Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الإنزيم ATP قياس بسيط ويعيش/الميت تلطيخ الأسلوب استخدمت لتحديد ووضع تصور لبقاء النيسرية البنية بعد العلاج مع سيفترياكسون. هذا البروتوكول يمكن أن تمتد إلى دراسة آثار مضادات الميكروبات أي المضادات الحيوية ويمكن استخدامها لتعريف الحد الأدنى المثبطة تركيز المضادات الحيوية في الأغشية الحيوية البكتيرية.

Abstract

ظهور مقاومة للمضادات الحيوية النيسرية البنية (GC) تهديدا لصحة في جميع أنحاء العالم ويسلط الضوء على الحاجة إلى تحديد الأفراد الذين يمتنعون عن العلاج. تسبب هذه البكتيريا سلبية الغرام السيلان حصرا في البشر. خلال العدوى، أنها قادرة على مجاميع النموذج و/أو الأغشية الحيوية. اختبار تركيز الحد الأدنى المثبطة (MIC) يستخدم لتحديد قابلية للمضادات الحيوية وتحديد العلاج المناسب. ومع ذلك، إليه المجراة في استئصال وعلاقتها بالنتائج المختبرية غير معروفة. وقد وضعت أسلوب الذي يدرس كيفية تجميع GC يؤثر على قابلية المضادات الحيوية ويبين العلاقة بين المساحة الإجمالية وقابلية المضادات الحيوية. عندما GC إجمالاً، فأكثر مقاومة للمضادات الحيوية من القتل، مع البكتيريا في الوسط الباقين على قيد الحياة سيفترياكسون معاملة أفضل من تلك الموجودة في المحيط. وتشير البيانات إلى أن تجميع البنية أ. يمكن أن تقلل من قابليتها سيفترياكسون، الذي ينعكس في عدم استخدام أساليب أجار القياسية المستندة إلى لوحة هيئة التصنيع العسكري. تسمح الطريقة المستخدمة في هذه الدراسة الباحثين لاختبار قابلية البكتيرية في ظل الظروف ذات الصلة سريرياً.

Introduction

مرض السيلان مشترك تنتقل العدوى (STI)1. النيسرية البنية (GC)، بكتيريا سلبية الغرام ديبلوكوككال، هو المسبّب لهذا المرض. يمكن أن ينتج أعراض العدوى التناسلية الألم أثناء التبول والأم الأعضاء التناسلية المعمم واحليلي التفريغ. العدوى في كثير من الأحيان أعراض2،3،،من45، وهذا يسمح لاستعمار الموسعة. هذه الإصابات غير المعالجة مصدر قلق رئيسيا لصحة، كما لديهم إمكانات لتسهيل انتقال الكائن الحي، وهذا يمكن أن يؤدي إلى مضاعفات مثل مرض التهاب الحوض (PID) ونشر العدوى بالمكورات البنية (DGI)6. مرض السيلان مقاومة للمضادات الحيوية هو أزمة صحية عامة رئيسية وزيادة أعباء الاقتصادية والاجتماعية7. وادي انخفاض قابلية السيفالوسبورينات تغيير نظام العلاج من المضادات الحيوية واحد العلاج المزدوج، الذي يجمع بين الدوكسيسيكلين أو الأزيتروميسين مع سيفترياكسون8. عدم زيادة سيفترياكسون والازيتروميسين9،10، بالاقتران مع أعراض العدوى، ويسلط الضوء على الحاجة إلى فهم حالات فشل معالجة مرض السيلان.

اختبار تركيز الحد الأدنى المثبطة (MIC)، بما في ذلك أجار تمييع والقرص الاختبارات نشرها، قد استخدمت كمعيار اختبار طبي لتحديد المقاومة للمضادات الحيوية. بيد أنه من غير الواضح إذا كان اختبار هيئة التصنيع العسكري ويعكس البكتيرية المقاومة للمضادات الحيوية المجراة. تكوين الأغشية الحيوية البكتيرية يسهم في بقاء البكتيريا حضور جراثيم تركيزات المضادات الحيوية: اختبار هيئة التصنيع العسكري غير قادر على الكشف عن هذا الأثر11. لأنه يمكن أن تشكل GC الأغشية الحيوية على الأسطح المخاطية12، نحن افترض أن المضادات الحيوية حساسية ضمن المجاميع ستكون مختلفة عن التي ينظر إليها في GC الفردية. بالإضافة إلى ذلك، وقد أظهرت الدراسات أن المرحلة ثلاث جزيئات السطح المتغير، بيلي، المرتبطة بالتعتيم البروتين (أوبا) وليبوليجوساكتشاريديس (لوس)، التي تنظم التفاعلات بين البكتيريا، يؤدي إلى مجاميع مختلفة الحجم13، 14 , 15-لم تنظر بمساهمة من هذه المكونات إلى مقاومة المضادات الحيوية نظراً لعدم وجود الأساليب المناسبة.

