparotomie. Der Empfänger Kaninchen mit 45 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin zu betäuben für Induktion gefolgt von Intubation und Wartung mit 1 % - 3 % Isofluran als benötigt. Wenn die Kaninchen betäubt ist, Rasieren der Operationsstelle mit Haarschneidemaschinen. Reinigen Sie die Schnitt-Bereich mit dreifacher waschen mit Betadine Scrub, 70 % Ethanol Lösung und Betadine Lösung und Drapieren Sie das Abdomen in einem sterilen chirurgischen Mode.
2. Mit einem #15-Klinge, die Laparotomie initiieren Sie, indem ein kleiner nach unten vertikale Mittellinie Schnitt durch das Kaninchen Haut ab dem Xiphoid Prozeß zu machen. Dies sollte leicht palpiert und neigt dazu, etwa die Größe von einem amerikanischen Penny. Siehe Abbildung 5.
3. Die Haut zu reflektieren und identifizieren die Linea Alba. Dies sollte eine reflektierende weiße Band des Gewebes in der Mittellinie inferior unterwegs sein. Verwenden Sie stumpfe Dissektion, durchqueren die Linea Alba und setzen das Bauchfell. Siehe Abbildung 6.
   Hinweis: Das Peritoneum ist leicht zu erkennen da es direkt im Darm überlagert wird die Bewegung mit der Atmung zu sehen ist.
   Achtung: Das Peritoneum tendenziell an den zugrunde liegenden Darm aufgrund der Oberflächenspannung. Mit stumpfem Trauma um zu sezieren die Linea Alba hilft, das Risiko einer Perforation des zugrunde liegende Darms zu zerstreuen.
4. Sobald das Peritoneum ausgesetzt ist, sorgfältig durch die Bauchhöhle treten zu sezieren. Die Leber kann jetzt identifiziert werden. Um den Bauchraum besser navigieren zu können, erweitern Sie die Mittellinie Schnitt 1\u20122 cm inferior durch die Haut, Muskel und Bauchfell.
   Hinweis: Verlängerung des Mittellinie Schnittes kann einfach und sicher erfolgen durch sorgfältig einsetzen eine gebogene Gefäßklemme in den peritonealen Raum mit der gebogenen Spitze zugewandten oberflächlich das Bauchfell. Dann öffnen Sie die Gefäßklemme etwas und verwenden Sie einer Klinge zu niedlich das Gewebe zwischen den beiden Armen der Gefäßklemme.
5. Den linken Lappen der Leber zu identifizieren, um eine Site für die Tumor-Implantation auswählen. Der linke Lappen ist Infero-Lateral an der medialen Lappen, die in der Mittellinie sitzt.
6. Legen Sie bevor Sie versuchen, die Leber aus dem peritonealen Raum ziehen ein trockenes Stück Gaze an der minderwertigen Aspekt des Schnittes.
   Hinweis: Die Gaze erhalten eine anhaftende Oberfläche die Leber auf zu legen, um zu verhindern, zurück in die Bauchhöhle zurückziehen.
7. Mit atraumatische Pinzette oder einem Stück nasse Gaze über die Finger, sorgfältig zeichnen Sie den linken Leberlappen aus dem Bauch durch die Inzision und legen Sie es auf die trockene Gaze früher gelegt. Siehe Abbildung 7.
   Achtung: Die Leber Kapsel ist empfindlich und kann leicht Bruch. Es ist entscheidend, sanft im Umgang mit dieser Orgel um Kapsel bluten, Leber Blutergüsse und/oder eventuelle Hemoperitoneum zu verhindern.
