개발 및 간 암에 대 한 토끼 VX2 모델의 Angiographic 사용

요약

이 문서의 목표는 개발 및 간 암에 대 한 VX2 암 토끼 모델의 사용에 대 한 입문서를 제공 하는입니다.

초록

토끼 VX2 종양 간세포 암 (HCC) 중재 방사선과의 분야에 관한 조사에 변환에 대 한 일반적으로 활용 하는 동물 모델입니다. 이 모델은 쉽고 안정적으로 최종 수확 및 이식 이식 간으로 순진한 받는 사람에 대 한 기증자 토끼의 골격 근육에서 전파를 하다 편평 세포 암 종을 사용 합니다. 이 종양 이식 가능한 hypervascular 캡슐에 의해 포위 하는 괴 사 성 코어 특징 angiographically 식별 종양으로 받는 사람 토끼의 간 내에서 급속 하 게 성장. 토끼 해부학의 실제 크기는 혈관 계측 응용 프로그램에 대 한 허용 하 고 다양 한 중재 기법의 테스트를 용이 하 게 하기에 충분. 이러한 장점에도 불구 하 고 연구자는 모델 작업에 대 한 구체적인 기준으로 행동 기술 자원의 소수를 존재 합니다. 여기, 우리는 개발, 성장, 전파, 그리고 초보자와 경험이 풍부한 연구자 모두에 의해 사용 하기 위해 토끼 VX2 종양 모델의 angiographic 활용의 기술적 측면에 대 한 포괄적인 시각적 개요를 제시.

서문

토끼 VX2 종양 모델 1935^1,2의 개발 이후 실험 종양에서 역할을 담당해 왔습니다. 이 종양은는 바이러스 유도 하다 편평 세포 암 종 hypervascularity, 급속 한 성장, 및 골격 근육^3,4에 쉽게 전파 특징. 토끼 VX2 종양 모델 다양 한 암^5,6,,78;를 조사 하기 위해 사용 되었다 이 문서의 초점은 간 암^9입니다.

설명 하는 방법의 목적은 기본 간 암, 또는 간세포 암 (HCC), 번역 상 연구에 대 한 중재 방사선에 의해 사용할 수 있는 모델을 제시 하는 것입니다. 그것은 pharmacokinetic 연구, 치료 조사 및 테스트^{10,11,12,13,,1415}절제 방법 사용할 수 있습니다.

여기 상세한 메서드 생성, 쥐 같은 설치류 모델 등 같은 영역 내에서 다른 모델에 비해 여러 장점이 쥐, 및 woodchucks, 또는 대주교¹⁶같은 큰 모델. 주요 이점 중 하나는 첫 번째 뒷 다리 전파¹⁷개월 이내 활성 종양 라인을 설정 하는 연구를 수 있는 신속 하 고 신뢰할 수 있는 종양 성장 이다. 또한,이 종양 간단 sonographic 가시성 및 hypervascular 주변 transarterial locoregional 치료와 절제 치료 수 있다. 마지막으로, 그리고 가장 중요 한 것은, 토끼 맥 관 구조 크기 혈관 계측¹⁸의 가능 하 고 기술적으로 쉬운 사용을 허용합니다.

프로토콜

다음 프로토콜 다음과 모든 요구 사항 및 지침-일리노이의 대학에 의해 위임 된 시카고. 그것은 검토 하 고 실행 하기 전에 로컬에서 기관 동물 관리 및 사용 위원회 승인.