حاليا، هناك عدة طرق لقياس القضاء على بيوفيلم. الأسلوب الكمي الأكثر استخداماً بقياس التغيرات في الكتلة الحيوية باستخدام الكريستال البنفسجي تلطيخ16. ومع ذلك، يتطلب الأسلوب التلاعب التجريبية الهامة، التي يمكن أن تولد يحتمل أن تكون الأخطاء في تكرار تجربة17. يعيش الميت المصبوغة الطريقة المستخدمة هنا يسمح التصور البكتيريا الحية والميتة وتوزيعها داخل بيوفيلم. ومع ذلك، يمكن أن تشكل هيكل بيوفيلم كحاجز مادي يقلل من اختراق الصبغة. ولذلك، لتحديد البكتيريا يعيش الميت ضمن مجموعة، تلطيخ يقتصر على الأغشية الحيوية الصغيرة أو السلائف-ميكروكولونيس أو المجموعات. الأساليب الأخرى، بما في ذلك أجار القرص وتمييع نشر الاختبارات، ليست قادرة على قياس آثار التجميع. دراسة قابلية GC داخل التجميع بعد التعرض للمضادات الحيوية، طريقة مثالية تحتاج إلى أن يكون كل تحليل كمي التي يمكن قياس تعيش البكتيريا وتصور توزيعها.

يجمع بين الإجراء الموضح هنا قياس استخدام ATP والعيش/ميت تلطيخ الاعتداء على الكمية وبصريا دراسة قابلية GC ضمن المجاميع حضور المضادات الحيوية.

Protocol

1-العام الحفاظ على سلالات GC

  1. متتالية السلالات البنية أ. أجار جك مع 1% كيلوغ يكمل18 (الجدول 1، الجدول 2) من الأرصدة المجمدة واحتضان 37 درجة مئوية مع 5% CO2 ل 16-18 h. MS11 استخدام التعبير عن أوبا متغير المرحلة (MS11Opa +)، لا يوجد قانون التلوث النفطي (MS11ΔOpa)، أو لوس مبتوراً (MS11ΔLgtE).
  2. بعناية اختيار بيلي السلبية (مستعمرة دون حافة الظلام) أو إيجابية (مستعمرة مع حافة الظلام) المستعمرات من كل سلالة استناداً إلى مستعمرة مورفولوجيا19 باستخدام مجهر تشريح الخفيفة والانتصارات على صفيحة جك جديدة.
  3. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لح 16-18 قبل الاستخدام.

2-إمكانية القياس الكمي للتجميعات GC

  1. جمع GC استخدام قضيب عقيمة. وتستكمل مسحه GC من اللوحة وتعليق إعادة GC في مرق المعالجون مسبقاً (GCP، الجدول 3) مع ناكو 4.2%3 و 1% كيلوغ حلول18. استخدام كانت في طول جه 650 نانومتر (OD650 1 = ~ 1 × 109 زيمبابوي/mL) لتحديد تركيز البكتيريا مع وقف التنفيذ.
  2. ضبط تركيز GC إلى ~ 1 × 108 زيمبابوي/مل.
  3. إضافة ميليلتر 99 المعدل GC تعليق في آبار لصفيحة 96-جيدا.
  4. احتضان لوحة ح 6 في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 للسماح للبكتيريا للتجميع.
  5. أضف 1 ميليلتر من المسلسل سيفترياكسون المخفف (1000، 100، 50، 25، 12.5، 6.2، 3.1، 1.5، 0.8، 0.4، 0.2 ميكروغرام/مل) في كل بئر. ترك بعض الآبار دون علاج لتكون بمثابة عناصر التحكم.
  6. احتضان اللوحة عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
  7. Sonicate تعليق 3 مرات في كل بئر ل 5 s في 144 ث و 20 كيلوهرتز.
  8. إضافة 100 ميليلتر من استخدام ATP المتوفرة تجارياً توهج الكاشف في كل بئر، "الماصة؛" أعلى-أسفل 3 مرات، واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
  9. نقل 150 ميليلتر من خليط من كل بئر في بئر جديدة في ميكروسكوبية أسود 96-جيدا وتجنب إدخال فقاعات بعناية.
  10. قياس امتصاص لكل بئر في 560 نانومتر باستخدام قارئ لوحة.
  11. حساب معدل البقاء على قيد الحياة بالنسبة للقراءة التي تم الحصول عليها بعد العلاج سيفترياكسون التسلسلي للقراءة من الآبار غير المعالجة.