   Hinweis: In der Regel wird die Leber selbst visuell erklären, beim Eintritt in des peritonealen Raumes; jedoch wenn das Kaninchen Magen aufgebläht ist, kann die Leber cranially aus Anblick heraus geschoben werden. Wenn dies der Fall ist, heben Sie vorsichtig die Bauchdecke mit einer stumpfen Sonde. In diesem Szenario die Leber tendenziell die Leber mit einer stumpfen Sonde an der ventralen Aspekt des Zwerchfells aufgrund der Oberflächenspannung so sorgfältig getrennt zu halten und es sollte zu lösen. Verwenden Sie atraumatische Pinzette, um die Leber herauszuziehen.
8. An dieser Stelle das Tumorgewebe zur Implantation vorbereitet und legen Sie ein Stück nasse Gaze über die Leber zu schützen.
9. Wählen Sie ein 1\u20122 mm³ Stück von Tumor-Gewebe, das während Schritt 2.6 für die Implantation in die Leber generiert wurde. Siehe Abbildung 8.
10. Stechen Sie mit einem #11-Klinge, das Lebergewebe in einem 45°-Winkel machen eine 0,5 cm Tiefe Tasche, kümmert sich nicht um den dorsalen Aspekt der Leber Kapsel zu durchdringen. Lassen Sie die Klinge nach der Punktion machen. Siehe Abbildung 9.
11. Heben Sie vorsichtig die Klinge in einer ventralen Richtung, eine kleine Tasche in der Leber Bett zu schaffen. Nehmen Sie die Tumor-Stück mit Pinzette, legen Sie den Tumor in dieser Tasche und dann entfernen Sie die Klinge.
    Hinweis: Die Klinge vor dem Einfügen der Tumor Stück entfernt werden, jedoch die Leber wird bluten und das verdecken kann die Punktionsstelle, so dass es schwer zu erkennen.
    Achtung: Achten Sie darauf, Kontakt des Tumors mit anderen Strukturen zu verhindern unbeabsichtigtes Tumor Aussaat zu minimieren. Dies kann auch durch werkzeuglos genutzt, um mit Implantation danach beiseite vermieden werden.
12. An dieser Stelle legen Sie ein Stück der blutstillende Mittel, wie Gel-Schaum über die Tumor-Tasche zur Förderung der Blutstillung und Auswurf des Stückes Tumor zu verhindern.
13. Die Leber auf den Bauch zurück, sobald Blutstillung bestätigt wird.
14. Schließen Sie die Bauchdecke mit 3-0 Polydioxanon Naht auf eine konische Nadel mit einem einfachen kontinuierlichen Nähen und schließen Sie die Haut mit 4: 0 Polyglactin 910 Nähte auf einer schneiden Nadel mit kontinuierlicher Subcuticular Stich.
    : Wenn die Bauchdecke schließen, Vorsicht um nicht zu beschädigen das Omentum oder andere Darm-Strukturen in einer Naht werfen.
    Hinweis: Dieser Tumor dauert mindestens 2 Wochen endgültig röntgenologisch erkennbar sein sollen, erreicht er eine Größe von 1.5\u20122 cm Durchmesser bei 3 Wochen des Wachstums. Achten Sie darauf, nicht zuzulassen, die hepatischen Tumor, vorbei an 3.5\u20124 Wochen wachsen, da der Tumor eine Exophytic Masse und aggressiv verbreiten vor Ort bilden wird.