1. VX2 뒷 다리 종양 개발

1. 국립 암 연구소 사단의 암 치료 진단 및 치료 종양/셀 라인 저장소에서 VX2 종양 세포 라인을 조달.
   참고:이 시점에서 주문 카탈로그에서 찾을 수 있습니다 다음 링크: https://dtp.cancer.gov/repositories/.
2. 그들은 해 동 때까지 세포 현 탁 액 분사를 준비 하려면 미지근한 물에 냉동된 VX2 샘플 및 스 매체를 놓습니다.
   1. 5 mL 주사기로 해 동된 세포 현 탁 액의 0.5\u20121 mL 및 해 동된 스 매체의 동일한 볼륨을 발음.
      참고: 그것은 발음 셀 서 스 펜 션에 21 또는 22 G 바늘을 사용 하 여 더 큰 계기 바늘 스 중간 발음을 하는 데 도움이 있습니다. 얼음에 주사기를 놓습니다.
3. 세포 현 탁 액, 1 mg/kg acepromazine 및 피하 주어진 0.02 mg/kg buprenorphine 사용 하 여 진정으로 시작의 접종에 대 한 뒷 다리 종양 기증자 토끼를 준비 합니다. 클리퍼 스와 함께 접종 사이트 (뒷 다리)를 면도 하 고 알코올 또는 요오드 기반 에이전트와 청소는 면도 있다.
   참고: Meloxicam 주어질 수 있다 0.2 mg/kg의 복용량에 피하 진통에 대 한. 토끼 털은 면도 어렵다. 연구원 먼저 모피의 일괄 삭제 하 고 피부에 대 한가 위를 눌러 성미가에 초점을 맞추고 여러 개의 패스 수행 하는 것이 좋습니다.
4. 세포 현 탁 액을 포함 하는 5 mL 주사기에 16 G 바늘을 연결 하 고는 서 스 펜 션의 1 mL에 주입 기증자 토끼의 뒷 다리 근육의 배 약 1 cm 깊은. 좌 골 신경 대 퇴 골을 따라 만져 서 홈 내에서 실행을 감시 해야 합니다.
   참고: 냉동 및 해 동 VX2 시간¹⁹의 성공적인 33%만 동안 신선한 VX2는 성공적으로 과목의 88%를 접종.
   주의: VX2 종양은 빠르게 성장할 것 이다. 종양 진행으로 지적 될 수 있습니다: 증가 호흡 비율, 혼 수, 감소 경보, 또는 행동 변화 (예를 들어, 특이 한 공격). 따라서, 권고는 동물을 밀접 하 게 모니터링 하 고 접종 후 2 주 이내 종양 수확에 대 한 계획 이다.

2. VX2 뒷 다리 종양 성장과 수확

참고: 가정 성공적인 접종, 이어야 한다는 만져 서 2 주 이내 주사 사이트에서 (3\u20124 cm) 종양 결 절. 일반적으로,이 결 절 만져 서 1 주 것; 그러나, 충분 한 조직 컬렉션 수 있도록 성장 하는 종양에 게 낫다. 일반적으로,이 결 절 회사, indurated, 및 근육의 수준 보다 높은 것입니다. 경우

1. 접종 2 주에 접종된 영역을 만져. 종양 성장이 감지 되 면 2 주, 1 단계를 다시 수행 합니다. 그림 1을 참조 하십시오.
   참고: 종양의 존재도 초음파를 통해 평가 될 수 있습니다. 신선한 주식에 비해 냉동된 주식에서 전파 될 때 종양 성장 통계에 차이 평가 하기 위해 아무 연구 되었습니다, 그것 우리의 경험 냉동된 재고 종양 약간 느리게 성장 하 고 신선한 주식 후 감지 될 것 이다 카운터 부분입니다. 관계 없이, 방법 중 하나 2 주 harvestable 종양을 양보 한다.
2. 뒷 다리 종양 기증자 종양 수확 준비. 45 mg/kg 케 타 민 및 5 mg/kg xylazine와 토끼 anesthetize Sodium pentobarbital 390 mg/kg의 정 맥 (IV) 복용량 안락사.
3. 토끼 안락사 되었습니다 일단 연구원 맞는 볼 어떤 크기 블레이드와 메스를 사용 하 여 종양 결 절 overlying 피부 및 피하 조직을 제거 하 여 종양을 수확 시작. 그림 2를 참조 하십시오.
4. 일단 종양 결 절 뒷 다리 근육 내에서 식별 되는 종양 일괄적 넓은 곡선 여백을 사용 하 여 제거 합니다. 이것을 잘라 단 첨부 파일 포인트의 인접 하 고 원심 끝에는 근육 그리고 추적 기본 뼈 따라 메스 블레이드. 종양 캡슐과 괴 코어 노출 explanted 견본 이등분 그림 3을 참조 하십시오.
   참고: VX2 종양 괴 사 성 높은 핵심이 있다. 이후 종양 캡슐에 어떤 손상을 회 저 성 파편의 높은 압력 방출 귀 착될 수 있다 종양, 수확 할 때 적절 한 눈 보호 및 다른 개인 보호 장비를 사용 해야 합니다.
5. 부드럽게 긁어 무딘 개체 (예: 겸 자, hemostats) 종양 청소와 괴 코어. 이 종양 캡슐의 캡슐과 주변 근육 사이 전환 포인트 더 나은 시각화에 대 한 허용 해야 합니다. 그림 4를 참조 하십시오.
6. 이 샘플에서 종양의 여러 조각을 수확 약 1\u20122 m m³ 즉시 실내 온도 멸 균 식 염 수를 포함 하는 컵에 보관.
   참고: 이러한 종양 샘플 후속 intrahepatic 주입에 사용 됩니다.
7. 멸 균 페 트리 접시에 남아 있는 종양을 배치 하 고 그것에 게 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)와 함께 목욕. 이 표본 얼음 차가운 유지, h 2\u20123까지 나중에 처리 하기 위한 유지 수 있습니다.