3-الأسفار التحليل المجهري لايف/القتلى من المجاميع GC

  1. جمع GC استخدام قضيب عقيمة. ويكمل كيلوغ GC مسحه من اللوحة وتعليق إعادة GC في حرارة قبل GCP وسائل الإعلام بالإضافة إلى 1%.
  2. تحديد العدد من البكتيريا التي كانت في طول جه 650 نانومتر وضبط تركيز GC إلى ~ 1 × 107 زيمبابوي/مل.
  3. إضافة ميليلتر 198 تعليق GC إلى في الدوائر 8-بئر ساترة--السفلي.
  4. احتضان غرفة ح 6 في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 للسماح بتكوين التجميع.
  5. إضافة 2 ميليلتر من سيفترياكسون (100 ميكروغرام/مل أو تخفيف المختلفة) في كل بئر داخل كل شرط التراكم. احتضانها للوقت المطلوب في 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
  6. إضافة ميليلتر 0.6 يعيش الميت المصبوغة حل خليط في كل بئر واحتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
  7. الحصول على الصور ض سلسلة باستخدام مجهر [كنفوكل] (يمكن استخدامها مجهر ما يعادلها).
  8. تحليل الصور استخدام برنامج إيماجيج لقياس حجم المجاميع GC ونسبة كثافة الفلورية (منطقة معلومات الطيران) تلطيخ العيش للموتى في كل تجميع.

4. تحليل الصورة

  1. تقدير حجم المجاميع البكتيرية.
    1. فتح إيماجيج وفتح صورة عن طريق سحب ملف صورة raw إلى شريط القوائم إيماجيج.
    2. انقر فوق أسطر يدوي في شريط القوائم إيماجيج ودائرة المنطقة لتجميع كل في الصورة.
    3. انقر فوق تحليل | قياس في شريط القوائم إيماجيج.
    4. الحصول على الرقم الموجود في نافذة جديدة تحت العمود المجال .
  2. التحديد الكمي لنسبة العيش للميت من المجموعات
    1. فتح إيماجيج وفتح صورة عن طريق سحب ملف صورة raw إلى شريط القوائم إيماجيج.
    2. انقر فوق تحليل | تعيين قياسات في شريط القوائم إيماجيج.
    3. فحص كثافة المتكاملة في الإطار المنبثق، ثم انقر فوق موافق.
    4. انقر فوق الصورة | لون | القنوات أداة في شريط القوائم وحدد اللون.
    5. تحقق القناة 1 الأسفار للبكتيريا الحية تلطيخ.
    6. انقر فوق أسطر يدوي في شريط القوائم إيماجيج ودائرة المنطقة لكل تجميع.
    7. انقر فوق تحليل | قياس في شريط القوائم إيماجيج.
    8. الحصول على عدد تحت العمود إينتدين .
    9. تحقق القناة 2 الأسفار لتلطيخ البكتيرية قتيلا. كرر الخطوات 4.2.6-4.2.8.
    10. الحصول على نسبة العيش للموتى بقسمة عدد من الخطوة 4.2.8 بعدد من الخطوة 4.2.9.
  3. التحليل الإحصائي
    1. افتح "المنشور جرافباد" وأدخل الأرقام التي تم الحصول عليها من إيماجيج إلى العمود المطلوب.
    2. انقر فوق تحليل وتحديد الاختبارات تي تحت العمود التحليلات.
    3. تحقق من العمود المطلوب للمقارنة، ثم انقر فوق موافق.
    4. الحصول على قيمة P تحت إطار التحليل .
    5. حدد الانحدار الخطي تحت تحليلات س وص من الخطوة 4.3.3
    6. الحصول على ساحة البحث والتطوير و قيمة P ضمن إطار التحليل.