(4) VX2 Tumor Suspension Vorbereitung

1. Platzieren Sie ein 40 µm-Sieb in den Mund einer 50 mL konische Propylen-Röhre. Mit der Tumor aus Schritt 2.7, verwenden Sie eine #15-Klinge, kratzen die Tumor-Oberfläche, um tragfähige Tumor zu sammeln und legen Sie diese scharren in das Sieb.
2. Tragfähige Tumor scharren durch ein Sieb mit DMEM waschen und dann das Propylen-Rohr auf 1600 u/min für 8 min zentrifugieren.
3. Nach Abschluss die Zentrifuge wird den Überstand zu entfernen und entsorgen. Fügen Sie Methylcellulose die restlichen Zellenblock an einem Volumenverhältnis von 1:1.
4. Injizieren Sie diese Aussetzung in ein Hind Gliedmaßen Spender Kaninchen folgende Schritte 1.3\u20121.4. Legen Sie die restlichen Aussetzung in 1 mL Aliquots in kryogenen Röhren und Einfrieren in flüssigem Stickstoff für die spätere Verwendung.

(5) angiographischen Nutzung der VX2 Lebertumor

1. Bereiten Sie die Kaninchen wie unter Punkt 3.1 beschrieben.
2. Ertasten der femoralen Nut in der Leistengegend. Wenn die Nut identifiziert wurde, machen Sie einen 2\u20123 cm linearen Schnitt entlang der Nut. Siehe Abbildung 10.
3. Stumpfe Dissektion verwenden, suchen Sie und isolieren Sie die femorale Bündel mit der femoralen Vene, Arterie und Nerv. Siehe Abbildung 11.
4. Wiederverwenden Sie stumpfe Dissektion zu trennen die Femoral Arterie vom Rest der Strukturen im Bundle und die Arterie auf einem Skalpell Griff zu isolieren. Siehe Abbildung 12.
5. Nutzen Sie mit einem 3-Französisch Einführhilfe Kit die Seldingertechnik-Technik, um mit einer Nadel zuzugreifen. Legen Sie ein Führungsdraht und entfernen Sie die Nadel um die 3-Französisch-Hülle in das Gefäß zu gelangen. Siehe Abbildung 13.
   Achtung: Vermeiden Sie übermäßige Kraft bei der Weiterentwicklung der 3-Französisch-Mantel, da dies Durchtrennung der Femoral Arterie führen kann.
6. Unter Röntgendurchleuchtung Anleitung und mit einem Katheter, Führungsdraht und Iopamidol Kontrastmittel, wählen Sie für die Zöliakie Stamm – befindet sich in der Regel auf die T12-Ebene — und dann den Katheter in die linke hepatische Arterie über das gemeinsame hepatische und ordnungsgemäße hepatische.
7. An dieser Stelle das Mittel der Wahl durch den Katheter zu verwalten. Sobald der Agent verwaltet wird, entfernen Sie den Katheter.
8. Mit 3: 0 Seide Naht, verbinden Sie die Femoral Arterie proximal und distal am Einfügepunkt des Mantels. Achten Sie darauf, den Knoten proximal zu den Mantel anziehen, wie es genommen wird, um Blutungen zu verhindern.
9. In der Nähe des Leiste Schnittes mit 4: 0 Polyglactin 910 Nähte auf einer Schnitt-Nadel mit einem Subcuticular Stich.
10. Pflegen Sie standard postoperative Pflege und Monitor Tier Erholung. Führen Sie Euthanasie und Autopsie nach Bedarf mit standard-Techniken.

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Ergebnisse

Bei der Betrachtung der Abbildung 1ist es klar, dass der quadriceps des Kaninchens vergrößert wird. Darüber hinaus sind mehrere kleine diskrete Knötchen, in der Regel korrelieren mit Tumorwachstum durch die Faszie sichtbar. Bei Palpation erscheint das eingespritzte Glied als das Glied nicht injiziert. Wenn ein Forscher mehr endgültige Gewissheit, Tumor-Präsenz erforderlich ist, kann Ultraschall-Bildgebung verwendet werden, um den Tumor, eingebettet in d...

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Diskussion

Der erste wichtige Schritt in der VX2 Tumor Methodik ist erfolgreiche Ausbreitung eines Tumors in der hinteren Extremität eines Spenders Hasen. Beziehen sich auf den ersten Absatz im Abschnitt "Vertreter Ergebnisse" für weitere Informationen zu diesem Schritt.

Der nächste entscheidende Schritt besteht darin, die tragfähige Tumor Kapsel richtig erkannt wird. Nicht nur wird dieser Tumor Aussetzung Vorbereitung nötig sein, aber es ist auch wichtig für die Auswahl und Erzeugung von Tumor-St?...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
MethoCult (Methycellulose)	Stemcell Technologies	M3134
VX2 Cell Line	NCI	VX-2
5 mL Syringe	BD	309646
16 G Needle	BD	305197
22 G Needle	BD	305155
Hair Clippers	Wahl	41870-0438
Foam Insulated Box	Mr. Box Online	10 x 10 x 4
Acepromazine	Henry Schein	003845
Buprenorphine	Par	42023-179-05
Meloxicam	Henry Schein	049755
Alcohol Pads	Covidien	5033
Ketamine	Henry Schein	056344
Xylazine	Akorn	59399-110-20
Pentobarbital (Fatal-Plus)	Vortech	9373
Sterile Petri Dish	Thermo Fisher	172931
DMEM	Gibco	11965092
Saline	Baxter	2F7124
15-Blade	Steris	02-050-015
Scalpel Handle x 2	Steris	22-2381
Curved Hemostat	WPI	501288
Atraumatic Forceps	Sklar	52-5077
Gauze	Medline	NON21430LF
11-Blade	Steris	02-050-011
Surgicel	Ethicon	1951
3-0 PDS / Taper	Ethicon	Z305H
4 - 0 Vicryl / Cutting	Ethicon	J392H
40 μm strainer	BD	352340
50 mL conical tube	Thermo Fisher	339652
plastic pipette	Thomas Scientific	HS206371B
Centrifuge	Sorvall	75004240
1.40 mL Tubes (Internal Thread)	Micronic	MP32131-Z20
3-F VSI Micro-HV Introducer Kit	Vascular Solutions	Custom Order (P15180391)
.018 45° angle glidewire	Terumo	RG*GA1818SA
Direxion bern-shape microcatheter	Boston Scientific	M001195230
Omnipaque	GE	Y510