Sviluppo e uso angiografica del coniglio VX2 modello per cancro del fegato

Riepilogo

L'obiettivo di questo articolo è di fornire un primer per lo sviluppo e l'utilizzo del VX2 carcinoma Coniglio modello per cancro del fegato.

Abstract

Il tumore VX2 coniglio è un modello animale utilizzato comunemente per ricerca traslazionale per quanto riguarda il carcinoma epatocellulare (HCC) nel campo della radiologia interventistica. Questo modello si avvale di un carcinoma di cellule squamous anaplastico che è affidabile e facilmente propagato nel muscolo scheletrico dei conigli di donatore per eventuale impianto di vendemmia e allotrapianto nel fegato di destinatari ingenui. Questo innesto tumore cresce rapidamente all'interno del fegato dei conigli destinatari in un tumore angiograficamente identificabile caratterizzato da un nucleo necrotico circondato da una capsula di hypervascular praticabile. La dimensione fisica dell'anatomia coniglio è sufficiente per facilitare strumentazione vascolare che permette per l'applicazione e la sperimentazione di varie tecniche interventistiche. Nonostante questi vantaggi, esiste una scarsità di risorse tecniche per agire come un riferimento concreto per i ricercatori che lavorano con il modello. Qui, presentiamo un contorno visivo completo per gli aspetti tecnici di sviluppo, crescita, propagazione e angiografico utilizzazione del modello di tumore VX2 coniglio per uso da novizio e ricercatori esperti allo stesso modo.

Introduzione

Il modello di tumore VX2 coniglio ha svolto un ruolo in oncologia sperimentale dal suo sviluppo nel 1935^1,2. Questo tumore è un virus-indotta Anaplastico carcinoma di cellule squamous caratterizzato da hypervascularity, crescita rapida e facile propagazione in muscolo scheletrico^3,4. Mentre il modello di tumore di coniglio VX2 è stato utilizzato per indagare una moltitudine di cancri^5,6,7,8; il focus di questo lavoro è il cancro del fegato⁹.

Lo scopo del metodo descritto è quello di presentare un modello per cancro del fegato primario, o il carcinoma epatocellulare (HCC), che può essere utilizzato da radiologi interventisti per ricerca traslazionale. Può essere utilizzato per studi di farmacocinetica, le indagini terapeutiche e metodo ablativo test^{10,11,12,13,14,15}.

Il metodo qui dettagliato dà più vantaggi rispetto ad altri modelli all'interno della stessa sfera come modelli di roditori come i ratti, topi e marmotte o modelli più grandi come primati¹⁶. Uno dei principali vantaggi è la crescita tumorale rapida e affidabile che permette ai ricercatori di stabilire una linea di tumore attivo entro un mese prima dell'arto propagazione¹⁷. Inoltre, questo tumore ha visibilità ecografica semplice e una periferia hypervascular che consente sia transarterial locoregionale trattamenti e le terapie ablative. Infine e soprattutto, la dimensione del vasculature coniglio consente fattibile e tecnicamente facile utilizzazione di strumentazione vascolare¹⁸.

Protocollo

Il seguente protocollo segue tutti i requisiti e linee guida su mandato della University of Illinois - Chicago. Esso è stato rivisto e approvato dalla locale istituzionale Animal Care e uso comitato prima dell'esecuzione.

