Développement et utilisation angiographique du lapin VX2 modèle pour un cancer du foie

Résumé

L’objectif de cet article est de fournir une couche d’apprêt pour le développement et l’utilisation du modèle VX2 carcinome lapin pour un cancer du foie.

Résumé

La tumeur de VX2 lapin est un modèle animal couramment utilisé pour la recherche translationnelle sur le carcinome hépatocellulaire (CHC) dans le domaine de la radiologie interventionnelle. Ce modèle emploie un carcinome épidermoïde anaplasique qui est facilement et de manière fiable s’est propagé dans le muscle squelettique des lapins de donateurs pour éventuelle implantation récolte et allogreffe dans le foie des destinataires naïf. Cette greffe tumorale se développe rapidement dans le foie des lapins bénéficiaires dans une tumeur par angiographie identifiable caractérisée par un noyau nécrotique entouré par une capsule hypervascularisée viable. La taille physique de l’anatomie du lapin est suffisante pour faciliter l’instrumentation vasculaire permettant l’application et l’essai de diverses techniques interventionnelles. Malgré ces avantages, il existe un manque de ressources techniques d’agir comme une référence concrète pour les chercheurs qui travaillent avec le modèle. Ici, nous présentons un aperçu visuel complet pour les aspects techniques de développement, la croissance, propagation et angiographique utilisation du modèle de tumeur VX2 lapin pour novice et des chercheurs expérimentés.

Introduction

Le modèle de tumeur VX2 lapin a joué un rôle en oncologie expérimentale depuis sa mise au point en 1935^1,2. Cette tumeur est un Viro-induite anaplasique carcinome épidermoïde caractérisé par hypervascularity, une croissance rapide et facile propagation dans le muscle squelettique^3,4. Alors que le modèle de tumeur lapin VX2 a été utilisé pour enquêter sur une multitude de cancers^5,6,7,8; l’objectif de cet article est un cancer du foie,⁹.

Le but de la méthode décrite est de présenter un modèle pour le cancer primaire du foie ou carcinome hépatocellulaire (CHC), qui peut être utilisé par les radiologues interventionnels de recherche translationnelle. Il peut être utilisé pour les études pharmacocinétiques, enquêtes thérapeutiques et ablatif méthode essai^{10,11,12,13,14,15}.

La méthode détaillée ci-après donne plusieurs avantages par rapport aux autres modèles dans la même sphère comme modèles de rongeurs comme les rats, souris et marmottes ou des modèles plus grands comme les primates¹⁶. L’un des principaux avantages est la croissance tumorale rapide et fiable qui permet aux chercheurs d’établir une ligne de tumeur active moins d’un mois du premier membre postérieur propagation¹⁷. En outre, cette tumeur a simple visibilité échographique et les confins hypervascularisée qui permet pour les transarterial locorégional traitements et thérapies ablatives. Enfin et surtout, la taille de la vascularisation du lapin permet faisable et techniquement facile utilisation d’instrumentation vasculaire¹⁸.

Protocole

Le protocole suivant suit toutes les exigences et les lignes directrices, mandatées par l’Université de l’Illinois - Chicago. Il a été examiné et approuvé par la section locale animalier institutionnel et Comité d’utilisation avant l’exécution.