3. 간 종양 이식 개복 술을 통해

1. 개복 술에 대 한 받는 사람 토끼를 준비 합니다. Anesthetize 45 mg/kg 케 타 민 및 5 mg/kg xylazine를 사용 하 여 받는 사람 토끼 유도 삽 관 법 및 유지 보수 1%-3 %isoflurane 필요. 토끼 마 취 때 발기를 사용 하 여 수술 부위의 면도. Betadine 스크럽, 70% 에탄올 솔루션, betadine 솔루션, triplicate 세척을 사용 하 여 절 개 영역을 청소 하 고 메 마른 외과 패션에 복 부 드러 워 진.
2. #15-블레이드를 사용 하 여, 칼 프로세스에서 시작 하는 토끼의 피부를 통해 작은 하향 세로 중간 절 개를 하 여는 개복 술을 시작 합니다. 이 쉽게 palpated 해야 하 고 미국 페니의 크기 될 하는 경향이 있다. 그림 5를 참조 하십시오.
3. 피부를 반영 하 고 식별 된 교육 알바. 이 중간에 inferiorly 여행 조직의 반사 흰색 밴드 이어야 한다. 무뚝뚝한 절 개를 사용 하 여 통과 하는 교육 알바 복 노출. 그림 6을 참조 하십시오.
   참고: 그것은 것입니다 수 직접 overlying 호흡으로 이동 볼 수 있다 창 자, 이후 복 식별 쉽게 됩니다.
   주의: 복 경향이 있다 표면 장력으로 인해 기본 창에 부착. 무뚝뚝한 외상 해 부를 사용 하는 교육 알바 기본 창 꿰뚫기의 위험을 분산 하는 데 도움이.
4. 일단 복 노출은 신중 하 게 입력 하는 복 막 구멍에 그것을 통해 해 부. 간은 지금 식별할 수 있습니다. 더 나은 복 부 공간 탐색, 복 막, 피부, 근육, 통해 inferiorly 중간 절 개 1\u20122 cm을 확장.
   참고: 중간 절 개를 확장 할 수 있습니다 쉽고 안전 하 게 신중 하 게 복 막 표면으로 향하도록 곡선된 팁과 복 막 공간 곡선된 hemostat를 삽입 하 여. 다음는 hemostat 약간 열고 사용 귀여운 블레이드는 hemostat의 두 팔 사이 조직.
5. 종양 이식에 대 한 사이트를 선택 하기 위해 간 좌 엽을 식별 합니다. 왼쪽된 엽 infero-측면에는 중간에 위치한 중간 엽 이다.
6. 간 복 막 공간에서 무승부를 하기 전에 절 개의 열 등 한 부분에 거 즈의 건조 조각을 넣으십시오.
   참고: 거 즈는 부착 표면 복 부에 다시 제거에서 그것을 방지 하기 위해 간을 제공할 것입니다.
7. 손가락에 atraumatic 집게 또는 젖은 거 즈의 조각 중 하나를 사용 하, 신중 하 게 절 개 통해 복 부의 간 좌 엽을 그릴 하 고 앞에 배치 하는 마른 거 즈에 누워. 그림 7을 참조 하십시오.
   주의: 간 캡슐 민감한 이며 쉽게 파열 할 수 있다. Capsular 출혈, 간 멍이, 및 궁극적인 hemoperitoneum를 방지 하기 위해이 오르간을 처리할 때 부드러운 것이 중요 하다.