1. VX2 lo sviluppo del tumore dell'arto posteriore

1. Procurarsi le varietà di cellula tumore VX2 dalla nazionale Cancer Institute divisione di cancro trattamento diagnosi e trattamento del tumore/cella linea Repository.
   Nota: In questo momento, il catalogo di ordine può essere trovato al seguente link: https://dtp.cancer.gov/repositories/.
2. Per preparare la sospensione cellulare per iniezione, mettere il mezzo di campione e metilcellulosa VX2 congelato in acqua tiepida fino a che essi hanno sciolto.
   1. Aspirare 0.5\u20121 mL della sospensione delle cellule scongelati e un uguale volume di mezzo di metilcellulosa scongelati in una siringa da 5 mL.
      Nota: Può contribuire a utilizzare un ago G 21 o 22 per aspirare la sospensione cellulare e un ago di calibro più grande per aspirare il mezzo di metilcellulosa. Mettere le siringhe sul ghiaccio.
3. Preparare il donatore di tumore dell'arto coniglio per inoculazione di sospensione cellulare, iniziando con sedazione utilizzando acepromazina 1 mg/kg e buprenorfina 0,02 mg/kg data intramuscolarmente. Radere il sito di inoculazione (arto posteriore) con i clippers e pulite è il rasato con un agente a base di alcool o di iodio.
   Nota: Meloxicam può essere somministrato ad una dose di 0,2 mg/kg per via sottocutanea per analgesia. Pelliccia di coniglio è difficile a farsi la barba. È consigliabile che il ricercatore eseguire più passaggi, in primo luogo concentrandosi su una massa della pelliccia di compensazione e quindi premendo i clippers contro la pelle e andando contro il grano.
4. Inserire un ago di 16 G alla siringa 5 mL contenente la sospensione cellulare e iniettare 1 mL della sospensione nel ventre del muscolo dell'arto posteriore del coniglio donatore, circa 1 cm di profondità. Assicurarsi di proteggere il nervo sciatico in esecuzione all'interno di un solco palpabile lungo il femore.
   Nota: Fresco VX2 inoculates 88% dei soggetti con successo mentre congelati e scongelati VX2 è solo successo 33% del tempo¹⁹.
   Attenzione: Il tumore VX2 crescerà rapidamente. Effetti collaterali che può essere osservati come il progredire del tumore sono: aumentata frequenza respiratoria, letargia, diminuzione e/o cambiamenti comportamentali (ad es., insolita aggressività). Di conseguenza, le raccomandazioni sono di monitorare da vicino gli animali e di pianificare per il raccolto del tumore entro due settimane dopo l'inoculazione.

2. VX2 crescita tumorale dell'arto e la raccolta

Nota: Supponendo che l'inoculazione di successo, ci dovrebbe essere un palpabile nodulo del tumore (3\u20124 cm) al sito di iniezione entro 2 settimane. Solitamente, questo nodulo sarà palpabile circa 1 settimana; Tuttavia, è meglio lasciare il tumore a crescere per consentire sufficiente raccolta di tessuto. In genere, questo nodulo sarà costante, indurita ed elevata sopra il livello del muscolo. Se

1. Palpare l'area inoculata a 2 settimane dall'inoculazione. Se nessuna crescita del tumore è rilevata in 2 settimane, eseguire nuovamente il passaggio 1. Vedere la Figura 1.
   Nota: La presenza di tumore può essere valutata anche mediante ultrasuoni. Mentre non sono stati condotti studi per valutare la differenza nelle metriche di crescita del tumore quando propagato da azione congelate rispetto ad azione fresche, è stata la nostra esperienza che il tumore stock congelato cresce leggermente più lento e sarà rilevabile dopo la sua azione fresche contro-parte. Indipendentemente da ciò, uno dei due metodi dovrebbero produrre un tumore raccoglibile entro 2 settimane.
2. Preparare il donatore di tumore dell'arto per il raccolto del tumore. Anestetizzare il coniglio con 45 mg/kg ketamina e 5 mg/kg xylazina. Eutanasia con una dose endovenosa (IV) di sodio pentobarbital superiore a 390 mg/kg.
3. Una volta che il coniglio è stata eutanasia, iniziare la raccolta il tumore rimuovendo il tessuto cutaneo e sottocutaneo sovrastante il nodulo del tumore usando un bisturi con qualsiasi dimensione lama il ricercatore ritiene opportuno. Vedere la Figura 2.
4. Una volta che il nodulo del tumore è stato individuato all'interno del muscolo dell'arto posteriore, rimuovere il tumore del blocco dell'en con margini ampi curvilinei. Per questo, tagliare i punti di attacco tendineo alle estremità prossimale e distale della del muscolo e quindi traccia la lama del bisturi lungo l'osso sottostante. Bisecare il campione explanted esponendo la capsula del tumore ed il nucleo necrotico. Vedere la Figura 3.
   Nota: Il tumore VX2 ha un nucleo altamente necrotico. Assicurarsi di utilizzare la protezione degli occhi adeguata e altri dispositivi di protezione individuale durante la raccolta del tumore, poiché eventuali danni alla capsula del tumore possono provocare espulsione ad alta pressione di residui necrotici.
5. Raschiare delicatamente il nucleo necrotico con un oggetto appuntito (ad es. forcipe, emostatiche) per pulire il tumore. Questo dovrebbe consentire per una migliore visualizzazione della capsula del tumore ed il punto di transizione tra capsula e muscolo circostante. Vedere la Figura 4.
6. Da questo esempio, raccogliere diversi pezzi di tumore circa 1\u20122 mm³ e immediatamente li salviamo in una tazza contenente soluzione salina sterile a temperatura ambiente.
   Nota: Questi campioni di tumore utilizzerà per impianto successivo intraepatico.
7. Posizionare il tumore rimanente in una capsula di Petri sterile e si bagna con dell'Aquila per volta di Dulbecco Medium (DMEM). Se questo esemplare è mantenuto freddo sul ghiaccio, può essere conservato per la gestione fino a 2\u20123 h più successivamente.