1. VX2 le développement de tumeurs des membres postérieurs

1. Se procurer de la lignée de cellules tumorales VX2 du National Cancer Institute Division de diagnostic du Cancer traitement et traitement/cellule tumorale ligne référentiel.
   Remarque : Pour l’instant, le catalogue de commande se trouvent sur le lien suivant : https://dtp.cancer.gov/repositories/.
2. Pour préparer la suspension cellulaire pour injection, placer le milieu de sample et de méthylcellulose VX2 congelé dans l’eau tiède jusqu'à ce qu’ils ont été décongelés.
   1. Aspirer 0.5\u20121 mL de la suspension cellulaire décongelés et un volume égal de milieu de méthylcellulose décongelés dans une seringue de 5 mL.
      Remarque : Il peut aider à utiliser une aiguille de 21 ou 22 G pour aspirer la suspension cellulaire et une aiguille de calibre plus gros pour aspirer le milieu de la méthylcellulose. Placez les seringues sur la glace.
3. Préparer le donateur de tumeur du membre postérieur de lapin pour l’inoculation de la suspension cellulaire, à partir de sédation en utilisant l’acépromazine 1 mg/kg et la buprénorphine de 0,02 mg/kg administré par voie intramusculaire. Raser le site d’inoculation (membre postérieur) avec une tondeuse et propre est la rasée avec un agent à base d’iode ou de l’alcool.
   Remarque : Meloxicam peut être administré à une dose de 0,2 mg/kg par voie sous-cutanée pour l’analgésie. Fourrure de lapin est difficile de se raser. Il est recommandé que le chercheur effectue plusieurs passes, tout d’abord en se concentrant sur vider une grande partie de la fourrure, puis ensuite en appuyant sur les clippers contre la peau et allant à l’encontre du grain.
4. Attacher une aiguille 16 G à la seringue de 5 mL contenant la suspension cellulaire et injecter 1 mL de la suspension dans le ventre du muscle du membre postérieur du lapin donneur, environ 1 cm de profondeur. N’oubliez pas de garder le nerf sciatique qui s’exécutent dans une rainure palpable sur le fémur.
   Remarque : Frais VX2 inocule avec succès à 88 % des sujets tandis que VX2 congelé et décongelé n’a réussi 33 % du temps¹⁹.
   Attention : La tumeur VX2 augmentera rapidement. Les effets secondaires qu’il convient de noter que les progrès de la tumeur sont : a augmenté la fréquence respiratoire, léthargie, une diminution de la vigilance et/ou des changements de comportement (p. ex., une agressivité inhabituelle). En conséquence, les recommandations sont à surveiller de près les animaux et de planifier pour la récolte de la tumeur dans les deux semaines après l’inoculation.

2. VX2 membre postérieur la croissance tumorale et la récolte

Remarque : En supposant que l’inoculation réussie, il devrait y avoir une palpable nodule tumoral (3\u20124 cm) au point d’injection dans les 2 semaines. Habituellement, ce nodule sera palpable autour de 1 semaine ; Toutefois, il est préférable de laisser la tumeur de se développer afin de permettre suffisamment prélèvement tissulaire. En général, ce nodule sera ferme, indurées et élevée au-dessus du niveau du muscle. If

1. Palper la région ensemencée à 2 semaines après l’inoculation. Si aucune croissance de la tumeur n’est détectée à 2 semaines, effectuez l’étape 1 à nouveau. Voir la Figure 1.
   Remarque : La présence de la tumeur peut aussi évaluée par ultrasons. Alors qu’il n’y a eu aucune étude pour évaluer la différence dans l’Etendue de la croissance tumorale lorsque propagée du stock congelé par rapport au stock frais, il a été notre expérience qui la tumeur stock congelée pousse un peu plus lentement et sera détectable après son stock frais Counter-partie. Malgré tout, ou l’autre méthode devrait produire une tumeur récoltable par 2 semaines.
2. Préparer le donateur de tumeur du membre postérieur pour la récolte de la tumeur. Anesthésier le lapin avec 45 mg/kg de xylazine kétamine et 5 mg/kg. Euthanasier avec une dose d’intraveineux (IV) de pentobarbital de sodium supérieure à 390 mg/kg.
3. Une fois que le lapin a été euthanasié, commencer la récolte de la tumeur en enlevant les tissus cutanés et sous-cutanés, recouvrant le nodule de tumeur à l’aide d’un scalpel avec quelle que soit la taille de lame le chercheur estime nécessaires. Voir la Figure 2.
4. Une fois que le nodule tumoral a été identifié dans le muscle de la patte arrière, retirer la tumeur en bloc à l’aide de marges larges curvilignes. Pour ce faire, couper les points d’attache tendineuse aux extrémités proximales et distales du muscle et puis trace la lame de bistouri le long de l’os sous-jacent. Coupent le spécimen explanté exposant la capsule de la tumeur et le noyau nécrotique. Voir la Figure 3.
   Remarque : La tumeur VX2 possède un noyau très nécrotique. N’oubliez pas d’utiliser une protection oculaire appropriée et autres équipements de protection individuelle lorsqu’ils pêchent la tumeur, étant donné que l’éjection à haute pression de débris nécrotiques peuvent entraîner des dommages à la capsule de la tumeur.
5. Grattez légèrement la base nécrotique avec un objet contondant (p. ex. , pinces, hémostatique) pour nettoyer la tumeur. Cela devrait permettre pour une meilleure visualisation de la capsule de la tumeur et le point de transition entre la capsule et les muscles environnants. Voir la Figure 4.
6. De cet échantillon, récolter plusieurs morceaux de tumeur environ 1\u20122 mm³ et rangez-les immédiatement dans une tasse contenant une solution saline stérile à température ambiante.
   Remarque : Ces échantillons de tumeur servira pour implantation intrahépatique ultérieure.
7. Placer la tumeur restante dans une boîte de Petri stérile et il baigne avec le médium de l’aigle de la modification de Dulbecco (DMEM). Si cet exemplaire est conservé au froid sur la glace, il peut être conservé pour la manipulation jusqu'à 2\u20123 h plus tard.