   참고: 일반적으로, 간 선언 자체가 시각적으로 복 막 공간;를 입력 시 그러나, 토끼의 배가 팽창 하는 경우 간 밀릴 수 있다 cranially 보이지. 이 경우 부드럽게 무딘 프로브를 사용 하 여 복 벽을 들어올립니다. 이 시나리오에서 간 간 무딘 프로브를 사용 하 여 너무 신중 하 게 별도 표면 장력으로 인해 횡 경 막의 복 부 측면을 준수 하는 경향이 있다 하 고 분리 한다. 다음 atraumatic 집게를 사용 하 여 간 밖으로 그릴.
8. 이 시점에서, 종양 조직 이식에 대 한 준비 하 고 그것을 보호 하기 위해 간 젖은 거 즈의 조각 장소.
9. 단계 2.6 이식에 대 한 간으로 생성 된 종양 조직의 1\u20122 mm³ 조각을 선택 합니다. 그림 8을 참조 하십시오.
10. #11-블레이드를 사용 하 여, 찔린 간 캡슐의 등 쪽 측면에 침투 하지 않도록 주의 복용 0.5 cm 깊은 주머니를 만드는 45 ° 각도로 간 조직 합니다. 장소에는 찔린 후 블레이드를 둡니다. 그림 9를 참조 하십시오.
11. 부드럽게 간 침대에 작은 주머니를 만드는 복 부 방향으로 블레이드를 들어올립니다. 집게를 사용 하 여 종양 조각을, 종양 조각이이 주머니에 놓고 블레이드를 제거 합니다.
    그러나 참고: 블레이드 종양 조각을 삽입 하기 전에 제거 될 수 있다,, 하 게 간 유혈 것 이다 하 고이 펑크 사이트 식별 하기 어려운 애매 한 수 있습니다.
    주의: 의도 하지 않은 종양 뿌리기 방지 하기 위해 다른 구조와 종양의 접촉을 최소화 해야 합니다. 이것 또한 나중이 식을 지원 하기 위해 사용 되는 모든 도구를 따로 설정 하 여 피할 수 있습니다.
12. 이 시점에서, 종양 포켓 hemostasis 홍보 하 고 종양의 방출 방지 젤 거품 같은 hemostatic 에이전트의 조각 장소.
13. 일단 hemostasis 확인 간 복 부를 반환 합니다.
14. 3-0 polydioxanone 봉합 간단한 연속 사용 하는 테이퍼 바늘에 꿰 매 고 연속 subcuticular 스티치를 사용 하 여 절단 바늘에 4-0 polyglactin 910 봉합 피부와 복 부 벽을 닫습니다.
    주의: 복 벽을 닫을 때 주의 하지는 omentum 봉합 던져 다른 장 구조를 손상.
    참고:이 종양은 결정적으로 radiographically 식별 될 적어도 2 주를 걸릴 것입니다, 하는 동안 그것에 도달 1.5\u20122 cm 직경의 크기의 성장 3 주 합니다. 하지 이후 종양 질량 그리고 적극적으로 확산 로컬로 exophytic 형성할 것 이다 3.5\u20124 주 과거 성장 간 종양 수 있도록 주의 해야 합니다.