3. fegato tumore dell'impianto mediante laparotomia

1. Preparare il coniglio destinatario per la laparotomia. Anestetizzare il coniglio destinatario utilizzando 45 mg/kg ketamina e 5 mg/kg xylazina per induzione seguita da intubazione e manutenzione con 1% - 3% isoflurane come necessario. Quando il coniglio è anestetizzato, radere il sito chirurgico utilizzando tagliacapelli. Pulire l'area di incisione con triplice copia lavaggio con betadine macchia, soluzione di etanolo 70% e soluzione di betadine e drappo l'addome in modo chirurgico sterile.
2. Utilizzando una #15-lama, avviare la laparotomia facendo una piccola incisione sulla linea mediana verticale verso il basso attraverso la pelle del coniglio a partire dal processo xifoideo. Questo dovrebbe essere palpato facilmente e tende a essere più o meno le dimensioni di un penny americano. Vedere la Figura 5.
3. Riflettere la pelle e identificare il linea alba. Questo dovrebbe essere una banda bianca riflettente di tessuto viaggiando inferiorly nel midline. Utilizzare una dissezione smussa per attraversare il linea alba ed esporre il peritoneo. Vedere la Figura 6.
   Nota: Il peritoneo è facilmente riconoscibile poiché esso sarà essere direttamente che ricopre l'intestino, che può essere visto in movimento con la respirazione.
   Attenzione: Il peritoneo tende ad essere aderente alle viscere sottostante a causa della tensione superficiale. Tramite il trauma smussato per sezionare il linea alba aiuta a dissipare il rischio di perforazione intestinale sottostante.
4. Una volta esposto il peritoneo, sezionare con cura attraverso di esso per entrare nella cavità peritoneale. Il fegato possa ora essere identificato. Per meglio navigare nello spazio addominale, estendere la linea mediana incisione 1\u20122 cm inferiorly attraverso la pelle, il muscolo e il peritoneo.
   Nota: Estendere l'incisione del midline può essere facilmente e in modo sicuro fatto inserendo con cautela una pinza emostatica curva nello spazio peritoneale con la punta ricurva verso superficialmente il peritoneo. Quindi aprire leggermente la pinza emostatica e utilizzare una lama per carina il tessuto tra i due rami dell'emostato.
5. Identificare il lobo sinistro del fegato al fine di selezionare un sito per l'impianto del tumore. Il lobo di sinistra è infero-laterale al lobo mediale che si trova sulla linea mediana.
6. Prima di disegnare il fegato fuori dello spazio peritoneale, posizionare un pezzo di garza secco alle funzione inferiore dell'incisione.
   Nota: La garza fornirà una superficie aderente per appoggiare il fegato su per impedirne la ritrazione indietro nell'addome.
7. Utilizzando Pinze atraumatiche o un pezzo di garza umida sopra le barrette, attentamente disegnare il lobo sinistro del fegato fuori dell'addome attraverso l'incisione e coricare su garza asciutta inserita in precedenza. Vedere la Figura 7.
   Attenzione: La capsula del fegato è sensibile e può facilmente la rottura. È fondamentale essere gentile quando si maneggia questo organo per impedire sanguinare capsulare, ecchimosi del fegato e/o eventuale emoperitoneo.
   Nota: Solitamente, il fegato dichiarerà sé visivamente entrando lo spazio peritoneale; Tuttavia, se lo stomaco del coniglio è disteso, il fegato può essere spinto cranialmente fuori dalla vista. Se questo è il caso, sollevare delicatamente la parete addominale utilizzando una sonda smussata. In questo scenario, il fegato tende ad aderire alla parte ventrale del diaframma a causa della tensione superficiale così accuratamente separato il fegato usando una sonda smussata e dovrebbe staccare. Quindi utilizzare pinza atraumatica per estrarre il fegato.
8. A questo punto, preparare il tessuto del tumore per l'impianto e posizionare un pezzo di garza umida sopra il fegato per proteggerlo.
9. Selezionare un pezzo di³ mm di 1\u20122 del tessuto del tumore che è stato generato durante il passaggio 2.6 per l'impianto nel fegato. Vedere la Figura 8.
10. Utilizzando una lama n. 11, forare il tessuto del fegato un'angolazione di 45°, rendendo una profonda tasca di 0,5 cm, avendo cura di non per penetrare l'aspetto dorsale della capsula del fegato. Lasciare la lama in posizione dopo aver effettuato la puntura. Vedere la Figura 9.
11. Sollevare delicatamente la lama in senso ventrale per creare una piccola tasca nel letto del fegato. Prendere il pezzo di tumore usando il forcipe, posizionare il pezzo di tumore in questa tasca e quindi rimuovere la lama.
    Nota: La lama può essere rimosso prima di inserire la parte di tumore, tuttavia, il fegato si sanguina e questo può oscurare il sito di puntura che lo rende difficile da identificare.
    Attenzione: Assicurarsi di ridurre al minimo il contatto del tumore con eventuali altre strutture per evitare involontario tumore semina. Questo può essere evitato anche accantonando eventuali utensili utilizzati per assistere con l'impianto in seguito.
12. A questo punto, posizionare un pezzo di agente emostatico, come schiuma gel, sopra la tasca di tumore per promuovere l'emostasi e per evitare l'espulsione del pezzo del tumore.
13. Restituire il fegato all'addome, una volta confermata l'emostasi.
14. Chiudere la parete addominale con 3-0 suturare polidioxanone su un ago conico utilizzando un semplice continuo cucire e chiudere la pelle con i 910 suturare di polyglactin 4-0 su un ago di taglio usando subcuticular continuo punto.
    Attenzione: Durante la chiusura della parete addominale, fare attenzione a non per danneggiare l'omento o altre strutture intestinali in un tiro di sutura.
    Nota: Mentre questo tumore vorranno almeno 2 settimane per essere definitivamente radiografico identificabili, raggiunge una dimensione di 1.5\u20122 cm di diametro a 3 settimane di crescita. Essere attenti a non permettere che il tumore epatico a crescere oltre 3.5\u20124 settimane da quando il tumore si formerà un exophytic massa e aggressivamente diffondere localmente.

