Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Basit bir ATP ölçme tahlil ve canlı/ölü boyama yöntemi ölçmek ve Neisseria gonorrhoeae hayatta kalma ceftriaxone ile tedaviden sonra görselleştirmek için kullanılmıştır. Bu iletişim kuralı herhangi bir antibiyotik antimikrobiyal etkilerini incelemek için genişletilmiş ve minimum inhibitör konsantrasyonu antibiyotik bakteriyel biyofilmler tanımlamak için kullanılır.

Özet

Antibiyotik dirençli Neisseria gonorrhoeae (GC) ortaya çıkması bir dünya çapında sağlık tehdidi ve tedavi başarısız bireyler belirlemek gerektiğini vurgulamaktadır. Bu gram-negatif bakteri bel soğukluğu sadece insanlarda neden olur. Enfeksiyon sırasında form toplamları ve/veya biyofilmler yapabiliyor. Minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) testi için antibiyotik duyarlılık belirlemek için ve uygun tedavi tanımlamak için kullanılır. Ancak, içinde vivo ortadan kaldırılması ve laboratuvar sonuçları ile ilişkisi mekanizmasının bilinen değil. Nasıl GC toplama antibiyotik duyarlılık etkiler ve toplam boyutu ve antibiyotik duyarlılık arasındaki ilişkiyi gösterir inceliyor bir yöntem geliştirildi. GC toplamak, antibiyotik öldürmeye daha dayanıklı oldukları zaman, bakteri merkezi ile ceftriaxone tedavi daha iyi daha fazla çevre olan hayatta kalmak için. Verileri N. gonorrhoeae toplama standart agar plaka tabanlı mikrofon yöntemleri kullanarak yansıtılmamış ceftriaxone onun duyarlılık azaltabilir gösterir. Bu çalışmada kullanılan yöntem araştırmacılar bakteri duyarlılık klinik koşullarda test etmek izin verir.

Giriş

Bel soğukluğu ortak bir cinsel enfeksiyon (STI)1iletilen olduğunu. Neisseria gonorrhoeae (GC), gram-negatif bir diplococcal bakteri bu hastalık hastalığının olduğunu. Genital enfeksiyonu belirtileri ağrı idrara çıkma, genelleştirilmiş genital ağrı ve üretral akıntı sırasında neden olabilir. Enfeksiyon genellikle asemptomatik2,3,4,5ve bu genişletilmiş kolonizasyon için sağlar. Bunlar tedavi edilmezse hastalık iletim organizmanın kolaylaştırmak için potansiyel var ve bu Pelvik inflamatuar hastalığa (PID) gibi komplikasyonlara yol açabilir ve dissemine Gonokokal Enfeksiyon (DGI)6gibi büyük sağlık kaygı vardır. Antibiyotik dirençli bel soğukluğu önemli halk sağlığı kriz ve artan bir sosyo-ekonomik yük7var. Sefalosporinler düşük duyarlılık tedavi rejimi değişikliğinden tek bir antibiyotik azitromisin veya doksisiklin ceftriaxone8ile birleştiren çift terapisi, sonuçlandı. Ceftriaxone ve Azitromisin9,10, asemptomatik enfeksiyondan ile birlikte artan başarısızlık bel soğukluğu tedavisi hataları anlama gereğini vurgulamaktadır.

Agar seyreltme ve disk difüzyon testleri, dahil olmak üzere minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) testi bir antibiyotik direnç tanımlamak için standart tıbbi test olarak kullanılmıştır. Yine de, mikrofon test bakteriyel antibiyotik direnci içinde vivo yansıtır Eğer belli değildir. Bakterilerin antibiyotik bakteri yok edici konsantrasyonları huzurunda yaşama bakteriyel biyofilmler oluşumuna katkıda: mikrofon test bu etkisi11algılayamadı. GC biyofilmler mukozal yüzeyler12tarihinde oluşturabilir çünkü biz o antibiyotik broşürüne duyarlılık toplamları içinde bireysel GC içinde görülen farklı olurdu. Ayrıca, çalışmalar üç değişken yüzey molekülleri, Pili, opaklık ilişkili protein (Opa) faz ve arası bakteri etkileşimleri düzenleyen, lipooligosaccharides (LOS), farklı büyüklükte toplamları13için, yol göstermiştir 14 , 15. katkı antibiyotik direnci için bu bileşenlerin uygun yöntemleri eksikliği nedeniyle muayene değil.