3. foie tumoral Implantation par laparotomie

1. Préparer le lapin bénéficiaire pour laparotomie. Anesthésier le lapin destinataire à l’aide de kétamine 45 mg/kg et 5 mg/kg de xylazine pour induction suivie d’intubation et entretien avec 1 % - 3 % isoflurane comme nécessaires. Quand le lapin est anesthésié, se raser le site chirurgical à l’aide de tondeuses à cheveux. Nettoyer la zone de l’incision à l’aide de lavage en triple avec betadine scrub et Bétadine solution solution d’éthanol à 70 % et drapé de l’abdomen de manière chirurgicale stérile.
2. À l’aide d’une lame #15, initier la laparotomie en faisant une petite incision de la ligne médiane verticale vers le bas par la peau du lapin à partir du processus xiphoïde. Cela devrait être facilement palpée et tend à être à peu près la taille d’un penny américain. Voir la Figure 5.
3. Tenir compte de la peau et d’identifier les linea alba. Cela devrait être une bande blanche réfléchissante du tissu voyageant inférieurement à la ligne médiane. Utilisation de dissection par clivage pour parcourir la linea alba et exposer le péritoine. Voir la Figure 6.
   Remarque : Le péritoine est facilement identifiable car il va être directement recouvrant l’intestin, qui peut être vu en mouvement avec la respiration.
   Attention : Le péritoine a tendance à être adhérentes à l’intestin sous-jacent en raison de la tension superficielle. En utilisant un traumatisme contondant pour disséquer le linea alba aide à dissiper le risque de perforation de l’intestin sous-jacent.
4. Une fois que le péritoine est exposé, disséquer attentivement à travers elle d’entrer dans la cavité péritonéale. Le foie peut être identifié. Pour mieux naviguer dans l’espace abdominal, étendre la ligne médiane incision 1\u20122 cm inférieurement par le biais de la peau, muscle et le péritoine.
   Remarque : Extension de l’incision de la ligne médiane peut être facilement et en toute sécurité fait en insérant doucement une pince hémostatique courbe dans l’espace péritonéal avec l’extrémité courbée face superficiellement vers le péritoine. Ouvrez la pince hémostatique légèrement, puis utiliser une lame à mignon le tissu entre les deux branches de la pince hémostatique.
5. Identifier le lobe gauche du foie afin de sélectionner un site pour l’implantation de la tumeur. Le lobe gauche est s Inferno bilatérales à du lobe médian qui se situe dans la ligne médiane.
6. Avant de dessiner le foie hors de l’espace péritonéal, placez un morceau sec de gaze à l’aspect inférieur de l’incision.
   Remarque : La gaze fournira une surface adhérente pour poser le foie pour l’empêcher de se rétracter dans l’abdomen.
7. Utilisez la pince atraumatique ou un morceau de gaze humide des doigts, soigneusement tirer le lobe gauche du foie hors de l’abdomen par l’incision, éten sur la gaze sèche placée précédemment. Voir la Figure 7.
   Attention : La capsule du foie est sensible et peut facilement de rupture. Il est essentiel d’être doux, lors de la manipulation de cet organe pour empêcher saigner capsulaire, contusions hépatiques et/ou hémopéritoine éventuelle.
   Remarque : Généralement, le foie va se déclarer visuellement en entrant dans l’espace péritonéal ; Toutefois, si l’estomac du lapin est distendu, le foie peut être poussé parotidien hors de la vue. Si c’est le cas, soulevez doucement la paroi abdominale à l’aide d’une sonde émoussée. Dans ce scénario, le foie a tendance à adhérer à l’aspect ventral du diaphragme en raison de la tension superficielle si soigneusement séparé du foie à l’aide d’une sonde émoussée et il doit se détacher. Utilisez ensuite pince atraumatique pour dégager le foie.
8. À ce stade, préparer le tissu tumoral pour l’implantation et placer un morceau de gaze humide sur le foie pour le protéger.
9. Sélectionnez une pièce de³ mm de 1\u20122 de tissu tumoral qui a été généré au cours de l’étape 2.6 pour une implantation au niveau du foie. Voir la Figure 8.
10. À l’aide d’une lame #11, percer le tissu hépatique à un angle de 45°, faisant un gousset de 0,5 cm, prenant soin de ne pas pour pénétrer l’aspect dorsal de la capsule du foie. Laissez la lame en place après la ponction. Voir la Figure 9.
11. Soulevez délicatement la lame en direction ventrale pour créer une petite poche dans le lit du foie. Prenez le morceau de la tumeur avec une pincette, placez le morceau de la tumeur dans cette poche et puis retirez la lame.
    Remarque : La lame peut être enlevée avant d’insérer le morceau de la tumeur, cependant, le foie va saigner et cela peut obscurcir le site de ponction, rendant difficile à identifier.
    Attention : Veillez à minimiser le contact de la tumeur avec toutes autres structures afin d’éviter l’ensemencement tumorale involontaire. Cela peut aussi être évitée en mettant de côté tous les outils utilisés pour aider à l’implantation par la suite.
12. À ce stade, placez un morceau d’agent hémostatique, comme le gel mousse, au-dessus de la poche de la tumeur pour promouvoir l’hémostase et afin d’éviter l’éjection de la pièce tumorale.
13. Retourner le foie à l’abdomen, une fois que l’hémostase est confirmée.
14. Proche de la paroi abdominale avec 3-0 le polydioxanone suture sur une aiguille conique à l’aide d’un simple continu piquer et fermer la peau avec 4-0 polyglactin 910 des sutures sur une aiguille de découpage avec point subcuticulaire continu.
    Attention : Lors de la fermeture de la paroi abdominale, veiller à ne pas endommager l’épiploon ou autres structures intestinales dans un jet de suture.
    Remarque : Bien que cette tumeur prendra au moins 2 semaines à être définitivement radiographiquement identifiable, il atteint une taille de 1.5\u20122 cm de diamètre à 3 semaines de croissance. Veillez à ne pas permettre à la tumeur hépatique de croître depuis 3.5\u20124 semaines car la tumeur fera un exophytiques masse et agressivement réparties localement.

4. VX2 Tumeur préparation de la solution

1. Placez une passoire de 40 µm dans la bouche d’un tube de 50 mL propylène conique. À l’aide de la tumeur de l’étape 2.7, utilisez #15-lame pour gratter la surface de la tumeur pour collecter tumeur viable et placer ces raclures dans la crépine.
2. Laver les raclures de tumeur viable à travers une passoire à l’aide de DMEM et puis centrifuger le tube de propylène à 1600 tr/min pendant 8 min.
3. Après que la centrifugeuse est terminée, retirez le surnageant et jetez-le. Ajoutez ensuite la méthylcellulose au bloc cellulaire reste dans un rapport volumétrique de 1:1.
4. Injecter un lapin de donateur membre postérieur après les étapes 1.3\u20121.4 de cette suspension. Placez la suspension reste en aliquotes de 1 mL dans des tubes cryogéniques et congelez-les dans l’azote liquide pour une utilisation ultérieure.

5. angiographique utilisation du VX2 tumeur du foie

1. Préparer le lapin comme indiqué au point 3.1.
2. Palpation de la gouttière fémorale à l’aine. Lorsque la rainure a été identifiée, faire une incision linéaire de 2\u20123 cm le long de la rainure. Voir la Figure 10.
3. Par dissection, localiser et isoler le bundle fémoral contenant la veine fémorale, artère et nerf. Voir la Figure 11.
4. Utilisez encore une fois, par dissection par clivage de séparer du reste des structures dans le bundle de l’artère fémorale et d’isoler l’artère au sommet d’un manche de bistouri Swann-Morton. Voir la Figure 12.
5. Avec un kit 3-Français introducteur, utiliser la technique de Seldinger pour accéder avec une aiguille. Insérez un fil-guide et retirer l’aiguille afin de faire progresser la gaine 3-Français dans le vaisseau. Voir la Figure 13.
   Attention : Évitez d’utiliser une force excessive pour faire progresser la gaine 3-Français, car cela pourrait provoquer dans la coupe transversale de l’artère fémorale.
6. Sous guidage radioscopique et en utilisant un cathéter et guidewire iohexol agent de contraste, sélectionnez pour le tronc coeliaque — généralement situé au niveau T12 — et ensuite faire progresser le cathéter dans l’artère hépatique gauche via la commune hépatique et bonne hépatique.
7. À ce stade, administrer l’agent de choix dans le cathéter. Une fois que l’agent est administré, retirer le cathéter.
8. À l’aide de suture de soie de 3-0, ligaturer l’artère fémorale proximale et distale au point d’insertion de la gaine. N’oubliez pas de serrer le noeud proximal de la gaine qu’il soit retiré pour prévenir les saignements.
9. Refermer l’incision de l’aine avec 4-0 polyglactin 910 des sutures sur une aiguille de découpage à l’aide d’un point de subcuticulaire.
10. Maintenir la récupération post-opératoire soins et moniteur animale standard. Effectuer l’euthanasie et l’autopsie au besoin selon les techniques habituelles.

Résultats

Lorsque vous regardez la Figure 1, il est clair que le quadriceps du lapin est hypertrophiée. En outre, plusieurs petits nodules discrets, généralement mise en corrélation avec la croissance de la tumeur par l’intermédiaire de l’aponévrose, sont visibles. À la palpation, la branche injectée doit apparaître que la branche non injectées. Si un chercheur requiert une assurance plus définitive de la présence de tumeur, l’échographie permet d’...

Discussion

La première étape critique dans la méthodologie de tumeur VX2 est propagation réussie d’une tumeur à la patte d’un lapin de donateurs. Voir le premier paragraphe dans la section « Résultats représentant » pour plus d’informations au sujet de cette étape.

La prochaine étape critique est de s’assurer que la capsule de tumeur viable est correctement identifiée. Non seulement cela sera nécessaire pour la préparation de la solution tumeur, mais il est également important de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
MethoCult (Methycellulose)	Stemcell Technologies	M3134
VX2 Cell Line	NCI	VX-2
5 mL Syringe	BD	309646
16 G Needle	BD	305197
22 G Needle	BD	305155
Hair Clippers	Wahl	41870-0438
Foam Insulated Box	Mr. Box Online	10 x 10 x 4
Acepromazine	Henry Schein	003845
Buprenorphine	Par	42023-179-05
Meloxicam	Henry Schein	049755
Alcohol Pads	Covidien	5033
Ketamine	Henry Schein	056344
Xylazine	Akorn	59399-110-20
Pentobarbital (Fatal-Plus)	Vortech	9373
Sterile Petri Dish	Thermo Fisher	172931
DMEM	Gibco	11965092
Saline	Baxter	2F7124
15-Blade	Steris	02-050-015
Scalpel Handle x 2	Steris	22-2381
Curved Hemostat	WPI	501288
Atraumatic Forceps	Sklar	52-5077
Gauze	Medline	NON21430LF
11-Blade	Steris	02-050-011
Surgicel	Ethicon	1951
3-0 PDS / Taper	Ethicon	Z305H
4 - 0 Vicryl / Cutting	Ethicon	J392H
40 μm strainer	BD	352340
50 mL conical tube	Thermo Fisher	339652
plastic pipette	Thomas Scientific	HS206371B
Centrifuge	Sorvall	75004240
1.40 mL Tubes (Internal Thread)	Micronic	MP32131-Z20
3-F VSI Micro-HV Introducer Kit	Vascular Solutions	Custom Order (P15180391)
.018 45° angle glidewire	Terumo	RG*GA1818SA
Direxion bern-shape microcatheter	Boston Scientific	M001195230
Omnipaque	GE	Y510