4. VX2 Preparazione della soluzione di tumore

1. Posizionare un colino di 40 µm nella bocca di un tubo di propilene coniche da 50 mL. Il tumore dal punto 2.7, utilizzare una #15-lama per raschiare la superficie del tumore per raccogliere tumore possibile e inserire questi raschiatura del filtro.
2. Lavare la raschiatura di tumore possibile attraverso un colino con DMEM e poi Centrifugare la provetta di propilene a 1600 giri/min per 8 min.
3. Dopo la centrifuga è completa, rimuovere il supernatante e scartarlo. Quindi aggiungere metilcellulosa blocchetto delle cellule rimanenti con un rapporto volumetrico di 1:1.
4. Iniettare la sospensione in un coniglio di donatore dell'arto seguendo passaggi 1.3\u20121.4. Posizionare la sospensione restante in aliquote di 1 mL in provette criogeniche e congelarli in azoto liquido per un uso successivo.

5. angiografico utilizzazione del VX2 tumore del fegato

1. Preparare il coniglio come descritto al punto 3.1.
2. Palpare il solco femorale all'inguine. Quando la scanalatura è stata identificata, fare un'incisione lineare di cm 2\u20123 lungo la scanalatura. Vedere la Figura 10.
3. Mediante dissezione smussa, individuare e isolare il femorale bundle contenente la vena femorale, arteria e nervo. Vedere la Figura 11.
4. Ancora una volta, è possibile utilizzare una dissezione smussa per separare l'arteria femorale dal resto delle strutture nel bundle e isolare l'arteria in cima ad un manico per bisturi. Vedere la Figura 12.
5. Con un kit di 3-francese introduttore, utilizzare la tecnica di Seldinger per ottenere l'accesso con un ago. Inserire un filo guida e rimuovere l'ago per avanzare la guaina 3-francese nel vaso. Vedere la Figura 13.
   Attenzione: Evitare l'uso di forza eccessiva nell'avanzare la guaina 3-francese, poiché ciò può comportare il transection dell'arteria femorale.
6. Sotto guida fluoroscopica e utilizzando un catetere, filo guida e agente di contrasto iohexol, selezionare per il tronco celiaco — in genere situata al livello T12 — e quindi far avanzare il catetere nell'arteria epatica di sinistra tramite il comune epatico e corretto epatica.
7. A questo punto, amministrare l'agente di scelta attraverso il catetere. Una volta che l'agente è amministrato, rimuovere il catetere.
8. Mediante sutura seta 3-0, legare l'arteria femorale prossimalmente e distalmente al punto di inserimento della guaina. Assicurarsi di stringere il nodo prossimale della guaina, come si è ritirato per prevenire le emorragie.
9. Chiudere l'incisione all'inguine con 910 suture di polyglactin 4-0 su un ago di taglio utilizzando un punto di subcuticular.
10. Mantenere standard recupero post-operatorio cura e monitor degli animali. Eseguire l'eutanasia e necroscopie secondo necessità utilizzando tecniche standard.

Risultati

Quando guardando la Figura 1, è chiaro che il quadricipite del coniglio è ingrandita. Inoltre, i piccoli noduli discreti multipli, in genere correla con la crescita del tumore attraverso la fascia, sono visibili. Alla palpazione, l'arto iniettato dovrebbe apparire che l'arto non iniettato. Se un ricercatore richiede più definitiva certezza della presenza del tumore, l'imaging ad ultrasuoni consente di identificare il tumore incorporato nel muscolo. Se un t...

Discussione

Il primo passo fondamentale nella metodologia del tumore VX2 è successo propagazione di un tumore dell'arto posteriore di un coniglio di donatore. Fare riferimento al primo paragrafo nella sezione "Rappresentante risultati" per ulteriori informazioni su questo passaggio.

Il prossimo passo critico consiste nel garantire che la capsula del tumore possibile è correttamente identificata. Non solo questo sarà necessario per la preparazione di sospensioni di tumore, ma è anche importante per la ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
MethoCult (Methycellulose)	Stemcell Technologies	M3134
VX2 Cell Line	NCI	VX-2
5 mL Syringe	BD	309646
16 G Needle	BD	305197
22 G Needle	BD	305155
Hair Clippers	Wahl	41870-0438
Foam Insulated Box	Mr. Box Online	10 x 10 x 4
Acepromazine	Henry Schein	003845
Buprenorphine	Par	42023-179-05
Meloxicam	Henry Schein	049755
Alcohol Pads	Covidien	5033
Ketamine	Henry Schein	056344
Xylazine	Akorn	59399-110-20
Pentobarbital (Fatal-Plus)	Vortech	9373
Sterile Petri Dish	Thermo Fisher	172931
DMEM	Gibco	11965092
Saline	Baxter	2F7124
15-Blade	Steris	02-050-015
Scalpel Handle x 2	Steris	22-2381
Curved Hemostat	WPI	501288
Atraumatic Forceps	Sklar	52-5077
Gauze	Medline	NON21430LF
11-Blade	Steris	02-050-011
Surgicel	Ethicon	1951
3-0 PDS / Taper	Ethicon	Z305H
4 - 0 Vicryl / Cutting	Ethicon	J392H
40 μm strainer	BD	352340
50 mL conical tube	Thermo Fisher	339652
plastic pipette	Thomas Scientific	HS206371B
Centrifuge	Sorvall	75004240
1.40 mL Tubes (Internal Thread)	Micronic	MP32131-Z20
3-F VSI Micro-HV Introducer Kit	Vascular Solutions	Custom Order (P15180391)
.018 45° angle glidewire	Terumo	RG*GA1818SA
Direxion bern-shape microcatheter	Boston Scientific	M001195230
Omnipaque	GE	Y510