4. VX2 종양 정지 준비

1. 프로필 렌 50 mL 원뿔 튜브의 입 속으로 40 µ m 여과기를 놓습니다. 2.7 단계에서 종양을 사용 하 여 가능한 종양을 수집 하 고 이러한 부스러기는 스 트레이너를 종양 표면 긁어 #15-블레이드를 사용 합니다.
2. DMEM을 사용 하 여 거르는 통해 가능한 종양 부스러기를 세척 하 고 8 분 동안 1600 rpm에서 프로필 렌 튜브 원심.
3. 원심 분리기를 완료 한 후에 상쾌한을 제거 하 고 그것을 폐기. 스 1:1 부피 비율로 나머지 셀 블록을 추가 합니다.
4. 다음 단계 1.3\u20121.4 뒷 다리 기증자 토끼에이 정지를 삽입할. 극저온 튜브에 1 mL aliquots로 나머지 정지를 배치 하 고 나중 사용을 위해 액체 질소에 그들을 동결.

5. angiographic 활용 된 VX2 간 종양

1. 3.1 단계에서 설명한 대로 토끼를 준비 합니다.
2. 사 타 구니에 대 퇴 groove 만져 홈을 식별 하면 2\u20123 cm 선형 절 개를 따라 홈을 확인 합니다. 그림 10을 참조 하십시오.
3. 무뚝뚝한 절 개를 사용 하 여 찾아서 대 퇴 정 맥, 동맥, 신경 포함 된 대 퇴 번들을 분리 합니다. 그림 11을 참조 하십시오.
4. 다시, 무딘 해 부를 사용 하 여 번들에 구조의 나머지 부분에서 대 퇴 동맥을 분리 하 여 메스 핸들 위에 동맥을 분리. 그림 12를 참조 하십시오.
5. 3 프랑스 중개자 키트와 함께 바늘으로 액세스 Seldinger 기술 활용. guidewire 넣고 그릇에 3-프랑스 칼 집 사전에 바늘을 제거 합니다. 그림 13을 참조 하십시오.
   주의:이 대 퇴 동맥의 transection 발생할 수 3-프랑스 칼 집에 과도 한 무력을 사용 하지 마십시오.
6. Fluoroscopic 지도 및 카 테 터, guidewire, 및 iohexol 대비 에이전트를 사용 하 여에서 celiac 트렁크에 대 한 선택-T12 수준에 일반적으로 있는-고 다음 테 왼쪽된 간 동맥으로 간 하 고 적절 한 공통 통해 간.
7. 이 시점에서 카 테 터를 통해 선택의 에이전트를 관리 합니다. 에이전트 관리는 카 테 테 르 제거.
8. 3-0 비단 봉합 사를 사용 하 여 선 대 퇴 동맥 proximally 고 distally 칼 집의 삽입 지점에. 출혈을 방지 하기 위해 철회로 칼 집에 인접 매듭을 강화 해야 합니다.
9. Subcuticular 스티치를 사용 하 여 절단 바늘에 4-0 polyglactin 910 봉합 사 타 구니 절 개를 닫습니다.
10. 표준 수술 관리 및 모니터 동물 복구를 유지 관리 합니다. 안락사를 수행 하 고 표준 기술을 사용 하 여 필요에 따라 necropsy.

결과

그림 1에서 볼 때, 그것은 분명 토끼의 quadricep 확대 됩니다. 또한, 일반적으로 근 막 통해 종양 성장 연관 여러 작은 개별 혹 볼 수 있습니다. 촉진, 시 주입된 사지 비 주입 사지 보다 나타납니다. 연구원 종양 존재의 더 확실 한 보증 하는 경우, 초음파 이미징 근육에 포함 된 종양을 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 종양이 감지 되지 않으면 뒷 다?...

토론

VX2 종양 방법론에서 첫 번째 중요 한 단계는 기증자 토끼의 뒷 다리에 종양의 성공적인 전파입니다. 이 단계에 대 한 자세한 내용은 "대표 결과" 섹션에서 첫 번째 단락을 참조 하십시오.

다음 중요 한 단계는 가능한 종양 캡슐 올바르게 식별을 하도록 하 고 있다. 뿐만 아니라이 종양 정지 준비를 위해 필요한 것 그러나 그것은 또한 선택 하 고 생성 하는 종양 조각 간 이식에 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
MethoCult (Methycellulose)	Stemcell Technologies	M3134
VX2 Cell Line	NCI	VX-2
5 mL Syringe	BD	309646
16 G Needle	BD	305197
22 G Needle	BD	305155
Hair Clippers	Wahl	41870-0438
Foam Insulated Box	Mr. Box Online	10 x 10 x 4
Acepromazine	Henry Schein	003845
Buprenorphine	Par	42023-179-05
Meloxicam	Henry Schein	049755
Alcohol Pads	Covidien	5033
Ketamine	Henry Schein	056344
Xylazine	Akorn	59399-110-20
Pentobarbital (Fatal-Plus)	Vortech	9373
Sterile Petri Dish	Thermo Fisher	172931
DMEM	Gibco	11965092
Saline	Baxter	2F7124
15-Blade	Steris	02-050-015
Scalpel Handle x 2	Steris	22-2381
Curved Hemostat	WPI	501288
Atraumatic Forceps	Sklar	52-5077
Gauze	Medline	NON21430LF
11-Blade	Steris	02-050-011
Surgicel	Ethicon	1951
3-0 PDS / Taper	Ethicon	Z305H
4 - 0 Vicryl / Cutting	Ethicon	J392H
40 μm strainer	BD	352340
50 mL conical tube	Thermo Fisher	339652
plastic pipette	Thomas Scientific	HS206371B
Centrifuge	Sorvall	75004240
1.40 mL Tubes (Internal Thread)	Micronic	MP32131-Z20
3-F VSI Micro-HV Introducer Kit	Vascular Solutions	Custom Order (P15180391)
.018 45° angle glidewire	Terumo	RG*GA1818SA
Direxion bern-shape microcatheter	Boston Scientific	M001195230
Omnipaque	GE	Y510