النتائج

واستخدمت طريقتين: فحص استخدام ATP ومقايسة المصبوغة العيش/قتيلا. النتائج يمكن أما مجتمعة أو منفردة المستخدمة لبحث بقاء البكتيرية ضمن المجاميع بعد العلاج بالمضادات الحيوية. لقد ثبت الفحص استخدام ATP لقياس البكتيريا قادرة على البقاء بدقة في المذهبة س. الأغشية الحيوية

Discussion

يمكن أن تشكل البكتيريا الأغشية الحيوية أثناء الإصابة بجسم الإنسان. اختبار هيئة التصنيع العسكري التقليدي قد لا تعكس تركيز اللازمة للقضاء على البكتيريا في بيوفيلم. لاختبار تأثيرات مضادات الميكروبات في بيوفيلم، يمكن أن تكون أساليب تستند بيوفيلم الكتلة الأحيائية، فضلا عن تصفيح كفوس خاطئة ب...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل منحة من "المعهد الوطني للصحة" D.C.S. وكان AI123340. لام-C.W.، وشوبان، ميلان، وتم دعم E.N. في جزء/المشاركة في برنامج "السنة الأولى الابتكار البحوث تجربة" الممول من جامعة ميريلاند. وكان الممولين أي دور في قرار دراسة التصميم وجمع البيانات، والتحليل، ونشر، أو إعداد المخطوطة. ونعترف "كبمج الخفة التصوير الأساسية" لجميع تجارب الفحص المجهري.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100x Kellogg's supplement
AgarUnited States BiologicalA0930
BacTiter Assay PromegaG8232
CeftriaxoneTCIC2226
Difco GC medium base BD228950
Ferric nitrate, nonahydrate Sigma-Aldrich254223-10G
GlucoseThermo Fisher ScientificBP350-1
L-glutamine Crystalline PowderFisher ScientificBP379-100
BacLight live/dead stainingInvitrogenL7012
MS11 Neisseria gonorrhoeae strainkindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)Fisher ScientificP290-500
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)Fisher ScientificBP329-1
Proteose Peptone BD Biosciences211693
Sodium chloride (NaCl)Fisher ScientificS671-10
Soluble StarchSigma-AldrichS9765
Thiamine pyrophosphateSigma-AldrichC8754-5G
Equipment
Petri DishesVWR25384-302
8-well coverslip-bottom chamber Thermo Fisher Scientific155411
96-well tissue culture plates Corning, Falcon3370
Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood)Nuaire32776
CO2 IncubatorFisher Scientific Model 3530
Confocal microscope equipped with live imaging chamberLeicaSP5X
Corning  96 Well Black Polystyrene Microplate Corning3904
Glomax Illuminator PromegaE6521
Pipette tips (0.1-10 µL)Thermo Fisher Scientific02-717-133
Pipette tips (1000 µL)VWR83007-382
Pipette tips (200 µL)VWR53509-007
Spectrophotometer Ultrospec 2000 UVPharmacia Biotech80-2106-00
Sterile 15 ml conical tubesVWR21008-216
Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL)Sorenson BioScience16070
Sterile polyester-tipped applicatorsFisher Scientific23-400-122
SonicatorKontesEquivelent to 9110001

References

  1. den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study. BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).
  2. Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents. The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).
  3. Hananta, I. P., et al. Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia. Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).
  4. Chlamydia, W. H. O. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections. World Health Organisation. , (2011).
  5. Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. Diagnosis and management of gonococcal infections. American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).
  6. Alirol, E., et al. Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines. PLOS Medicine. 14 (7), (2017).
  7. Workowski, K. A., Bolan, G. A. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015. MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).
  8. Lahra, M. M., et al. Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).
  9. Wi, T., et al. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action. PLOS Medicine. 14 (7), 1002344 (2017).
  10. Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents. Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).
  11. Greiner, L. L., et al. Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).
  12. Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  13. Stein, D. C., et al. Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells. PLoS One. 10 (8), 0134342 (2015).
  14. LeVan, A., et al. Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).
  15. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. , (2005).
  16. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  17. White, L. A., Kellogg, D. S. Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method. Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).
  18. Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns. Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).
  19. Herten, M., et al. Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces. Frontiers in Microbiology. 8, 2333 (2017).
  20. Gracia, E., et al. In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification. Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).
  21. Webb, J. S., et al. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).
  22. Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. Journal of visualized experiments. (47), (2011).
  23. Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility. Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).
  24. Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).
  25. Hall-Stoodley, L., et al. Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

144

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved