Examen quantitatif de la sensibilité aux antibiotiques d’essais commerciaux de Neisseria gonorrhoeae utilisation d’ATP à l’aide de granulats et de Live/Dead coloration

Résumé

Un simple test ATP-instruments de mesure et vivre/morts méthode de coloration ont été utilisés pour quantifier et visualiser les Neisseria gonorrhoeae survie après traitement par ceftriaxone. Ce protocole peut être étendu pour examiner les effets antimicrobiens de n’importe quel antibiotique et peut être utilisé pour définir la concentration minimale inhibitrice d’antibiotiques dans les biofilms bactériens.

Résumé

L’émergence de résistants aux antibiotiques Neisseria gonorrhoeae (GC) est une menace pour la santé dans le monde entier et souligne la nécessité d’identifier les personnes qui ne respectent pas de traitement. Cette bactérie Gram-négative provoque la gonorrhée exclusivement chez l’homme. Au cours de l’infection, il est apte à former des agrégats ou des biofilms. L’essai de la concentration minimale inhibitrice (CMI) est utilisé pour déterminer la susceptibilité aux antibiotiques et de définir un traitement approprié. Toutefois, le mécanisme de l’éradication in vivo et sa relation avec les résultats de laboratoire ne sont pas connus. A développé une méthode qui examine comment l’agrégation GC affecte la sensibilité aux antibiotique et montre la relation entre la taille des granulats et sensibilité aux antibiotique. Lors de l’agrégat de GC, ils sont plus résistants aux antibiotiques mise à mort, avec des bactéries dans le centre survivant ceftriaxone traitement mieux que ceux de la périphérie. Les données indiquent que l’agrégation de N. gonorrhoeae peut réduire sa sensibilité à la ceftriaxone, qui se traduit pas en utilisant les méthodes MIC standard agar axée sur la plaque. La méthode utilisée dans cette étude permettra aux chercheurs de tester la sensibilité bactérienne conditions cliniquement pertinentes.

Introduction

La gonorrhée est qu'une commune transmises sexuellement (MTS)¹. Neisseria gonorrhoeae (GC), une bactérie Gram-négative de diplococcal, est l’agent causal de cette maladie. Symptômes de l’infection génitale peuvent entraîner des douleurs pendant la miction, douleurs génitales généralisée et urétral. L’infection est souvent asymptomatique^2,3,4,5, et cela permet à la longue colonisation. Ces infections non traitées sont un sujet de préoccupation majeur pour la santé, car ils sont susceptibles de faciliter la transmission de l’organisme et cela peut conduire à des complications telles que la maladie inflammatoire pelvienne (MIP) et diffusé l’infection gonococcique (DGI)⁶. La gonorrhée résistante aux antibiotiques est une crise de santé publique majeur et une augmentation de fardeau socio-économique⁷. Traitement régime changement d’un seul antibiotique à la bithérapie, qui combine l’azithromycine ou la doxycycline avec ceftriaxone⁸a entraîné une sensibilité réduite aux céphalosporines. L’échec accru de ceftriaxone et l’azithromycine^9,10, en combinaison avec des infections asymptomatiques, met en évidence la nécessité de comprendre les échecs de traitement de la gonorrhée.

L’essai de la concentration minimale inhibitrice (CMI), y compris les tests de diffusion de dilution et disque agar, a été utilisé comme le test médical standard pour l’identification de la résistance à un antibiotique. Néanmoins, il est difficile de savoir si le critère de la MIC exprime l’antibiorésistance bactérienne in vivo. La formation de biofilms bactériens contribue à la survie de bactéries en présence de concentrations bactéricides d’antibiotique : l’essai de MIC est incapable de détecter cet effet¹¹. Parce que le GC peut former des biofilms sur les surfaces muqueuses¹², nous émettons l’hypothèse de cet antibiotique susceptibilité au sein des agrégats serait différente de celle observée dans les GC. En outre, des études ont montré que trois phase protéine associée à l’opacité de molécules de surface variable, Pili, (Opa) et lipooligosaccharides (LOS), qui régissent les interactions entre bactérie, conduire à différents agrégats de taille^{13, 14 , 15}. la contribution de ces composants à la résistance aux antibiotique n’a pas été examinée faute de méthodes appropriées.

Actuellement, il y a plusieurs méthodes pour mesurer l’élimination du biofilm. La méthode quantitative plus largement utilisée est en mesurant les changements dans la biomasse à l’aide de violet de gentiane¹⁶de coloration. Toutefois, la méthode requiert la manipulation expérimentale importante, qui peut potentiellement générer des erreurs dans l’expérience répétitions¹⁷. La méthode de coloration de vivre/morts utilisée ici permet la visualisation des bactéries vivantes et mortes et leur distribution dans le biofilm. Cependant, la structure des biofilms peut poser comme une barrière physique qui réduit la pénétration de la teinture. Par conséquent, afin de quantifier les bactéries vivent/morts au sein d’un groupe, la coloration est limitée à petits biofilms ou son précurseur-microcolonies ou agrégations. Autres méthodes, y compris les essais de diffusion gélose dilution et disque, ne sont pas en mesure de mesurer les effets d’agrégation. Afin d’examiner la sensibilité GC au sein de l’agrégation après exposition aux antibiotique, une méthode idéale aurait besoin d’avoir les deux un test quantitatif qui permet de mesurer vivent des bactéries et visualiser leur distribution.

La procédure décrite ici combine une mesure de l’utilisation d’ATP et une coloration live/morts de dosage à quantitativement et examiner visuellement la susceptibilité de GC au sein des agrégats en présence d’antibiotiques.

Protocole

1. entretien général des souches de GC

1. Les souches de N. gonorrhoeae -ensemencer sur une gélose GCK avec 1 % Kellogg complète¹⁸ (tableau 1, tableau 2) provenant des stocks du congélateur et incuber à 37 ° C, avec 5 % CO₂ pendant 16 à 18 h. utilisation MS11 exprimant phase variable Opa (MS11Opa +), aucune Opa (MS11ΔOpa), ou a LOS tronqué (MS11ΔLgtE).
2. Prélever soigneusement des pili négatif (colonie sans bordure sombre) ou colonies positives (colonie avec bordure sombre) de chaque souche issu de morphologie de colonie¹⁹ en utilisant un microscope à lumière dissection et ensemencer sur une nouvelle plaque GCK.
3. Incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO₂ pendant 16-18 h avant utilisation.

2. dosage viabilité des agrégations de GC

1. Recueillir des GC à l’aide d’un applicateur stérile. Écouvillon GC de la plaque et remettre en suspension les GC dans le bouillon préchauffé (GCP, tableau 3) additionné de 4,2 % NaHCO₃ et 1 % Kellogg solutions¹⁸. Utiliser la spectrophotométrie à une longueur d’onde de 650 nm (une OD de₆₅₀ 1 = ~ 1 x 109 UFC/mL) afin de déterminer la concentration de bactéries en suspension.
2. Ajuster la concentration du GC à ~ 1 x 10⁸ UFC/mL.
3. Ajouter 99 µL de suspension GC ajustée dans des puits d’une plaque à 96 puits.
4. Incuber la plaque pendant 6 h à 37 ° C, avec 5 % de CO₂ pour permettre les bactéries à s’agréger.
5. Ajouter 1 µL de série ceftriaxone dilué (1000, 100, 50, 25, 12,5, 6.2, 3.1, 1.5, 0,8, 0,4, 0,2 µg/mL) dans chaque puits. Laisser certains puits non traités pour servir en tant que contrôles.
6. Incuber les plaques pendant 24 h à 37 ° C, avec 5 % de CO₂.
7. Laisser agir la suspension 3 fois dans chaque puits de 5 s à 144 W et 20 kHz.
8. Ajouter 100 µL de réactif de lueur d’utilisation ATP disponible commercialement dans chaque puits, pipette haut-bas pour 3 fois et incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO₂pendant 15 minutes.
9. Soigneusement transférer 150 µL du mélange de chaque puits dans un nouveau puits dans une microplaque 96 puits noir et éviter d’introduire des bulles.
10. Mesurer l’absorbance de chaque puits à 560 nm en utilisant le lecteur de plaque.
11. Calculer le taux de survie par le rapport entre la lecture obtenue après traitement série ceftriaxone à la lecture des puits non traitées.

3. analyse microscopique fluorescence du Live/Dead des agrégats de GC

1. Recueillir des GC à l’aide d’un applicateur stérile. Kellogg suppléments écouvillon GC de la plaque et GC resuspendre dans pré chauffé de GCP media plus de 1 %.
2. Déterminer le nombre de bactéries par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 650 nm et ajuster la concentration du GC à ~ 1 x 10⁷ UFC/mL.
3. Ajouter 198 µL de suspension de la GC dans des chambres de 8 puits lamelle-bas.
4. Incuber la chambre pendant 6 h à 37 ° C, avec 5 % de CO₂ pour permettre la formation de l’agrégation.
5. Ajouter 2 µL de ceftriaxone (100 µg/mL ou diverses dilutions) dans chaque puits au sein de chaque état d’agrégation. Incuber pendant le temps désiré à 37 ° C, avec 5 % de CO₂.
6. Ajouter 0,6 µL du mélange de solution coloration live/morts dans chaque puits et incuber pendant 20 min à 37 ° C, avec 5 % de CO₂.
7. Acquisition d’images de série Z à l’aide d’un microscope confocal (un microscope équivalent peut être utilisé).
8. Analyser les images à l’aide de logiciels ImageJ pour la mesure de la taille des agrégats de GC et le ratio d’intensité de fluorescence (FIR) de vivre-à-mort de coloration dans chaque agrégat.

4. analyse de l’image

1. Estimation de la taille des agrégats bactériens.
   1. Ouvrez ImageJ et d’ouvrir l’image en faisant glisser un fichier image raw à la barre de menus de ImageJ.
   2. Cliquez sur Lignes à main levée dans la barre de menus de ImageJ et encercler la zone de chaque agrégation dans l’image.
   3. Cliquez analyser | Mesure dans la barre de menus de ImageJ.
   4. Obtenir le nombre dans une nouvelle fenêtre sous la colonne de la zone .
2. Quantification du ratio de vivre-à-mort d’agrégations
   1. Ouvrez ImageJ et d’ouvrir l’image en faisant glisser un fichier image raw à la barre de menus de ImageJ.
   2. Cliquez analyser | Mesures de la valeur dans la barre de menus de ImageJ.
   3. Vérifier la densité intégrée dans le menu contextuel, puis cliquez sur OK.
   4. Cliquez sur l’Image de | Couleur | Outil de canaux dans la barre de menus et sélectionnez couleurs.
   5. Enregistrer canal 1 comme la fluorescence pour les bactéries vivantes de coloration.
   6. Cliquez sur Lignes à main levée dans la barre de menus de ImageJ et encercler la zone de chaque agrégation.
   7. Cliquez analyser | Mesure dans la barre de menus de ImageJ.
   8. Obtenir le numéro de colonne IntDen .
   9. Contrôle canal 2 comme la fluorescence pour la coloration mort bactérienne. Répétez les étapes 4.2.6-4.2.8.
   10. Obtenir le rapport de vivre-à-mort en divisant le nombre de l’étape 4.2.8 par nombre de l’étape 4.2.9.
3. Analyse statistique
   1. Ouvrez GraphPad Prism et entrer les chiffres obtenus à partir de ImageJ la colonne souhaitée.
   2. Cliquez sur analyser , puis sélectionnez tests t sous les analyses de colonne.
   3. Cochez la colonne souhaitée pour la comparaison et cliquez sur OK.
   4. Obtenir la P-Value au titre de la fenêtre d’analyse .
   5. Sélectionnez la Régression linéaire selon analyses XY de l’étape 4.3.3
   6. Obtenir le R-carré et la P-valeur sous la fenêtre d’analyse.

Résultats

Deux méthodes ont été employées : un essai d’utilisation ATP et un test de coloration de vivre/morts. Les résultats peuvent être combinés ou utilisés individuellement pour examiner la survie bactérienne au sein des agrégats après un traitement antibiotique. Le test d’utilisation ATP a été démontré pour mesurer des bactéries viables avec précision dans le S. aureus biofilms^20,21. Ici, MS11Opa + Lip + ...

Discussion

Les bactéries peuvent former des biofilms au cours de l’infection du corps humain. Traditionnel MIC test peut-être ne pas refléter la concentration nécessaire pour éradiquer les biofilms bactériens. Pour tester les effets antimicrobiens sur un biofilm, méthodes basées sur la biomasse biofilm ainsi qu’UFC de placage peuvent être erronées en raison de l’impact de la structure des biofilms. Par exemple, la méthode de placage ne fonctionne que si le biofilm peut être perturbé. Par conséquent, l’UFC a ob...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Kellogg's supplement
Agar	United States Biological	A0930
BacTiter Assay	Promega	G8232
Ceftriaxone	TCI	C2226
Difco GC medium base	BD	228950
Ferric nitrate, nonahydrate	Sigma-Aldrich	254223-10G
Glucose	Thermo Fisher Scientific	BP350-1
L-glutamine Crystalline Powder	Fisher Scientific	BP379-100
BacLight live/dead staining	Invitrogen	L7012
MS11 Neisseria gonorrhoeae strain			kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	Fisher Scientific	P290-500
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Fisher Scientific	BP329-1
Proteose Peptone	BD Biosciences	211693
Sodium chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S671-10
Soluble Starch	Sigma-Aldrich	S9765
Thiamine pyrophosphate	Sigma-Aldrich	C8754-5G
Equipment
Petri Dishes	VWR	25384-302
8-well coverslip-bottom chamber	Thermo Fisher Scientific	155411
96-well tissue culture plates	Corning, Falcon	3370
Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood)	Nuaire	32776
CO2 Incubator	Fisher Scientific	Model 3530
Confocal microscope equipped with live imaging chamber	Leica	SP5X
Corning  96 Well Black Polystyrene Microplate	Corning	3904
Glomax Illuminator	Promega	E6521
Pipette tips (0.1-10 µL)	Thermo Fisher Scientific	02-717-133
Pipette tips (1000 µL)	VWR	83007-382
Pipette tips (200 µL)	VWR	53509-007
Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV	Pharmacia Biotech	80-2106-00
Sterile 15 ml conical tubes	VWR	21008-216
Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL)	Sorenson BioScience	16070
Sterile polyester-tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-122
Sonicator	Kontes	Equivelent to 9110001