Şu anda biyofilm ortadan kaldırılması ölçmek için çeşitli yöntemler vardır. En çok kullanılan nicel biyokütle kristal16boyama violet kullanarak değişiklikleri ölçerek yöntemidir. Ancak, yöntem potansiyel olarak deney tekrarlar17' hatalara neden olabilir önemli deneysel manipülasyon gerektirir. Burada kullanılan canlı/ölü boyama yöntemi canlı ve ölü bakteriler ve biyofilm içinde dağılımını görselleştirme sağlar. Ancak, biyofilm yapısı boya penetrasyon azaltır fiziksel bir engel olarak oluşturabilir. Bu nedenle, bir grup içindeki canlı/ölü bakteriler ölçmek için boyama küçük biyofilmler veya onun öncü-microcolonies veya toplamalardan sınırlıdır. Agar seyreltme ve disk difüzyon testleri de dahil olmak üzere diğer yöntemleri toplama etkilerini ölçmek mümkün değildir. GC duyarlılık toplama sonra antibiyotik pozlama, ideal bir yöntem içinde her ikisi için ölçebilen bir nicel tahlil bakteriler yaşamak ve onların dağılımını görselleştirmenizi incelemek için.

Burada açıklanan yordamı bir ATP-kullanımı ölçüm birleştirir ve Canlı/Boyama ölü bir nicelik tahlil ve GC duyarlılık toplamları antibiyotik varlığında içinde görsel olarak inceleyin.

Protokol

1. genel bakım GC suşları

  1. N. gonorrhoeae suşları çizgi GCK agar % 1 Kellogg18 (Tablo 1, tablo 2) derin dondurucu stokları takviyeleri ve 37 ° C % 5 CO2 16-18 h. kullanım MS11 faz-değişken Opa (MS11Opa +), hiçbir Opa (MS11ΔOpa), ifade için kuluçkaya veya kesilmiş LOS (MS11ΔLgtE).
  2. Dikkatlice pili negatif (koloni karanlık kenarı olmayan) veya pozitif (koloni karanlık kenarı ile) kolonilerin koloni morfolojisi19 bir diseksiyon ışık mikroskobu ve yeni GCK plaka üzerine çizgi kullanarak temel her zorlanma seç.
  3. 16-18 h kullanmadan önce için % 5 CO2 ile 37 ° C'de kuluçkaya.

2. canlılığı miktar GC toplamalardan

  1. Steril bir aplikatör kullanarak GC toplamak. Çubukla GC plaka ve yeniden askıya GC önceden ısıtılmış suyu (GCP, Tablo 3) içinde % 1 ile % 4.2 NaHCO3 Kellogg çözümleri18takıma. Spectrophotometry dalga boyu 650 kullanın nm (1 OD650 = ~ 1 x 109 CFU/mL) askıya alınan bakteri konsantrasyonu belirlemek için.
  2. GC konsantrasyon ~ 1 10 x ayarlamak8 CFU/mL.
  3. 99 µL ayarlanan GC süspansiyon, bir 96-şey plaka kuyu ekleyin.
  4. Bakteri izin vermek için % 5 CO2 37 ° c 6 h plaka kuluçkaya toplamak için.
  5. Seri seyreltilmiş ceftriaxone 1 µL ekleyin (1000, 100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0.8, 0,4, 0.2 µg/mL) her kuyuya. Denetimleri hizmet etmek için tedavi edilmezse bazı kuyular bırakın.
  6. %5 CO237 ° C'de 24 h plaka kuluçkaya.
  7. Süspansiyon 3 kez her şey 5 144 W, s ve 20 kHz için solüsyon içeren temizleyicide.
  8. Piyasada bulunan ATP kullanımı kızdırma reaktif 100 µL her kuyuya eklemek, pipet yukarı-aşağı için 3 kere ve % 5 CO237 ° C'de 15 dakika kuluçkaya.
  9. Dikkatli 96-şey siyah Mikroplaka yeni bir kuyuya her kuyudan karışımı 150 µL aktarmak ve kabarcıklar tanıtan kaçının.
  10. 560 her kuyuda absorbans ölçmek plaka okuyucu kullanarak nm.
  11. Seri ceftriaxone tedaviden sonra okunurken işlenmemiş kuyulardan elde edilen okuma oranı tarafından sağkalım oranı hesaplar.

3. floresans mikroskobik analizlerin yapıldığı canlı/ölü GC toplamları

  1. Steril bir aplikatör kullanarak GC toplamak. Pamuklu çubuk GC plaka ve yeniden askıya GC önceden ısıtılmış GCP medya artı % 1 Kellogg tamamlar.
  2. Tarafından spectrophotometry bir dalga boyu 650 adlı bakteri sayısını belirlemek nm ve GC konsantrasyon ~ 1 10 x ayarlamak7 CFU/mL.
  3. 8-şey coverslip-alt odasında 198 µL GC süspansiyon ekleyin.
  4. Odası 6 h 37 ° c % 5 CO2 toplama oluşumu izin vermek için kuluçkaya.
  5. Her toplama koşul içinde her kuyuya ceftriaxone (100 µg/mL ya da çeşitli dilutions) 2 µL ekleyin. 37 ° C % 5 CO2ile istediğiniz saatte için kuluçkaya.
  6. Her kuyuya 0.6 µL canlı/ölü boyama çözüm karışımı ekleyin ve %5 CO2ile 37 ° C'de 20 dk için kuluçkaya.
  7. Z-serisi görüntüleri (eşdeğer bir mikroskop kullanılabilir) confocal mikroskop kullanarak elde.
  8. GC toplamları ve canlı ölü her toplam olarak boyama floresan yoğunluğu oranı (FIR) boyutunu ölçümü için ImageJ yazılım kullanarak görüntüleri analiz.

4. görüntü analizi

  1. Bakteriyel toplamları boyutunu tahmin.
    1. ImageJ açın ve ImageJ menü çubuğuna bir raw resim dosyasını sürükleyerek bir resim açın.
    2. Serbest çizgiler ImageJ menü çubuğunu tıklatın ve görüntüdeki her toplama alanı daire.
    3. Tıklayın analiz | Ölçü ImageJ menü çubuğunda.
    4. Alan sütununda yeni bir pencerede numarası edinmek.
  2. Toplamalardan canlı ölü oranı miktar
    1. ImageJ açın ve ImageJ menü çubuğuna bir raw resim dosyasını sürükleyerek bir resim açın.
    2. Tıklayın analiz | Ayarla ölçümleri ImageJ menü çubuğunda.
    3. Açılan pencerede entegre yoğunluğu kontrol edin ve Tamam' ı tıklatın.
    4. Resmi tıklayın | Renk | Kanalları aracı menü çubuğu ve renkseç.
    5. Kanal 1 floresan için boyama canlı bakteri olarak kontrol edin.
    6. ImageJ menü çubuğunda Serbest çizgiler ' i tıklatın ve her toplama alanı daire.
    7. Tıklayın analiz | Ölçü ImageJ menü çubuğunda.
    8. IntDen sütununun altında numarası edinmek.
    9. Kanal 2 ölü bakteriyel boyama için floresans olarak kontrol edin. Adımları 4.2.6-4.2.8 tekrarlayın.
    10. Canlı ölü oranı numarasına adım 4.2.8 numarasına adım 4.2.9 bölerek elde etmek.
  3. İstatistiksel analiz
    1. GraphPad prizma açın ve ImageJ istenen kolona elde numaralarını girin.
    2. Çözümle ' yi tıklatın ve sütun analizlerialtında t testleri seçin.
    3. Karşılaştırma için istenen sütununu kontrol edin ve Tamam' ı tıklatın.
    4. Analiz penceresi altındaki P değeri elde edilir.
    5. XY analizleri altında Doğrusal regresyon 4.3.3 adımından seçin
    6. R-kare ve analiz pencerenin altındaki P-değeri elde edilir.

Sonuçlar

İki yöntem istihdam: bir ATP kullanımı tahlil ve canlı/ölü boyama tahlil. Sonuçları birlikte veya ayrı ayrı toplamları içinde bakteriyel yaşam antibiyotik tedavisinden sonra incelemek için kullanılır. ATP kullanımı tahlil S. aureus biyofilmler20,21doğru canlı bakteri ölçmek için gösterilmiştir. Burada, MS11Opa + Pil + zorlanma GC toplama rolü antibiyotik duyarlılık incelemek için kullanıldı...

Tartışmalar

Bakteri biyofilmler insan vücudu enfeksiyon sırasında oluşabilir. Geleneksel mikrofon test bir biyofilm bakteri ortadan kaldırmak için gerekli toplama yansıtmaz. Bir biyofilm antimicrobials etkileri test etmek için yanı sıra biyofilm biyokütle esaslı CFUs kaplama yöntemleri biyofilm yapı etkisi nedeniyle hatalı olabilir. Örneğin, kaplama yöntem biricik inşaat eğer biyofilm bozulur. Bu nedenle, elde edilen CFU canlı bakteri gerçek sayısından daha düşük olabilir. Görüntülenmesi ölü ve canlı...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüsü teşkilat ve WS AI123340 için bir hibe tarafından desteklenmiştir. L.-CW, JW, A.C., ve E.N. bölümü/Maryland Üniversitesi tarafından finanse edilen "birinci sınıf yenilik & araştırma deneyimi" programına katılmak içinde desteklenen. Fon yayımlamak için çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu. UMD CBMG Imaging Core tüm mikroskobu deneyler için anıyoruz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
100x Kellogg's supplement
AgarUnited States BiologicalA0930
BacTiter Assay PromegaG8232
CeftriaxoneTCIC2226
Difco GC medium base BD228950
Ferric nitrate, nonahydrate Sigma-Aldrich254223-10G
GlucoseThermo Fisher ScientificBP350-1
L-glutamine Crystalline PowderFisher ScientificBP379-100
BacLight live/dead stainingInvitrogenL7012
MS11 Neisseria gonorrhoeae strainkindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)Fisher ScientificP290-500
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)Fisher ScientificBP329-1
Proteose Peptone BD Biosciences211693
Sodium chloride (NaCl)Fisher ScientificS671-10
Soluble StarchSigma-AldrichS9765
Thiamine pyrophosphateSigma-AldrichC8754-5G
Equipment
Petri DishesVWR25384-302
8-well coverslip-bottom chamber Thermo Fisher Scientific155411
96-well tissue culture plates Corning, Falcon3370
Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood)Nuaire32776
CO2 IncubatorFisher Scientific Model 3530
Confocal microscope equipped with live imaging chamberLeicaSP5X
Corning  96 Well Black Polystyrene Microplate Corning3904
Glomax Illuminator PromegaE6521
Pipette tips (0.1-10 µL)Thermo Fisher Scientific02-717-133
Pipette tips (1000 µL)VWR83007-382
Pipette tips (200 µL)VWR53509-007
Spectrophotometer Ultrospec 2000 UVPharmacia Biotech80-2106-00
Sterile 15 ml conical tubesVWR21008-216
Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL)Sorenson BioScience16070
Sterile polyester-tipped applicatorsFisher Scientific23-400-122
SonicatorKontesEquivelent to 9110001

Referanslar

  1. den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study. BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).
  2. Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents. The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).
  3. Hananta, I. P., et al. Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia. Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).
  4. Chlamydia, W. H. O. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections. World Health Organisation. , (2011).
  5. Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. Diagnosis and management of gonococcal infections. American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).
  6. Alirol, E., et al. Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines. PLOS Medicine. 14 (7), (2017).
  7. Workowski, K. A., Bolan, G. A. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015. MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).
  8. Lahra, M. M., et al. Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).
  9. Wi, T., et al. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action. PLOS Medicine. 14 (7), 1002344 (2017).
  10. Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents. Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).
  11. Greiner, L. L., et al. Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).
  12. Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  13. Stein, D. C., et al. Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells. PLoS One. 10 (8), 0134342 (2015).
  14. LeVan, A., et al. Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).
  15. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. , (2005).
  16. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  17. White, L. A., Kellogg, D. S. Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method. Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).
  18. Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns. Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).
  19. Herten, M., et al. Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces. Frontiers in Microbiology. 8, 2333 (2017).
  20. Gracia, E., et al. In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification. Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).
  21. Webb, J. S., et al. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).
  22. Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. Journal of visualized experiments. (47), (2011).
  23. Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility. Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).
  24. Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).
  25. Hall-Stoodley, L., et al. Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve enfeksiyonazalm say 144bel so uklu uantibiyotik direnciduyarl l kbiyofilmtoplamamiktarg rselle tirme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır